一种猪圆环病毒2型高敏感细胞系的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种对猪圆环病毒2型（PCV2）高敏感的细胞系，同时还公开了该细胞系的制备方法，采用PCV2感染PK-15细胞后3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMG-CoAreductase，HMGCR）的表达有显著变化，且沉默HMGCR基因后，PCV2的TCID50达108.5/mL。用RNA干扰技术获得HMGCR基因沉默细胞系，并经过筛选，最终可获得对PCV2高度敏感的细胞系。用本发明制备的HMGCR基因沉默细胞培养猪圆环病毒2型，可获得较高滴度的病毒，有利于猪圆环病毒2型致病机理研究、病毒培养、全病毒灭活苗开发及工业化生产。
【专利说明】一种猪圆环病毒2型高敏感细胞系的制备方法
[0001]【技术领域】:
本发明提供了一种对猪圆环病毒2型(PCV2)高敏感的细胞系，同时还公开了该细胞系的制备方法，属于生物工程【技术领域】。
[0002]【背景技术】:
猪圆环病毒2型引起的断奶仔猪多系统衰竭综合症给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，本病无有效的治疗方法。另外，虽然利用常规PK-15细胞可以培养PCV2，但PCV2难培养、生长慢，全病毒培养物在灭活前的病毒含量也只能达到105 5_6_° TCID50/mL，严重制约了 PCV2全病毒灭活疫苗的生产，因此，研究获取足量PCV2的有效方法十分必要。目前，提高PCV2滴度的方法主要有:
(I)在细胞培养液中填加免疫激活剂、氨基葡聚糖等化学物质。但这些方法操作复杂、花费较高，不利于在工业化生产PCV2全病毒灭活疫苗中使用。
[0003](2)筛选对PCV2高度易感且稳定的细胞系。
[0004]但国内外相关研究均是用常规PK-15细胞经过有限稀释后获得对PCV2敏感的细胞系，尚未见用转基因或基因沉默的方法制备PCV2高易感细胞系的报道。
[0005]
【发明内容】
:
本发明公开了一种对猪圆环病毒2型高敏感的细胞系，利用此细胞系培养PCV2病毒，可使病毒TCID50达到l(T9/mL。
[0006]本发明还提供了猪圆环病毒2型高敏感的基因沉默细胞系的制备方法，适用于人工制备猪圆环病毒2型高敏感的细胞系。
[0007]本发明提供的猪圆环病毒2型高敏感细胞系，其特征在于:
用RNA干扰技术沉默PK-15细胞中与PCV2感染密切相关的HMGCR基因，并获得稳定细胞系，利用此细胞系培养PCV2病毒，可使病毒TCID50达到108_7mL。
[0008]本发明公开了一种真核表达载体pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR,用于构建HMGCR基因沉默的细胞系:
本发明构建的真核表达载体pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR是在pGPHl/GFP/Neo siRNA表达载体的基础上，插入人工合成的shRNA片段而成。
[0009]本发明还提供了用于沉默PK-15细胞的HMGCR基因的shRNA，其序列为:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ；
同时设有阴性对照shRNA，其序列为:
Control Sense:
5’-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaa`gagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ；
Control Antisense:
5’ -gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaad。[0010]本发明所述猪圆环病毒2型高敏感细胞系的构建方法，包括以下步骤:
1)HMGCR基因沉默载体的制备
1.0用于HMGCR基因沉默的shRNA序列:根据猪PK-15细胞的HMGCR基因序列特点，设计用于HMGCR基因沉默的shRNA，
其序列为:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ；
同时设有阴性对照shRNA，其序列为:
Control Sense:
5' -caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；
Control Antisense:
5' -gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。
[0011]1.2) HMGCR基因沉默载体:将设计的shRNA序列合成并连接到pGPHl/GFP/NeosiRNA (GenePharma, China)表达载体上；
2)HMGCR基因沉默细胞的制备
2.1)载体线性化:提取HMGCR基因沉默质粒，用限制性内切酶BamHI酶切，然后乙醇沉淀回收线性DNA片段，用无菌ddH20溶解；
2.2)脂质体转染:将线性化的载体按照脂质体Fugene HD说明书的方法转染PK-15细胞，DMEM培养液，5 % CO2，37 °C培养；
2.3)HMGCR基因沉默细胞的获得及鉴定:上述经脂质体转染后的细胞用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；米用 Western blotting 方法和 Relative quantitative real-timePCR对所获得的细胞进行鉴定，得到HMGCR基因沉默的细胞；
3)HMGCR基因沉默细胞活力的测定
按照 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)的方法测定上述HMGCR基因沉默细胞的活力；
4)对猪圆环病毒2型(PCV2)高敏感的基因沉默细胞的筛选
选取上述HMGCR基因沉默且活力较强的细胞，接种PCV2病毒，用IFA法测定病毒滴度、用Relative quantitative real-time PCR测定病毒基因组拷贝数。
[0012]本发明米用Western blotting 和 Relative quantitative real-time PCR 方法对所获得的细胞进行鉴定。
[0013]目前已经成功获得了 I株HMGCR基因沉默细胞，鉴定结果证明该细胞具有HMGCR基因沉默的特性；
本发明还提供HMGCR基因沉默细胞的Relative quantitative real-time PCR鉴定方法，用于HMGCR基因沉默细胞的鉴定，其特征在于引物序列如下:
HMG3:5' -tatccgtttccagtccaggt-3'；
HMG4:5'-ttacagcagcaggtttcttg-3'。
[0014]本发明的积极效果在于:采用PCV2感染PK-15细胞后3_羟_3_甲戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase，HMGCR)的表达有显著变化，且沉默HMGCR基因后，PCV2的TCID50达108 5/mL。因此，用RNA干扰技术获得HMGCR基因沉默细胞系，并经过筛选，最终可获得对PCV2高度敏感的细胞系。用本发明制备的HMGCR基因沉默细胞培养猪圆环病毒2型，可获得较高滴度的病毒，有利于猪圆环病毒2型致病机理研究、病毒培养、全病毒灭活苗开发及工业化生产。
[0015]【专利附图】
【附图说明】:
图1为HMGCR基因沉默载体框架图；
图 2 为 Relative quantitative real-time PCR 法检测 HMGCR 基因沉默细胞的 HMGCR基因mRNA表达量；
图3为Western blotting法检测HMGCR基因沉默细胞的HMGCR蛋白含量；
图4为MTS法测定HMGCR基因沉默细胞活力；
图 5.Relative quantitative real-time PCR 法检测 HMGCR 基因沉默细胞感染 PCV2后，PCV2的基因组拷贝数；
图6.Western blotting法检测HMGCR基因沉默细胞感染PCV2后，PCV2的产量。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例证明本发明的效果，下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0017]实施例1
HMGCR基因沉默载体的制备
I质粒pGPHl/GFP/Neo siRNA表达载体购自上海吉玛制药技术有限公司。
[0018]2实验过程
1)用于HMGCR基因沉默的shRNA序列:
根据猪PK-15细胞的HMGCR基因序列特点，设计并合成用于HMGCR基因沉默的shRNA，其序列为:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ；
同时设有阴性对照shRNA，其序列为:
Control Sense:
5’-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ；
Control Antisense:
5’ -gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaad ；
2)HMGCR基因沉默载体构建:用BbsI和BamHI双酶切pGPHl/GFP/Neo siRNA载体，回收载体片段，按照上海吉玛制药技术有限公司pGPHl-Neo siRNA expression vector kit说明书操作步骤将上述设计的shRNA序列(Sense和Antisense，Control Sense和ControlAntisense)分别连接到pGPHl/GFP/Neo siRNA表达载体的BbsI和BamHI位点之间。[0019]3)转化将上述连接后的载体转化大肠杆菌DH5a，获得阳性菌株。
[0020]3结果测序鉴定，成功构建了 HMGCR基因沉默载体pGPHl/GFP/NeosiRNA-HMGCR 和对照载体 pGPHl/GFP/Neo siRNA-control。
[0021]4结论成功构建了 HMGCR基因沉默载体pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR和对照载体 pGPHl/GFP/Neo siRNA-control。参见图1 所示。
[0022]实施例2
HMGCR基因沉默细胞的制备
I 质粒 pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR和pGPHl/GFP/Neo siRNA-control，其中pGPHl/GFP/Neo siRNA-control 作为对照质粒。
[0023]2细胞PK-15细胞 3实验过程
1)载体线性化:提取pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR和 pGPHl/GFP/Neo siRNA- control质粒，分别用限制性内切酶 BamHI 酶切 pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR 和 pGPHl/GFP/NeosiRNA-control载体，用无菌ddH20溶解；
2)脂质体转染:将上述线性化的载体按照脂质体转染试剂FugeneHD说明书的方法转染PK-15细胞，DMEM培养液，5 % CO2, 37 °C培养；
3)HMGCR基因沉默细胞的获得及鉴定:上述经脂质体转染后的细胞用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用常规Western blotting方法和Relative quantitativereal-time PCR对所获得的细胞进行鉴定，得到HMGCR基因沉默的细胞，命名为PK-shHMG ;由对照质粒pGPHl/GFP/Neo `siRNA-control转染而获得的对照细胞命名为PK-shNC-controlο
[0024]其中，本发明所述HMGCR基因沉默细胞的Relativequantitative real-time PCR鉴定方法所用引物序列为:
HMG3:5' -tatccgtttccagtccaggt-3',
HMG4:5' -ttacagcagcaggtttcttg-3'。
[0025]4结果沉默细胞PK-shHMG中HMGCR基因表达量显著低于其在对照细胞PK-shNC- control及正常PK-15细胞中的表达量；而对照细胞PK-shNC-control中HMGCR基因表达量与正常PK-15细胞中的无差异(图2，图3)。
[0026]5结论获得HMGCR基因沉默的细胞PK-shHMG和对照细胞PK-shNC-control。
[0027]实施例3
HMGCR基因沉默细胞活力的测定
I细胞HMGCR基因沉默的细胞PK-shHMG和对照细胞PK-shNC-control。
[0028]2 MTS检测试剂盒 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell ProliferationAssay试剂盒购自Promega公司。
[0029]2 实验过程按照 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell ProliferationAssay (Promega)的方法测定上述细胞的活力。实验数据用GraphPad Prism v5.0(GraphPad)统计软件进行分析。
[0030]3结果经统计学分析，PK-shHMG与PK-shNC-control细胞之间的活力无差异(图4)。[0031]4结论HMGCR基因沉默细胞PK-shHMG、以及对照细胞PK-shNC-control的活力与正常细胞基本一致，可用于病毒感染相关研究。
[0032]实施例4
对猪圆环病毒2型(PCV2)高敏感的细胞的筛选
I细胞 HMGCR基因沉默的细胞PK-shHMG，和两个对照细胞PK-shNC-control和PK-Cl-controlο
[0033]2实验过程选取上述HMGCR基因沉默且活力较强的细胞及对照细胞，接种PCV2病毒，用Relative quantitative real-time PCR测定病毒基因组拷贝数、IFA法测定病毒滴度。
[0034]3结果接种PCV2后，PK-shHMG细胞中检测到的PCV2病毒基因组拷贝数达1.0X109和病毒滴度TCID50达108_5/mL，显著高于对照细胞。
[0035]4结论获得了对猪圆环病毒2型(PCV2)高敏感的细胞，用该细胞培养PCV2，病毒基因组拷贝数达1.0X IO9 (图5)和病`毒滴度TCID50达108_7mL左右(图6)。
【权利要求】
1.一种对猪圆环病毒2型高敏感的细胞系，其特征在于: 用RNA干扰技术沉默PK-15细胞中与PCV2感染密切相关的HMGCR基因，并获得稳定细胞系，利用此细胞系培养PCV2病毒，可使病毒TCID50达到108_7mL。
2.权利要求1所述的对猪圆环病毒2型高敏感的基因沉默细胞系的制备方法，包括以下步骤: 1)HMGCR基因沉默载体的制备 1.1)用于HMGCR基因沉默的shRNA序列: 根据猪PK-15细胞的HMGCR基因序列特点，设计用于HMGCR基因沉默的shRNA，其序列为
5' -caccgcagaaactgacacctcaag cttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；
同时设有阴性对照shRNA，其序列为:
5’-caccgttc tccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ； 1.2) HMGCR基因沉默载体: 将设计的shRNA序列合成并连接到pGPHl/GFP/Neo siRNA (GenePharma, China)表达载体上； 2)HMGCR基因沉默细胞的制备` 2.1)载体线性化:提取HMGCR基因沉默质粒，用限制性内切酶BamHI酶切，然后乙醇沉淀回收线性DNA片段，用无菌ddH20溶解； 2.2)脂质体转染:将线性化的载体按照脂质体Fugene HD说明书的方法转染PK-15细胞，DMEM培养液，5 % C02，37 °C培养； 2.3)HMGCR基因沉默细胞的获得及鉴定:上述经脂质体转染后的细胞用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；米用 Western blotting 方法和 Relative quantitative real-timePCR对所获得的细胞进行鉴定，得到HMGCR基因沉默的细胞； 3)HMGCR基因沉默细胞活力的测定
按照 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)的方法测定上述HMGCR基因沉默细胞的活力； 4)对猪圆环病毒2型(PCV2)高敏感的基因沉默细胞的筛选 选取上述HMGCR基因沉默且活力较强的细胞，接种PCV2病毒，用IFA法测定病毒滴度、用Relative quantitative real-time PCR测定病毒基因组拷贝数。
3.一种真核表达载体pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR，其特征在于:是在pGPHl/GFP/NeosiRNA表达载体的基础上，插入人工合成的shRNA片段而成。
4.用于沉默PK-15细胞的HMGCR基因的shRNA，其特征在于其序列为:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ； 阴性对照shRNA，其序列为:
Control Sense:
5’-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ；Control Antisense: 5’-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaad。
5.HMGCR 基因沉默细胞的 Relative quantitative real-time PCR 鉴定方法，用于HMGCR基因沉默细胞的鉴定，其特征在于引物序列如下:
HMG3:5’-tatccgtttccagtccaggt-3’ ；
HMG4:5’-ttacagcagcaggtttcttg-3’ 。
【文档编号】C12R1/91GK103497932SQ201310481480
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】任林柱, 陈福旺, 杨鑫, 欧阳红生, 逄大欣, 曹宇航, 张明军, 董美辰 申请人:吉林大学