一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌，属于代谢工程领域。本发明从Yarrowia?lipolytica?CLIB122全基因组范围内的6611条蛋白质编码序列中筛选得到4条编码转运蛋白的基因，通过在解脂亚洛酵母（Y.lipolytica）WSH-Z06中分别过量表达这4个基因，获得了细胞外α-酮戊二酸含量提高的重组菌。本发明通过过量表达这类基因增强了细胞将α-酮戊二酸转运至细胞外能力，降低下游分离纯化成本。
【专利说明】—种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌，属于代谢工程领域。
【背景技术】
[0002]α-酮戊二酸作为三羧酸循环(TCA)途径中重要中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，不仅是三羧酸循环中的关键节点，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢；而且是微生物调控碳氮代谢平衡的重要节点，在研究与微生物氮代谢相关的调控机制方面具有重要作用。在工业上，α-酮戊二酸是重要的精细化工和医药工业的中间体，广泛用于合成多种氨基酸、维生素和其它小分子物质，在医药、有机合成、营养强化剂等领域都有着重要的应用前景。
[0003] 由于α-酮戊二酸在微生物胞内代谢中的特殊地位，筛选得到的α-酮戊二酸生产菌株，在高产α-酮戊二酸的同时，在发酵终期仍然会积累大量丙酮酸等代谢副产物。α -酮戊二酸、丙酮酸等短链酮酸是弱电解质，在不同的pH条件下会以分子和阴离子两种状态存在。在发酵过程中，α-酮戊二酸多以解离的阴离子状态存在。由于胞质中积累过量的羧酸阴离子会引起胞质的酸化而导致细胞代谢的中断，阴离子形式存在的α -酮戊二酸只有借助羧酸转运蛋白从胞质中被转运至胞外。而在细胞缺乏碳源时，羧酸转运蛋白又会将胞外的特定蛋白转运到胞内作为碳源使用。类似的，其他中心代谢途径相关的羧酸也存在类似的分泌和吸收过程。因此，细胞膜上特定羧酸转运蛋白的动力学性质及其调控过程，对发酵液和胞内相应羧酸的积累具有决定性作用。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种胞外α -酮戊二酸产量提高的基因工程菌，是在解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06中过量表达编码酮酸转运蛋白的基因。
[0005]所述基因的核苷酸序列如以下(I)或(2 )或(3 )或(4 )所示:
[0006](I)NCBI登录号为YAL10B19470g的核苷酸序列，
[0007](2) NCBI登录号为YAL10C21406g的核苷酸序列，
[0008](3) NCBI登录号为YAL10D20108g的核苷酸序列，
[0009](4) NCBI登录号为YAL10E32901g的核苷酸序列。
[0010]所述基因优选NCBI登录号为YAL10B19470g的核苷酸序列，过量表达该基因的Y.lipolytica WSH-Z06的胞外α -酮戊二酸产量提高、丙酮酸含量下降。
[0011]所述解脂亚洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06从中国典型培养物保藏中心获得，菌种编号为 CCTCC NO:M20714o
[0012]所述基因工程菌的构建方法是:(1)构建表达目的基因所用的含有潮霉素磷酸转移酶为筛选标记的整合型表达载体PO (hph) ；(2)构建重组整合型表达质粒:根据NCBI公开的序列，全化学合成目的酮酸转运蛋白基因的开放阅读框序列，并通过限制内切酶BamHI和Eco RI (或者Not I和Eco RI)同时切割获得的开放阅读框部分和整合型表达载体pO (hph),连接获得重组表达质粒；(3)将所得重组整合型表达质粒转化Y.lipolyticaWSH-Z06:利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶Avr II线性化的重组质粒转化野生型Y.lipolyticaWSH_Z06,验证筛选阳性转化子。
[0013]以所述基因工程菌发酵生产α -酮戊二酸的方法，将所得重组基因工程菌接种至种子培养基中，28°C、200rpmin，培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到3-L发酵罐中，培养温度为28°C、通气量为1.5vvm，搅拌转数为400rpm，培养144-168小时。[0014]与未过量表达酮酸转运蛋白基因的对照菌相比:过量表达YAL10B19470g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10E32901g基因的重组菌株的细胞外α -酮戊二酸含量从 16.6g.L-1 分别上升至 26.7,18.6,24.0 和 19.0g.L-1
[0015]本发明的有益之处:本发明通过筛选，首次获得了 4条能够提高Y.lipolytica细胞外α-酮戊二酸含量的酮酸转运蛋白基因，通过过量表达这类基因能增强细胞将α-酮戊二酸转运至细胞外能力，降低下游分离纯化成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1酮酸诱导培养及酮酸转运蛋白表达水平变化;Α:以丙酮酸或α -酮戊二酸为单一碳源处理野生细胞其细胞内丙酮酸(〇)和α -酮戊二酸(Λ )含量变化；Β:丙酮酸或α-酮戊二酸为单一碳源处理过程中转运蛋白表达水平变化。
[0017]图2酮酸转运蛋白同源性分析
[0018]图3重组Y.lipolytica验证；A:转运蛋白过量表达转化子验证图，通道1:Y.lipolytica Tl,通道 2:Υ.lipolytica T2,通道 3:Υ.lipolytica T3,通道 4:Y.lipolytica T4,通道 5:Y.lipolytica T5,通道 6:Υ.lipolytica T6,通道 7:阴性对照；B:重组菌株中转运蛋白表达水平变化。
[0019]图4重组菌株细胞外酮酸含量
【具体实施方式】
[0020]材料与方法
[0021]YPD培养基(g.L-1):蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖10，固体培养基另加20g.L-1琼脂。转化子筛选时加入潮霉素B至终浓度为400mg.L'
[0022]YPK 培养基(g.L-1): α -酮戊二酸 100，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4) 2S045,用2mol.T1NaOH 调节 pH 至 5.0。
[0023]YPP 培养基(g.L-1):丙酮酸 50，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4)2S045,用2mol.T1NaOH 调节 pH 至 5.0。
[0024]种子培养基(g.I/1):葡萄糖 20，蛋白胨 10，MgSO4.7Η200.5，KH2PO4L O。用稀盐酸调pH至5.5，115°C维持15min灭菌。固体斜面另添加20g.L-1琼脂粉。
[0025]发酵培养基(g.I/1):甘油 100，(NH4)2S043，KH2P043，MgSO4.7Η201.2，NaCl0.5，K2HPO40.1，盐酸硫胺素 2Χ10_7,ρΗ=4.5。115°C，灭菌 15min。接种前加入 121°C灭菌 30min的CaCO3至含量为20g.L-1。[0026]解脂亚洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种编号为 CCTCC NO:M20714o
[0027]酮酸含量测定:将发酵液在12000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释50倍，HPLC检测。细胞内酮酸含量测定:离心收集细胞，用0.9%生理盐水洗涤，用IOmL0.1mol.L-1KH2PO4-K2HPO4, Immol.L_1EDTA,0.01mmol.L-1DTT ρΗ7.5 缓冲液悬浮细胞，加入石英砂研磨5min, 13000 Xg离心IOmin,去除沉淀,取5ml上清液过0.22 μ m滤膜,用于HPLC分析。
[0028]HPLC 条件:Aminex HPX-87H ion exchange column ;流动相:5mmol.L-1 硫酸溶(550 μ L浓硫酸定容到2L)，用0.22 μ m孔径的微滤膜抽滤并脱气；柱温:35°C ;进样量:10 μ L ;流速:0.6mL.mirT1。紫外检测器检测:波长210nm。
[0029]Y.lipolytica转化方法:将在YI3D培养基上新鲜长出的Y.lipolytica WSH-Z06单菌落转接至液体YI3D培养基中，28°C，200rpm，过夜培养。按10%接种量转接至新鲜的液体YI3D培养基中28°C，200rpm培养至OD6tltl=L 2左右，离心收集细胞，于30°C用8mL100mmol *L^1LiAc, 10mmol.L^1DTT, 0.6mol.T 厂1 sorb i to 110mmo I.L^1Tris-HCL, pH=7.5 缓冲液处理 8 X IO8细胞。离心收集细胞，用5mL预冷的Imol.L-1的sorbitol洗漆细胞三次，并用Imol.L—1的sorbitol悬浮细胞至101°细胞.mL'加入Iyg预先线性化的整合型载体至细胞悬浮液中，置于冰上温孕5分钟，将该混合物转移至预冷的0.2cm电转杯中，电击，电击条件为.2.5KV，25 μ F，200 Ω，立即加入ImL预冷的Imol.L^sorbitol,室温静置I小时，将0.2mL电击产物涂布于含有400mg.L-1的潮霉素B的选择平板中，28°C培养48-72小时。
[0030]实施例1酮酸转运蛋白编码基因的筛选及功能保守区域分析。
[0031]该筛选方法为:(I)从Uniprot 数据库中获得 Yarrowia lipolytica CLIB122全基因组范围内的6611条蛋白质编码序列；(2)利用TMHMM软件对这些蛋白质序列进打跨膜蛋白质拓扑学分析和初步筛选，选择预计跨膜螺旋氨基酸残基数大于18和预计跨膜螺旋数大于I的蛋白质编码序列为所有转运蛋白库，共计1104条蛋白质序列；(3)利用SignalP软件从该1104条转运蛋白库中剔除117条被该软件预测为信号肽的蛋白质；(4)利用blast软件以来源于Saccharomyces cerevisiae单酮酸转运蛋白(SACE0K00242g)和Kluyveromyces Iactis 二酮酸转运蛋白(KLLA0F10043g)为参考序列从所有转运蛋白库中挑选得到同源性大于30%的蛋白序列，其中NCBI基因登陆号为YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g 和 YAL10E32901g 基因编码的转运蛋白与S.cerevisiae单酮酸转运蛋白的相似度分别为:37%、40%、41%、42%、43%和39%。这些基因与K.1actis 二酮酸转运蛋白编码基因相似度分别为:46%、53%、49%、52%、51%和.51% ; (5)利用荧光定量PCR的方法在含有丙酮酸或α -酮戊二酸为唯一碳源的培养基(YPP或YPK)培养过程中对筛选得到的六条转运蛋白转运功能验证。
[0032]筛选结果表明:以丙酮酸或α-酮戊二酸为单一碳源处理指数生长期的野生型细胞后，细胞内丙酮酸和α-酮戊二酸含量在处理Ih时达到最大含量，其中，在丙酮酸处理过程中，与在YPD培养中处理的对照菌株相比YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g和YAL10E32901g基因的表达量分别上调2.8倍、上调9.7倍、下调4.4倍、下调5.8倍、下调6.4倍和下调15.9倍；在α -酮戊二酸处理过程中，与对照菌株相比 YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g 和YAL10E32901g基因的表达量分别上调9.4倍、上调4.3倍、下调3.9倍、下调3.7倍、下调
2.5倍和下调1.6倍(图1)。
[0033]通过ClustalX2软件将所述酮酸转运蛋白编码基因筛选方法获得的YAL10B19470g、 YAL10C15488g、 YAL10C21406g、 YAL10D20108g、 YAL10D24607g 和YAL10E32901g编码蛋白与来源于其他10株真菌的21条酮酸转运蛋白比对分析发现，所述27条转运蛋白都包含酮酸转运蛋白特有的NXX [S/T] HX [S/T] QDXXXT氨基酸残基(图2)，这一特征氨基酸残基序列位于 YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g和YAL10E32901g编码蛋白质的第7跨膜区域中。
[0034]实施例2重组Y.lipolytica菌株的构建及鉴定。
[0035]过量表达酮酸转运蛋白基因的方法为:根据质粒PUB4-CRE中的潮霉素磷酸转移酶的基因序列设计引物扩增该hph基因，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增得到的hph基因和pO质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转移酶为筛选标记的整合性表达载体PO (hph)。
[0036]全化学合成基因:YAL10B19470g，YAL10C15488g,YAL10C21406g, YAL10D20108g,YAL10D24607g和YAL10E32901g的开放阅读框，并通过限制内切酶Bam HI和Eco RI同时切割以及获得的 YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10D20108g、YAL10D24607g 和YAL10E32901g编码基因的开放阅读框和带有潮霉素抗性基因的整合型表达载体pO (hph)，通过连接上述开放阅读框和载体，获得pO (hph) -470、pO (hph) -488、pO (hph) -108、p0(hph)-607和p0(hph)-901表达载体，并利用限制内切酶Not I和Eco RI同时切割获得的YAL10C21406g编码基因的开放阅读框和带有潮霉素抗性基因的整合性表达载体pO (hph)，通过连接上述开放阅读框和载体，获得pO (hph) -406。
[0037]利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶Avr 11线性化的pO (hph) -470，pO (hph) -488, pO (hph) -406, pO (hph) -108, pO (hph) -607 和 pO (hph) -901 整合型的表达载体转化野生型Y.lipolyticaffSH-Z06,在含有400mg.l-1潮霉素B的筛选平板上分别得到带有6个整合型表达载体的转化子，以验证引物对VBF/V470、VBF/V488、VBF/V406、VBF/V607、VBF/V108和VBF/V901和转化子基因组为模板进行验证，并将验证正确的过量表达 YAL10D20108g、YAL10C21406g、YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10D24607g 和YAL10E32901g 的转化子分别命名为 Y.lipolytica Tl、Y.lipolytica T2、Y.lipolyticaΤ3、Y.lipolytica Τ4、Y.lipolytica Τ5 和 Y.lipolytica T6。将对照菌株 Y.lipolyticaWSH-Z06与这六个重组菌株分别接种至YPD培养基中，在指数中期收集细胞，在mRNA水平上验证这个6条基因表达水平分别是对照菌株的3.4倍、9.3倍、23.3倍、8.5倍、11.8和10.5倍(图3)。
[0038]实施例3重组Y.lipolytica菌株酮酸转运能力的鉴定。
[0039]将得到的6 个重组的 Y.lipolytica 菌株 Y.lipolytica Tl、Y.lipolytica T2、Y.lipolytica T3、Y.lipolytica Τ4、Υ.lipolytica T5 和 Y.lipolytica T6 接种至接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，温度为28°C，转速200rpmin，培养时间为16-18小时。按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28°C、200rpm条件下培养144-168小时，6个重组的Y.lipolytica菌株和对照菌相比:所述的Y.lipolytica TUY.lipolytica T2、Y.lipolytica T3和Y.lipolytica T6转化子细胞外α -酮戍二酸含量从16.6g.L-1分别上升至 24.0,18.6,26.7 和 19.0g.L' 然而过量表达 YAL10C15488g 和 YAL10D24607g 基因后，所述的Y.lipolytica T4和Y.lipolytica T5细胞外α -酮戊二酸含量没有发生明显改变(图4)。
[0040]Y.lipolytica Tl、Y.lipolytica T2、Y.lipolytica T4、Y.lipolytica T5 和Y.lipolytica T6细胞外丙酮酸含量从7.8g.L-1分别提高至13.5,11.0,10.2,11.0和
11.8g.L^1O所述的Y.lipolytica T3细胞外丙酮酸含量从7.8g.L—1下降至5.3g.L—1 (图4)。
[0041]所述的Y.lipolytica T1>Y.lipolytica T2、Y.lipolytica Τ3、Υ.lipolytica T4、Y.lipolytica Τ5和Y.lipolytica T6细胞外α -酮戊二酸与丙酮酸比例从对照菌株的2.I变化至 1.8,1.7,5.0,1.6,1.5 和 1.6。
[0042]通过本发明中所述的方法筛选的到六条转运蛋白基因其编码的氨基酸序列中都包含决定酮酸转运蛋白功能保守的氨基酸序列，细胞在转运丙酮酸和α-酮戊二酸过程中，这六条转运编码基因具有相同的表达水平变化趋势，暗示丙酮酸和α -酮戊二酸对这六条基因的具有相同的诱导调节功能或者这类蛋白具有相同的转运功能，通过过量表达转运蛋白编码基因后，得到 Y.1ipoIyticaT3、Y.1ipoIyticaT4 和 Y.1ipoIyticaT6细胞外的丙酮酸和α-酮戊二酸含量同时提高，表明YAL10D20108g、YAL10C21406g和YAL10E32901g是多功能转运蛋白能同时转运这两种酮酸；获得的转化子Y.lipolyticaT2和Y.lipolyticaT5其细胞外α -酮戊二酸含量变化不明显，而丙酮酸含量显著提高，表明YAL10C15488g和YAL10D24607g其编码的转运蛋白偏向于转运丙酮酸，而Y.1ipolyticaTl其细胞外α-酮戊二酸含量提高明显，丙酮酸含量下降，因此，YAL10B19470g基因是提高α-酮戊二酸生产过程中优选基因。
[0043]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种胞外α-酮戊二酸产量提高的基因工程菌，其特征在于，是在解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica) WSH-Z06中过量表达编码酮酸转运蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码酮酸转运蛋白的基因的核苷酸序列如以下(I)或(2)或(3)或(4)所示: (1)NCBI登录号为YAL10B19470g的核苷酸序列， (2)NCBI登录号为YAL10C21406g的核苷酸序列， (3)NCBI登录号为YAL10D20108g的核苷酸序列， (4)NCBI登录号为YAL10E32901g的核苷酸序列。
3.构建权利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)构建表达目的基因所用的含有潮霉素磷酸转移酶为筛选标记的整合型表达载体pO(hph)； (2)构建重组表达质粒:根据NCBI公开的序列，全化学合成目的酮酸转运蛋白基因的开放阅读框部分，并通过限制内切酶同时切割获得的基因和整合型表达载体PO (hph)，连接酶切产物获得重组表达质粒； (3)将所得重组质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06:利用电穿孔转化方法将被线性化的重组质粒转化野生型Y.lipolyticaWSH-Z06,进行验证筛选阳性转化子。
4.利用权利要求2所述基因工程菌发酵生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，将所得重组基因工程菌接种至种子培`养基中，28°C、200rpmin，培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到3L发酵罐中，温度为28°C、通气量为1.5vvm，搅拌转数为400rpm，培养144-168 小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基成分为:葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，KH2PO41g/L, il pH 为 5.5。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为:甘油100g/L，(NH4) 2S043g/L，KH2P043g/L，MgSO4.7Η201.2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO40.1 g/L,盐酸硫胺素2X l(T7g/L，调 pH 为 5.0 后再加入 20g/L CaCO30
【文档编号】C12N15/31GK103484391SQ201310481832
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】陈坚, 郭洪伟, 周景文, 堵国成 申请人:江南大学