专利名称：一种增加酵母细胞微胶囊壁材孔径的方法
技术领域：
本发明涉及一种增加酵母细胞微胶囊壁材孔径的方法，属于生物材料加工的技术领域。
背景技术：
微胶囊作为一项能够改善功能性物质性能的新技术具有广阔的应用前景。酵母细胞大小均匀，容易培养，价廉，其细胞壁和细胞膜构成的双层囊腔结构，是包埋物质的良好材料。法国专利FR2179528报道了工业用酵母经过质壁分离剂处理后，包埋了氯化钕、氯化镁和洋葱提取物；美国专利USA 4001480介绍了一种利用在低氮高碳源培养基上培养的脂肪含量高达40 60%的酵母细胞包埋油溶性化合物的方法；专利EP-0085805A1利用一种既能溶于油又能溶于水的公共溶剂，找到了一种以脂肪含量高于10%的酵母菌制备微胶囊的方法；而专利EP 0242135A2采用将酵母细胞放在含有囊心的浓溶液或分散液中溶胀，在室温条件下搅拌进行扩散渗透的方法，提供了一种脂肪含量低于10%的酵母细胞作为微胶囊壁材而无需公共溶剂的微胶囊化方法。EP 0414282A1和0414283A1提供了一种将漂白剂和纺织柔软剂中的芳香类物质包埋于酵母细胞中的方法。WO 93/11869则先用H2O2除臭后再制成了液体漂白催化剂的微胶囊。WO 94/22572公开了一种先将待包埋物质的溶液进入到细胞中，然后通过物理或化学方法使待包埋物残留其中的制备生物微胶囊的方法。2000年成立的Fluid Technologies Plc.公司专门生产风味物质的酵母微胶囊，日本也开发成功了油脂的酵母微胶囊产品。专利号为ZL2007101375531的中国发明专利提供一种制备安全无毒性能优良的微胶囊壁材的方法。通过对酵母细胞进行改性后所制备的微胶囊壁材既可用于脂溶性物质的包埋，又能用于水溶性物质的微胶囊化。专利号为ZL2007101375527中国发明专利公开了一种小分子抗氧化剂生物微 胶囊的制备方法，不仅制备过程简便，而且在包埋过程中不会发生化学变化。上述专利文献均是以酵母细胞为壁材对小分子物质进行了成功包埋。但只有流体力学半径(Rh)小于O. 81 nm (或分子量低于620 Da )的物质以及分子量低于400 kDa的球形蛋白能够自由通过酵母细胞壁，而质膜却限制了 Rh大于O. 42 nm或分子量高于110 Da的物质的穿越。现有专利文献中还未见通过增大酵母细胞孔径来实现大分子物质如多肽蛋白类药物包埋的方法。多肽蛋白类药物具有活性高、特异性强、毒性低等特点，可有效治疗癌症、自身免疫性疾病及高血压等疑难病，但其口服生物利用度通常低于I %，其常规给药方式均以注射为主。如果将多肽蛋白类药物制成酵母细胞微胶囊后，不仅能有效防止药物在体内快速降解，提高药物的稳定性，而且还能提高治疗的有效性和安全性，降低成本。酵母细胞温和的包埋过程还能避免大分子的聚集变性或链断裂，其丰富的多糖、蛋白质和氨基酸也有助于保持多肽蛋白类药物的生物活性。因此，增大酵母细胞孔径，对于大分子物质的包埋，特别是对于亲水性的多肽蛋白类药物的口服给药的实现具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的技术原理是利用酵母细胞本身的水解酶系，将新培养的食用酵母细胞采用自溶促进剂进行适当的自溶处理后，离心，洗涤，重新悬浮在扩孔剂溶液中，在2(T85°C的温度下进行振荡处理24-72小时后，离心，得沉淀进行冷冻干躁，即得到所述的孔径增大的酵母细胞微胶囊壁材。本发明的目的是提供一种增大酵母细胞微胶囊壁材孔径的方法，使酵母细胞主要用于蛋白质等大分子物质的微胶囊化。步骤包括(I)采用酵母细胞为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养；(2)将所得的细胞离心，洗涤后，重新悬浮在具有自溶促进功能的自溶促进剂中，在40 60°C的温度下进行振荡处理24 48小时后，离心、洗涤，其中所述的自溶促进剂任一选自吐温-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基铵、乙酸乙酯、乙醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钾及氯化钠；应当指出加入自溶促进剂的作用在于促进细胞自溶，如果加入高浓度的自溶促进剂则反应时间更短，如果加·入低浓度的自溶促进剂则反应时间更长。因此在合适浓度范围内，加入不同浓度的自溶促进剂，本领域技术人员显然可以通过控制时间长短来达到预期效果。在另一具体实施方案中，所述的吐温-80或TritonX-100的加入重量为O.1 5% ;或所述的溴化十六烷基三甲基铵的加入重量为O.1 5% ;或所述的乙酸乙酯的加入重量为O. 5 10% ;或所述的乙醇的加入重量为O. 5 10% ;或所述的盐酸的加入重量为O. 5 10% ;或所述的氢氧化钠的加入重量为I 10% ;或所述的氯化钠的加入重量为I 20% ;或所述的氯化钾的加入重量为I 20% ；(3)将经过自溶处理的酵母细胞重新悬浮在扩孔剂溶液中，在20 85°C的温度下进行振荡处理24 72小时后，离心、洗涤，冻干，即得到所述的孔径增大的酵母细胞微胶囊壁材，其中所述的扩孔剂任一选自甘露聚糖酶或葡聚糖酶；(4)将酵母细胞壁材与固体SOD酶混合后，加入十倍重量的水进行搅拌，使酵母细胞壁材与SOD酶溶液高频度接触，离心，洗去细胞表面的SOD酶，冻干后磨细，即得SOD酶的酵母细胞微胶囊。应当指出加入扩孔剂的作用在于部分萃取酵母细胞外壁上的甘露糖蛋白，如果加入高浓度的扩孔剂则反应时间更短，如果加入低浓度的则反应时间更长。因此在合适浓度范围内，加入不同浓度的扩孔剂，本领域技术人员显然可以通过控制时间长短来达到预期效果。在一个具体实施方案中,所述的甘露聚糖酶加入重量为O.1 5% ;或所述的葡聚糖酶的加入重量为O. 5 5%。
在另一个具体实施方案中，酵母细胞壁材的重量g与固体SOD酶的重量g比为100 :20-50。技术效果1、本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本；2、采用甘露聚糖酶降解部分酵母细胞壁，在间隔超声处理过程中能有效增大酵母细胞孔径，不会过度对同一部位进行持续水解酵母细胞壁，有效控制整个酵母细胞壁的孔径大小。3、本发明方法操作简单，极大的延长了大分子蛋白的体外活性，保证了大分子蛋白的稳定性，降低了其生产成本，简化了生产过程。
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例1 :采用酵母细胞为出发菌株，经马铃薯培养基的斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养48h。将所得的酵母细胞离心，洗涤后，重新悬浮在O. 5 10%盐酸溶液中，在40 60°C的温度下进行振荡处理48 h后，12000rpm离心10 min,用水洗漆两次以上。将经过自溶处理的酵母细胞重新悬浮在O.1 5%甘露聚糖酶溶液(长沙湘资生物科技有限公司提供，5000U/g)中，在20 85°C的温度下进行振荡处理24 72小时后，12000rpm离心lOmin，用水洗涤两次以上，冻干，即得到所述的孔径增大的酵母细胞微胶囊壁材。将酵母细胞壁材20 g 与6 g固体SOD酶混合后，加入260 g的水进行搅拌，使酵母细胞壁材与SOD酶溶液高频度接触，7000rpm离心5min，用十倍体积的水进行洗三次，洗去细胞表面的SOD酶，冻干后磨细，即得SOD酶的酵母细胞微胶囊7 g，SOD酶的微胶囊检测可以通过显微镜进行观察。实施例2:采用酵母细胞为出发菌株，经马铃薯培养基的斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养48h。将所得的酵母细胞离心，洗涤后，重新悬浮在O. 5 10%氢氧化钠溶液中，在40 60°C的温度下进行振荡处理24 h后，12000rpm离心lOmin，用水洗涤两次以上。将经过自溶处理的酵母细胞重新悬浮在O. 5 5%葡聚糖酶溶液(长沙湘资生物科技有限公司提供，3500U/g)中，在20 85°C的温度下进行振荡处理24 72小时后，12000rpm离心lOmin，用水洗涤两次以上，冻干，即得到所述的孔径增大的酵母细胞微胶囊壁材。将酵母细胞壁材30 g与12 g固体SOD酶混合后，加入420 g的水进行搅拌，使酵母细胞壁材与SOD酶溶液高频度接触，7000rpm离心5min，用十倍体积的水进行洗三次，洗去细胞表面的SOD酶，冻干后磨细，即得SOD酶的酵母细胞微胶囊11 g，SOD酶的微胶囊检测可以通过显微镜进行观察。实施例3 采用酵母细胞为出发菌株，经马铃薯培养基的斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养48h。将所得的酵母细胞离心，洗涤后，重新悬浮在O. 5 10%氯化钾溶液中，在40 60°C的温度下进行振荡处理36 h后，12000rpm离心lOmin，用水洗涤两次以上。将经过自溶处理的酵母细胞重新悬浮在O. 5 5%葡聚糖酶溶液(长沙湘资生物科技有限公司提供，3500U/g)中，在20 85°C的温度下进行振荡处理24 72小时后，12000rpm离心lOmin，用水洗涤两次以上，冻干，即得到所述的孔径增大的酵母细胞微胶囊壁材。将酵母细胞壁材25 g与8 g固体SOD酶混合后，加入330 g的水进行搅拌，使酵母细胞壁材与SOD酶溶液高频度接触，7000rpm离心5min，用十倍体积的水进行洗三次，洗去细胞表面的SOD酶，冻干后磨细，即得SOD酶的酵母细胞微胶囊9 g，SOD酶的微胶囊检测可以通过显微镜进 行观察。
权利要求
1.本发明提供一种增大酵母细胞微胶囊壁材孔径的方法，其具体步骤包括 (1)采用酵母细胞为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养； (2)将所得的细胞离心，洗涤后，重新悬浮在具有自溶促进功能的自溶促进剂中，在40 60°C的温度下进行振荡处理24 48小时后，离心、洗涤，其中所述的自溶促进剂任一选自吐温-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基铵、乙酸乙酯、乙醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钾及氯化钠； (3)将经过自溶处理的酵母细胞重新悬浮在扩孔剂溶液中，在20 85°C的温度下进行振荡处理24 72小时后，离心、洗涤，冻干，即得到所述的孔径增大的酵母细胞微胶囊壁材，其中所述的扩孔剂任一选自甘露聚糖酶或葡聚糖酶； (4)将酵母细胞壁材与固体SOD酶混合后，加入十倍重量的水进行搅拌，使酵母细胞壁材与SOD酶溶液高频度接触，离心，洗去细胞表面的SOD酶，冻干后磨细，即得SOD酶的酵母细胞微胶囊。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的甘露聚糖酶加入重量为O.1 5% ;或所述的葡聚糖酶的加入重量为O. 5 5%。
3.根据权利要求1的方法，其中酵母细胞壁材的重量g与固体SOD酶的重量g比为,100 :20-50。
全文摘要
经加入适量的扩孔剂进行处理酵母细胞壁使大分子物质进入到细胞壁内。本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本；采用甘露聚糖酶降解部分酵母细胞壁，在间隔超声处理过程中能有效增大酵母细胞孔径，不会过度对同一部位进行持续水解酵母细胞壁，有效控制整个酵母细胞壁的孔径大小；本发明方法操作简单，极大的延长了大分子蛋白的体外活性，保证了大分子蛋白的稳定性，降低了其生产成本，简化了生产过程。
文档编号C12N11/16GK103060307SQ20121059046
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者石国荣 申请人:湖南农业大学