一种红酵母的破壁方法
【专利摘要】本发明涉及一种红酵母的破壁方法，包括：不同浓度梯度盐酸的配制，酸热法处理红酵母，有机溶剂提取色素及破壁效果比较。本发明提供的红酵母破壁方法使用的盐酸浓度低，破壁时间短，效率高，类胡萝卜素的提取率较其他浓度酸处理提高近40%，且能耗低，工艺简单，对设备要求低，低浓度的盐酸处理减少了类胡萝卜素的污染，该方法具有很强的实用价值和开发前景。有利于提高红酵母发酵生产类胡萝卜素的产量、质量和降低生产成本。
【专利说明】一种红酵母的破壁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，具体涉及一种红酵母的破壁方法，利用酸热法对红酵母细胞进行破壁，从而达到提取胞内色素的目的。
【背景技术】
[0002]类胡萝卜素是一种广泛存在于植物和微生物中的天然色素。除具有转化为维生素A的生物活性外，还具有预防癌症和心血管疾病等多种生理功能。红酵母产类胡萝卜素具有营养要求简单、生长周期短及菌体营养丰富等优点，具有很大的实用价值和开发前景。但类胡萝卜素是红酵母细胞内产物，破壁效果及提取方法直接影响红酵母发酵生产类胡萝卜素的产量、质量和生产成本。因此，研究红酵母破壁及提取方法具有重要的现实意义。
[0003]红酵母属于单细胞真核微生物，其细胞壁的厚度大约为0.1~0.3 μ m，当细胞老化时，厚度还会增加。红酵母细胞壁结构坚韧，像三明治——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，它们都是复杂的分枝状聚合物，中间夹有1层蛋白质分子。目前报道的关于红酵母的破壁方法有很多，常用的红酵母破壁方法有高压均质法、研磨法、酸法、酶法、碱法、自溶法、甲苯法、二甲亚砜法、超声波法等。酶法及自溶法由于破壁时间较长(4~24h)，可能造成类胡萝卜素的降解。碱法破壁容易使类胡萝卜素变性，造成提取率偏低。高压均质及研磨法存在破壁效率低(不高于80%)、温度不易控制、类胡萝卜素易氧化等局限性。虽然二甲亚砜、甲苯法及超声波法能取得良好的破壁效果，但这两种有机溶剂非常容易产生残留毒性，所提取出的类胡萝卜素不能作为食品及药品原料使用。超声波破碎法对设备要求高，成本相对较高。因此相对于以上几类方法，酸法破壁虽然在一定程度上会引起类胡萝卜素的降解，但该法破壁效果好，如能控制好破壁条件，就有可能开发出一种破壁效果良好、类胡萝卜素损失较少、安全、卫生的破壁方法。
[0004]由于酸热法使用了对细胞壁中原来结构紧密的某些成分(多糖和蛋白质等)具有强力疏松作用的盐酸，并配合沸水`浴处理及速冷处理，使细胞壁结构得以破坏，胞内物质溶出。该法设备简单、能耗小、成本低，对胞内溶出物破坏性也较小，是值得进一步深入探讨的方法。然而目前国内外学者多采用3mol/L盐酸，浸泡40min进行破壁，此法经常出现菌体破壁过头的现象，离心时往往会产生悬浮，需加入大量水进行稀释方可离心，但有时加水稀释也不能达到离心效果，反而导致提取率下降。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种红酵母的破壁方法，对现行的酸热破壁技术中存在的盐酸浓度高，用量大，耗时长，色素提取率低等问题，采用低浓度的盐酸加热处理红酵母达到了破壁的目的，且色素提取率提高了 40%。
[0006]一种红酵母的破壁方法，该方法包括:不同浓度梯度盐酸的配制，酸热法处理红酵母，有机溶剂提取色素及破壁效果比较。本发明解决了高浓度的盐酸处理后，破壁后的细胞碎片在离心体系中无法沉淀的技术问题，同时采用低浓度的盐酸破壁也不会影响类胡萝卜素的提取。
[0007]具体技术方案如下:
[0008]一种红酵母的破壁方法，包括如下步骤:
[0009](1)配制不同浓度梯度的盐酸；
[0010](2)酸热法处理红酵母:
[0011](2-1)红酵母的发酵培养；
[0012](2-2)不同浓度盐酸处理红酵母；
[0013](3)破壁效果比较:
[0014](3-1)恒质量法测定酵母细胞生物量；
[0015](3-2)类胡萝卜素提取与测定。
[0016]步骤(1)进一步包括如下步骤:
[0017]( 1-1)取一定量的浓盐酸加蒸馏水稀释至相关浓度梯度；
[0018](1-2)确定盐酸浓度梯度分别为 lmol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。
[0019]进一步地，步骤(1)中盐酸试剂为分析纯AR，物质量浓度为12mol/L。
[0020]进一步地，步骤(2-1)中进一步包括如下步骤:
[0021]将保藏的红酵母菌种移接到PDA培养基上，在28°C下活化48h ；
[0022]挑2环接入装有50mL的液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h ；
[0023]按10%的接种量接入装有80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C下振荡(180r / min)培养 72h。
[0024]进一步地，步骤(2-2)中进一步包括如下步骤:
[0025]取六只离心管,分别加入10mL上述发酵液,4000r/min离心lOmin ；
[0026]倒去上清液,各加入l-6mol/L的盐酸6ml浸泡40min ；
[0027]于沸水浴中加热4_5min，迅速冷却离心，洗涤沉淀部分；
[0028]弃去上清液，即得细胞碎片。
[0029]进一步地，步骤⑵中六只离心管中加入6mLlmol/L的盐酸，浸泡时间分别设置为10min、20min、30min、40min、50min、60mino
[0030]进一步地，步骤(3-1)中进一步包括如下步骤:
[0031]取10mL发酵液于离心管中，4000r/min离心lOmin ；
[0032]倒掉上清液，用蒸馏水洗涤2次；
[0033]用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒质量M0的称量瓶中，置90°C电热恒温干燥箱中，干燥至恒质量；
[0034]用精密电子天平称量称量瓶与菌体总质量M0
[0035]进一步地，步骤(3-2)中进一步包括如下步骤:
[0036]不同处理方法得到的细胞碎片中加入10mL丙酮；
[0037]在室温下振荡浸泡lh提取类胡萝卜素；
[0038]在转速4000r/min离心15min，得到上清液即为类胡萝卜素提取液；
[0039]如残留的细胞碎片中仍有色素，加丙酮进一步提取，合并上清液；
[0040]将浸提液适当稀释后，用756型分光光度计在波长475nm下测定吸光度值。
[0041]进一步地，[0042]细胞生物量公式为:
【权利要求】
1.一种红酵母的破壁方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)配制不同浓度梯度的盐酸；(2)酸热法处理红酵母:(2-1)红酵母的发酵培养；(2-2)不同浓度盐酸处理红酵母；(3)破壁效果比较: (3-1)恒质量法测定酵母细胞生物量；(3-2)类胡萝卜素提取与测定。
2.如权利要求1所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括如下步骤:(1-1)取一定量的浓盐酸加蒸馏水稀释至相关浓度梯度；(1-2)确定盐酸浓度梯度分别为 lmol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。
3.如权利要求1或2所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(1)中盐酸试剂为分析纯AR，物质量浓度为12mol/L。
4.如权利要求1-3中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(2-1)中进一步包括如下步骤:将保藏的红酵母菌种移接到PDA培养基上，在28°C下活化48h ；挑2环接入装有50mL的液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h ；按10%的接种量接入装有80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C下振荡(180r /min)培养 72h。
5.如权利要求1-4中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(2-2)中进一步包括如下步骤:取六只离心管，分别加入10mL上述发酵液,4000r/min离心lOmin ；倒去上清液，各加入l_6mol/L的盐酸6mL浸泡40min ；于沸水浴中加热4-5min，迅速冷却离心，洗涤沉淀部分；弃去上清液，即得细胞碎片。
6.如权利要求1-5中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(2)中六只离心管中加入6mLlmol/L的盐酸,浸泡时间分别设置为10min、20min、30min、40min、50min、60mino
7.如权利要求1-6中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(3-1)中进一步包括如下步骤:取10mT,发酵液于离心管中，4000r/min离心lOmin ；倒掉上清液，用蒸馏水洗涤2次；用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒质量M0的称量瓶中，置90°C电热恒温干燥箱中，干燥至恒质量；用精密电子天平称量称量瓶与菌体总质量M。
8.如权利要求1-7中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤(3-2)中进一步包括如下步骤:不同处理方法得到的细胞碎片中加入10mL丙酮；在室温下振荡浸泡lh提取类胡萝卜素；在转速4000r/min离心15min，得到上清液即为类胡萝卜素提取液；如残留的细胞碎片中仍有色素，加丙酮进一步提取，合并上清液；将浸提液适当稀释后，用756型分光光度计在波长475nm下测定吸光度值。
9.如权利要求7所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，
10.如权利要求8所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，类胡萝卜素产率计算公式为:
【文档编号】C12R1/645GK103642693SQ201310675002
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】高娜, 马雪, 李瑞萍 申请人:安徽师范大学