用于降低酒中高级醇含量的苹果酶及其制剂和制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于降低酒中高级醇含量的苹果酶，是苹果皮的提取物，采用下述方法制成：取苹果的果皮部分，在果皮中加入冷冻有机溶剂在高速组织匀浆机中打浆，将果浆转入烧杯中后继续加入冷冻有机溶剂，用玻璃棒缓慢搅拌后用真空泵抽滤，滤渣再用冷冻的有机溶剂溶解，经玻璃棒搅拌均匀后，再次抽滤；重复上述操作直至滤渣为无色为止，滤渣转入真空干燥器至干，即得苹果酶粗酶粉。本发明的苹果酶对白酒、果酒等各种常见酒类中有机醇类，尤其是高级醇，如异丙醇、异丁醇、正丁醇、正己醇等高级醇起到显著降解作用，同时促进了芳香酯类物质的合成，使酒的风味有明显改良，在提高酒类风味和安全性以及解酒方面表现出很好的应用前景。
【专利说明】用于降低酒中高级醇含量的苹果酶及其制剂和制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苹果酶及其在降低酒中高级醇含量方面的应用，属于生物制品领域。
【背景技术】
[0002]饮酒是导致人体出现部分疾病的主要原因之一，近年来人们对酒精饮料中乙醇及高级醇危害性的重视程度逐渐加深。由于大多数人缺乏乙醇转化酶，饮酒过度导致的摄入过量乙醇可导致酒精中毒，严重危害人体健康。同时，对于酒类自身而言，过高浓度的高级醇会导致不良风味，当含量超过100mg/L时会使酒的口味和受欢迎程度明显变差；此外过高的高级醇摄入量会对人体产生毒性，其中毒和麻醉作用是乙醇的十几倍，可损害神经系统，使人头痛。因此选择能够合理控制酒精饮品中醇类含量的方法已是迫在眉睫。
[0003]目前研究多从优良菌株的选育、酿酒原料的择优以及发酵工艺的改良三方面对酒中醇类物质的生成进行调控，以达到改善酒体品质的目的，但优选酿酒菌株的方法存在一定的缺陷:耗时过长或技术手段复杂。而单纯改变酿酒原料对降低酒类中的高级醇含量效果并不明显，目前尚没有出现通过改变酿酒原料普遍降低酒类中各种高级醇的方法；更改发酵过程的各种理化参数虽然有助于控制高级醇的生成，微调酒类风味，但在发酵过程中降低高级醇会同时降低与高级醇有关的酯类物质含量，弱化了酒的风味。
[0004]同时，上述的三种思路均只能在酿酒开始时应用，对于已有的酒类成品中已经生成的高级醇，不能通过改变工艺条件消除或者还原，因此需要采用其他措施进行酒类风味改善和优化。针对这些问题，目前多采用物理化学方法对酒进行改性处理，如高压脉冲电场可以促进酒中高级醇的氧化，使其转化为醛或酸；大孔吸附树脂吸附和纳米膜过滤可分别去除酒中62.39%和44.2%的高级醇，但其特异性较差。
[0005]此外，市售的解酒药可以在体内环境下降低对乙醇、高级醇等物质的吸收，或是通过加快人体对摄入的醇类物质的分解代谢，降低血液中醇类浓度，但其长期服用会有一定副作用，影响肝脏、肾脏代谢从而产生不同程度的伤害；或受成本限制，价格较高、不易推广。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的缺陷，本申请发明人在多年的研究中，尝试通过生物酶技术来降解酒类中的多种醇类物质，在经过大量艰苦的研究工作和对各种酶的筛选后，发明人欣喜的发现从苹果皮中提取的苹果酶对醇类物质的降解具有显著效果，在此发现的基础上 申请人:完成了本发明。
[0007]为实现发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的:
[0008]一种用于降低酒中高级醇含量的苹果酶，采用下述方法制成:取苹果的果皮部分，在果皮中加入冷冻有机溶剂在高速组织匀浆机中打浆，将果浆转入烧杯中后继续加入冷冻有机溶剂，用玻璃棒缓慢搅拌后用真空泵抽滤，滤渣再用冷冻的有机溶剂溶解，经玻璃棒搅拌均匀后，再次抽滤；重复上述操作直至滤渣为无色为止，滤渣转入真空干燥器至干，即得苹果酶粗酶粉。
[0009]上述所述的苹果，包括目前已有的各种苹果品种，包括但不限于成熟的红富士、嘎啦、红星、黄元帅、乔纳金等， 申请人:对不同苹果品种中提取的苹果酶的降解性能进行了检测，发现从富士苹果中提取的苹果酶具有最为理想的活性，因此优选苹果的品种为富士。
[0010]相应的，本发明公开了苹果酶的制备方法，即取苹果的果皮部分，在果皮中加入冷冻有机溶剂在高速组织匀浆机中打浆，将果浆转入烧杯中后继续加入冷冻有机溶剂，用玻璃棒缓慢搅拌后用真空泵抽滤，滤渣再用冷冻的有机溶剂溶解，经玻璃棒搅拌均匀后，再次抽滤；重复上述操作直至滤渣为无色为止，滤渣转入真空干燥器至干，即得苹果酶粗酶粉。
[0011]与上述类似，优选的苹果品种为富士。
[0012]在上述方法中，所用的有机溶剂为常见的不被本发明苹果酶降解的有机溶剂，如芳香烃类、醚类和酮类有机溶剂，优选的，考虑到成本和有机毒性的综合需要，所述有机溶剂为丙酮，冷冻温度为-30°C。
[0013]本发明的制备方法，进一步的还包括将苹果酶粗酶粉制成苹果酶酶液，具体包括:将苹果酶粗酶粉I溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，缓慢搅拌然后过滤，取滤液离心，离心所得上清液中加入(NH4)2SO4提高其饱和度，然后静置、高速离心，将所得沉淀溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，所得即为苹果酶酶液。
[0014]通过上述方式，能够将苹果酶成分进行富集。
[0015]其中，上述所用的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液浓度优选为为0.1M，pH4.6。
·[0016]进一步的，本发明还公开了一种用于降低酒中高级醇含量的苹果酶制剂，是将苹果酶粗酶粉或权利要求4的苹果酶酶液固定在载体上，所述载体为海藻酸钠或壳聚糖。
[0017]通过将苹果酶固定化，能更好的保证苹果酶的有效量和活性，提高其降解效果。
[0018]在对不同载体固定化研究过程中， 申请人:发现采用海藻酸钠对苹果酶进行固定化能最好的发挥其活性，因此本发明的苹果酶制剂优选为海藻酸钠固定化苹果酶。
[0019]相应的，本发明提供了上述海藻酸钠固定化苹果酶的制备方法，将海藻酸钠溶液与苹果酶粗酶粉或苹果酶酶液混合，混合液均匀滴入CaC12溶液中，得到的凝胶小球固定后用蒸馏水洗净，即得固定化苹果酶酶粉或固定化苹果酶酶液。
[0020] 申请人:对海藻酸钠溶液、氯化钙溶液等的浓度、固化时间进行了研究，发现在下述浓度范围下海藻酸钠浓度10-100g/L、氯化钙溶液浓度l_50g/L、固化时间0.1-5小时下固化的苹果酶具有较好的活性，优选的海藻酸钠浓度25-45g/L、氯化钙溶液浓度5-25g/L、固化时间0.5-3.5小时，最优选海藻酸钠的浓度为40g/L，氯化钙的浓度为20g/L，固定化时间为2h。
[0021]对本发明的苹果酶降解能力研究发现，本发明的苹果酶对降解酒类饮品中的多种成分具有良好的效果，这些成分不仅包括简单的乙醇，尤其对正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、正己醇等高级醇也具有显著的降解效果，同时对部分酒类饮品中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯等酯类化合物也具有一定的合成能力从而改善其风味，因此本发明还公开了苹果酶在降解酒中醇类物质的应用，其中所述醇类包括但不限于乙醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、正己醇。[0022]通过上述改进，本发明的苹果酶对乙醇以及各种高级醇起到了特异性的降解作用，同时促进了芳香酯类物质的合成，使酒的风味有明显改良，在提高酒类风味和安全性以及解酒方面表现出很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1、2、3、4、5分别为各种制剂类型的富士苹果酶、嘎啦苹果酶、乔纳金苹果酶、黄元帅苹果酶、红星苹果酶对同一酒饮中各种醇类成分的降解效果图示，附图1-5中a、b、C、d、e分别表示海藻酸钠固体化苹果酶粗酶粉、苹果酶粗酶粉、苹果酶酶液、壳聚糖固体化苹果酶液、海藻酸钠固定化苹果酶液。
[0024]图6为酒用量对海藻酸钠固定化苹果酶降解效果的影响图。
[0025]图7、8、9、10分别为苹果酶酶粉用量、海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、固化时间变化对固定化苹果酶降解效果的影响图。
[0026]图11为采用海藻酸钠固定化苹果酶反应次数对酒中乙醇降解率的变化图。【具体实施方式】
[0027]分别采用不同的苹果品种作为原料提取苹果酶，并分析其活性。在下述实施里中使用的苹果分别选自成熟的红富士、嘎啦、红星、黄元帅、乔纳金苹果，选用的样本均无伤痕、无病害、品质良好，均为市售。
[0028]为分析苹果酶对酒中成分降解的效果，选用了多种酒类，包括市售的45°西凤酒，50°太白酒，56° 二锅头，10°猕猴桃酒，上述酒均为质检合格未拆封产品。
[0029]下述实施例中使用的化学原料包括丙酮、50%戊二醛、柠檬酸、柠檬酸钠、无水氯化钙(购于天津市博迪化工有限公司，AR);硫酸铵(天津市纵横兴工贸有限公司化工试剂分公司，AR);透析袋8000-14000;食用级海藻酸钠(青岛明月海藻集团有限公司)；壳聚糖(西安沃尔森生物技术有限公司)。
`[0030]下述实施例中使用的仪器包括MDF-3286S冰箱(SANYO日本三洋)，ST-303组织匀浆机(广东美斯特电器)，SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，DZF真空干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)，F-101电动搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)，GL-20G-1I型高速冷冻离心机(海安亭科学仪器厂)，20ml注射器(平顶山市圣光医用制品有限公司)，XMTD恒温水浴器(北京科伟永兴仪器有限公司)，GC9800(FP)气相色谱仪(上海科创色谱仪器有限公司)，TRACE ISQ气质联用仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)。
[0031]1.分别采用下述方法制备粗酶粉、酶液及其制剂
[0032]一:苹果酶粗酶粉的制备
[0033]称取200g苹果(4°C预冷2d)的果皮部分(厚度0.4-0.5mm)，采用丙酮粉提取法提取粗酶:在上述果皮中加入50mL冷冻丙酮(_30°C )，在高速组织匀浆机中打浆，将果浆转入烧杯中，加入IOOmL冷冻丙酮，用玻璃棒缓慢搅拌lmin，用真空泵抽滤，滤渣再用IOOmL冷冻丙酮溶解，经玻璃棒搅拌均匀后，再次抽滤。如此反复，直至滤渣为无色为止，滤渣转入真空干燥器至干，即为所得粗酶粉。
[0034]二:苹果酶酶液的制备[0035]以实施例1的粗酶粉为基础，称Ig粗酶粉溶解于20mL，pH4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，4°C预冷12h)中，在4°C下用电子恒速搅拌器缓慢搅拌30min，再用四层干净纱布过滤，取滤液在4°C下4000rpm离心30min，上清液中加入(NH4) 2S04,使饱和度达到70%，4°C静置过夜，1000Orpm离心30min，沉淀溶于pH4.6,0.lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，所得即为苹果酶酶液。
[0036]三:海藻酸钠固定化苹果酶制剂的制备
[0037]将10mL40g/L海藻酸钠溶液与0.125g酶粉或2.5mL酶液混合，混合液经注射器以20滴/min的速度均匀滴入20g/L CaCl2溶液中，得到的凝胶小球在4°C下固定Ih后用蒸馏水洗净，分别制成固定化酶粉和固定化酶液。
[0038]四:壳聚糖固定化苹果酶液制剂的制备
[0039]将0.565g壳聚糖与3.75mL50%戊二醛充分混合，于室温下静置3h使壳聚糖充分活化。用蒸馏水多次清洗壳聚糖粉，去除多余戊二醛。加入2.5mL酶液反应lh，再次用蒸馏水进行清洗，直至洗液不具酶活后，即得壳聚糖固定化酶。
[0040]2.为研究本发明苹果酶的效果， 申请人:进行了下述实验:
[0041]2.1不同苹果酶制剂对太白酒中主要醇类物质的降解作用
[0042]取20mL太白酒，分别加入0.125g酶粉、2.5mL酶液、相同含量的固定化酶粉和酶液，在37°C条件下水浴反应时间lh。空白组加入等量灭活的游离酶粉和固定化酶粉以及
2.5mL柠檬酸缓冲液和等量固定化缓冲液。反应结束后，立即冰浴终止反应。
[0043]2.2海藻酸钠固定化富士酶工艺参数的优化
[0044]不同酒用量对固定化酶降解效果的影响:将0.3g酶粉与10mL40g/L海藻酸钠溶液充分混合，滴于20g/LCaCl2溶液中，固定时间为2h。制备好的固定化酶分别与20mL、40mL、60mL太白酒在37°C条件下水浴反应lh。反应停止后检测酒中醇类物质的变化量。
[0045]不同酶用量对固定化酶降解效果的影响:将质量浓度梯度为0.lg、0.3g、0.5g、
0.8g的酶粉分别进行固定化，与10ml40g/L海藻酸钠溶液充分混合，滴于20g/LCaCl2溶液中，固定时间为2h。制备好的固定化酶与20mL太白酒在37°C条件下水浴反应lh。反应停止后检测酒中醇类物质的变化量。
[0046]不同海藻酸钠浓度对固定化酶降解效果的影响:采用IOmL质量浓度分别为25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L的海藻酸钠溶液与0.3g酶粉充分混合，滴于20g/LCaCl2溶液中，固定时间为2h。制备好的固定化酶与20mL太白酒在37°C条件下水浴反应lh。反应停止后检测酒中醇类物质的变化量。
[0047]不同氯化钙浓度对固定化酶降解效果的影响:将0.3g酶粉与10mL40g/L海藻酸钠溶液充分混合，以20滴/min的速度均匀滴入不同质量浓度的氯化钙溶液中(5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L)，固定时间为2h。制备好的固定化酶与20mL太白酒在37°C条件下水浴反应lh。反应停止后检测酒中醇类物质的变化量。
[0048]不同固定化时间对固定化酶降解效果的影响:将0.3g酶粉与10mL40g/L海藻酸钠溶液充分混合，滴于2% CaCl2溶液中，固定时间分别为0.5h、l.25h、2h、2.75h、3.5h。制备好的固定化酶与20mL太白酒在37°C条件下水浴反应lh。反应停止后检测酒中醇类物质的
变化量。
[0049]根据Design Expert8.0对固定化酶主要工艺参数进行响应面分析，采用Box-Behnken中心组合模型进行实验设计,实验因素和水平设计如下表1。制备固定化酶，然后与20mL太白酒在37°C条件下水浴反应lh。反应停止后检测酒中醇类物质的变化量。
[0050]表1响应面实验因素和水平设计表
【权利要求】
1.一种用于降低酒中高级醇含量的苹果酶，其特征在于采用下述方法制成:取苹果的果皮部分，在果皮中加入冷冻有机溶剂在高速组织匀浆机中打浆，将果浆转入烧杯中后继续加入冷冻有机溶剂，用玻璃棒缓慢搅拌后用真空泵抽滤，滤渣再用冷冻的有机溶剂溶解，经玻璃棒搅拌均匀后，再次抽滤；重复上述操作直至滤渣为无色为止，滤渣转入真空干燥器至干，即得苹果酶粗酶粉。
2.根据权利要求1所述的苹果酶，其特征在于所述苹果的品种为富士。
3.权利要求1所述苹果酶的制备方法，其特征在于采用下述方法制成:取苹果的果皮部分，在果皮中加入冷冻有机溶剂在高速组织匀浆机中打浆，将果浆转入烧杯中后继续加入冷冻有机溶剂，用玻璃棒缓慢搅拌后用真空泵抽滤，滤渣再用冷冻的有机溶剂溶解，经玻璃棒搅拌均匀后，再次抽滤；重复上述操作直至滤渣为无色为止，滤渣转入真空干燥器至干，即得苹果酶粗酶粉。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为丙酮，冷冻温度为-30 0C ο
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于还进一步包括将苹果酶粗酶粉制成苹果酶酶液，具体包括:将苹果酶粗酶粉I溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，缓慢搅拌然后过滤，取滤液离心，离心所得上清液中加入(NH4) 2S04提高其饱和度，然后静置、高速离心，将所得沉淀溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，所得即为苹果酶酶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液浓度为 0.1M, ρΗ4.6。
7.一种用于降低酒中高级醇含量的苹果酶制剂，其特征在于将权利要求1的用于降低酒中高级醇含量的苹果酶粗酶粉或权利要求4的苹果酶酶液固定在载体上，所述载体为海藻酸钠或壳聚糖。
8.权利要求7所述苹果酶制剂的制备方法，其特征在于将海藻酸钠溶液与苹果酶粗酶粉或苹果酶酶液混合，混合液均匀滴入CaCl2溶液中，得到的凝胶小球固定后用蒸馏水洗净，即得固定化苹果酶酶粉或固定化苹果酶酶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述海藻酸钠的浓度为40g/L，氯化钙的浓度为20g/L，固定化时间为2h。
10.权利要求1所述苹果酶在降解酒中醇类物质的应用，其中所述醇类包括乙醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、 异戊醇、正己醇。
【文档编号】C12N9/00GK103627680SQ201310539121
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】师俊玲, 韩淇安, 朱静 申请人:师俊玲, 韩淇安, 朱静