一种从魔芋粉中制备低聚甘露糖的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从魔芋粉中制备低聚甘露糖的方法。利用来源于本实验室的重组β-甘露聚糖酶(reAuMan5AN3C3)和重组β-内切葡聚糖酶(reAuCell2A)协同作用对魔芋粉进行酶解，得到低聚甘露糖。该方法所用的关键酶的催化效率较高、酶的生产和使用成本较低、周期短、无污染，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
【专利说明】一种从魔芋粉中制备低聚甘露糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用生物酶水解魔芋粉制备低聚甘露糖的方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]低聚甘露糖(Mannooligosaccharide, M0S)是由2~10个甘露糖通过β_1,4糖苷键聚合而成的低聚糖，又称甘露寡糖。它可有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道益生菌群的增殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿瘤及增强机体免疫力等多种生理功能，是新一代功能性食品。我国已制定了功能性低聚糖行业标准，并将低聚甘露糖列为其一，但目前国内相应产品的市场占有率仍较低。
[0003]魔芋(Amorphophallus konjak)是我国南方地区的特有经济作物，其主要成分为魔芋葡甘露聚糖(konjak glucomannan, KGM)。魔芋葡甘露聚糖主要由甘露糖和葡萄糖组成，其摩尔比为1.5:1，已有研究表明它可以被β-内切葡聚糖酶和甘露聚糖酶水解。目前，在国内魔芋粉主要被当作一种粗纤维食用或用作简单的食品添加剂，附加值不高。而将魔芋粉水解制成低聚甘露糖，可大大拓宽魔芋粉的应用范围，提高原料的附加值，具有重大的经济和社会效益。目前低聚甘露糖的制备通常都是利用高温水解、酸水解或者碱水解，酶法水解虽然也有报道，但条件还不够成熟。酶法生产低聚甘露糖主要受制于生产所用的关键酶的催化效率较低、酶的生产和使用成本较高，以及底物的粘度过大难以实现高浓度的生产等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种双酶法从魔芋粉中制备低聚甘露糖，环保安全，周期短，操作简单的工艺，为低聚甘露糖的酶法生产奠定理论基础。
[0005]本发明的技术方案:通过研究酶解pH值、酶液添加量、酶解时间、酶解温度和底物浓度这些因素，获得最佳的水解条件，在优化条件下利用重组β_甘露聚糖酶(reAuMan5AN3C3)和重组β-内切葡聚糖酶(reAuCell2A)对魔芋精粉进行双酶法水解，测定魔芋精粉中总糖含量及其释放的还原糖含量，并对水解产物进行定性分析。
[0006]所涉及到的具有表达重组β -甘露聚糖酶(reAuMan5AN3ra)和重组β -内切葡聚糖酶(reAuCell2A)能力的工程菌株 GS115 / Auman5An3g3(专利申请号:201210562588.0)和GS115 / AuCell2A(专利申请号:201010581299.6)由本实验室构建保存。
[0007]所述的魔芋精粉中糖含量的测定方法:
[0008]采用DNS试剂法测定魔芋精粉中KGM总糖含量和游离还原糖含量，该总糖仅指KGM粗提液被酸完全水解后所有还原糖之和(本发明中所有还原糖均以甘露糖计)。
[0009]所述的魔芋精粉酶法水解条件的初步研究:
[0010]本发明中分别对影响魔芋精粉酶法水解的5个因素(酶解pH值、酶液添加量、酶解时间、酶解温度和底物浓度)进行单因素实验，每确定一因素将作为下一单因素实验的固定条件，最终获得的最佳条件用于低聚甘露糖的制备研究。
[0011]所述的双酶法提取制备魔芋精粉中的低聚甘露糖:
[0012]在优化的条件下分别研究reAuMan5AN3G3及复配不同比例的reAuCell2A复合酶对魔芋精粉水解率的影响。
[0013]所述的魔芋精粉水解产物的定性分析:
[0014]本发明以硅胶板为层析载体，采用丁醇、冰醋酸和水的混合液作为展层剂，苯胺、二苯胺和浓磷酸溶于丙酮的混合液为显色剂对魔芋精粉水解产物进行薄层层析定性分析。
[0015]本发明的有益效果:本发明提供了一种酶法制备低聚甘露糖的方法。该方法所用的关键酶的催化效率较高、酶的生产和使用成本较低、周期短、无污染，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
【具体实施方式】
[0016]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0017]实施例1魔芋精粉中糖含量的测定方法
[0018]准确称取0.2g魔芋精粉缓慢加入SOmL去离子水，充分搅拌于35°C溶胀4h，5000r mirr1离心20min，上清液即为KGM粗提液，将上清液定容至100mL。准确地吸取4mL粗提液于25mL的具塞试管中，加入0.5mL6mo.L-1的硫酸，充分混匀，于沸水浴中密闭水解
1.5h后用NaOH中和并定容至10mL，取上清液ImL用DNS法测定还原糖的量，计算出魔芋精粉中KGM的总糖含量为69.25%。准确吸取上述KGM粗提液2.5mL,用DNS法测定粗提液中还原糖的量，计算出魔芋精粉中游离还原糖的总量为3.14%。
[0019]实施例2魔芋精粉酶法水解条件的初步研究
[0020](1)酶解pH值:以40U.g—1魔芋精粉的酶液添加量(β -甘露聚糖酶的酶活性以0.5%角豆胶溶液为底物测定)、于50°C条件下将用去离子水及不同pH值(2.5~6)缓冲液配制的20g.L-1魔芋胶溶液水解4h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示在酶解PH值3~4之间，魔芋精粉的水解率较高。
[0021](2)酶液添加量:以去离子水构建反应体系在50°C条件下，分别用不同的酶量(20~70U.g—1魔芋精粉)将20g.L-1的魔芋胶溶液水解4h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示随着酶液添加量的增加，魔芋精粉的水解率逐渐增加，当酶液添加量达到70U.g—1魔芋精粉时，水解率的增加速度趋于平缓，且与60U.g—1魔芋精粉的酶液添加量的水解率差异不大。
[0022](3)酶解时间:以去离子水构建反应体系在50°C条件下，用eOU.g—1魔芋精粉的酶液添加量将20g.L-1的魔芋胶溶液水解不同的时间(I~IOh)，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示随着酶解时间的延长，魔芋精粉的水解率逐渐增加，当酶解时间达到6h时，水解率的增加趋于平缓，且水解6h与水解8h的水解率差异不明显。
[0023](4)酶解温度:以去离子水构建反应体系在不同温度下(20~70°C)，分别用60U.g—1魔芋精粉的酶液添加量将20g.L—1的魔芋胶溶液水解6h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示在常温下魔芋精粉的水解率较低；而当水解温度为60°C时，魔芋精粉的水解率最高可达36.28% ;当温度为70°C时，魔芋精粉的水解率有所降低。
[0024](5)底物浓度:以去离子水配制的不同浓度魔芋胶溶液(5~40g.l1)作为研究对象，分别用60U.g—1魔芋精粉的酶液添加量在60°C下水解6h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示在底物浓度为5~30g.L-1时，魔芋精粉的水解率变化不大，基本能维持在36.55%左右；当底物浓度超过30g.l1时，魔芋精粉的水解率有明显下降。
[0025]实施例3双酶法制备魔芋精粉中的低聚甘露糖
[0026]在优化条件下以去离子水配制的30g.L-1魔芋胶溶液为底物，60U.g—1魔芋精粉的reAuMan5AN3e3并辅以不同单位酶活性的reAuCell2A (酶活性以0.5%的羧甲基纤维素钠为底物测得)在60°C水解6h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示reAuCell2A可以明显地促进reAuMan5AN3G3对魔芋精粉的水解，大大地提闻了魔芋精粉的水解率，水解率最闻可达65.36%。 [0027]实施例4魔芋精粉水解产物的定性分析
[0028]本发明以硅胶板为层析载体，采用2:1:1的丁醇、冰醋酸和水的混合液作为展层剂，0.4mL苯胺、0.4g 二苯胺和2mL85%浓磷酸溶于20mL丙酮的混合液为显色剂对魔芋精粉水解产物进行薄层层析定性分析。样品点样后，在展层剂中展层5h后，将硅胶板放置在通风橱中，通风30min，待展层剂完全挥发掉后用喷壶喷洒显色剂，于室温晾20min，再于105°C烘3~5min，最后拍照观察。结果显示经双酶水解后的产物主要为二糖以上的寡糖，且主要介于二糖与六糖之间，没有检测到单糖的产生。
【权利要求】
1.一种采用双酶法从魔芋粉中制备低聚甘露糖的方法，其特征是以去离子水配制的5~30g.L-1魔芋胶溶液为底物，60~70U.g—1的重组β -甘露聚糖酶(reAuMan5AN3G3)并辅以5~90U.g—1的重组β -内切葡聚糖酶(reAuCell2A)(酶活性以0.5%的羧甲基纤维素钠为底物测得)在60°C水解6~8h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率，水解率为40.55~65.36%。
【文档编号】C12P19/14GK103642875SQ201310666360
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】李剑芳, 陆源, 赵梅, 唐存多, 邬敏辰 申请人:江南大学