专利名称：一种产喜树碱的喜树内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内生真菌及其应用，特别是涉及一种喜树内生真菌及其在制备喜树碱中的应用，属于微生物真菌及由其制造或获得的物质技术领域。
背景技术：
喜树碱(CPT)属于萜类吲哚生物碱，是一种通过抑制拓扑异构酶I而发挥抗肿瘤活性的天然化合物，其抗肿瘤机制独特。喜树碱系列衍生物如10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康等是附加值极高的抗肿瘤药物，对多种器官组织的癌症病变均有效，已成为世界抗肿瘤药物市场上的主要品种。喜树碱最早由Wall等人于1966年从我国特有珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminata)树皮中分离获得，后来又陆续在海木狗牙花(Ervatamiaheyneana)、臭味假柴龙树(Nothapodytesfoetida)以及短小蛇根草(Ophiorrhizapumila)等植物中发现。喜树碱市场需求大，单纯靠从喜树中提取喜树碱已无法满足人们的需求(国际市场每年喜树碱需求量3000kg，但是全球喜树碱年产量仅600kg)，同时也会造成资源的浪费和环境的破坏。因此，开展喜树内生真菌的分离及其代谢产物的研究，利用微生物发酵技术合成喜树碱，提高喜树碱产量成为喜树碱获取的重要途径。
发明内容
本发明的目的就是提供一种喜树内生真菌菌株及其在喜树碱制备中的应用方法。该菌株从喜树植物材料中分离获取，通过发酵培养能够获得喜树碱，且产量较高。为实现上述目的，本发明提供一种从珙桐科植物喜树中分离得到内生真菌LY357，属深绿木霉(Trichoderma atroviride),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏编号CGMCC6858。从喜树中分离得到内生真菌LY357的ITS和5.8S rDNA碱基序列如SEQ ID N0.1所示为:TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA测序结果SEQ ID N0.1 递交 http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast 进行比对,根据BLAST结果并结合形态学特征得出结论，确证该菌株为深绿木霉，命名为深绿木霉LY357 (Trichoderma atroviride LY357)。一种从喜树中分离深绿木霉LY357的方法:将喜树植物材料按照常规操作切段、清洗、消毒后接种到5%水琼脂固体培养基，28 °C ±2°C恒温培养2 3周，待植物材料长出菌丝，挑取菌丝移至沙氏琼脂固体培养基继续培养，最后经纯化后得到内生真菌深绿木霉LY357。按照接种的一般操作方法，经切段、清洗、消毒的喜树植物材料在接种前先切断，并将新切面接种到5%水琼脂固体培养基。上述深绿木霉LY357采用常规的液体发酵培养方法可应用于制备喜树碱。一种利用深绿木霉LY357获得喜树碱的方法，包括深绿木霉LY357菌株发酵培养步骤、喜树碱提取步骤；其特征在于:在所述发酵培养步骤中，将深绿木霉LY357菌株接种到沙氏琼脂液体培养基，摇床160 土 20rpm，28 ± 2°C，发酵培养8 15d，得到发酵混合物；在所述喜树碱提取步骤中，将发酵混合物经4000rpm离心15min，过滤，分别收集滤液与菌丝体；所述滤液经氯仿-甲醇(V/V=4:1)混合溶剂萃取，有机相于40°C减压浓缩至干得到发酵液提取物；所述菌丝体研磨破碎，甲醇浸泡过夜，等体积氯仿-甲醇(V/V=4:1)混合溶剂萃取，有机相40°C减压浓缩得到菌丝体提取物；发酵液提取物或菌丝体提取物加入氯仿-甲醇(V/V=4:1)溶解，经针头过滤器过滤得到喜树碱粗提物。上述获得喜树碱的方法，依照常规操作必要时需要先制备种子液，包括菌种活化与种子培养。菌种活化中，活化培养基为沙氏固体培养基，28±2°C,培养时间5 7d ;种子培养中，培养基为沙氏液体培养基，28 ± 2°C，摇床160 土 20rpm培养2 3d。深绿木霉LY357经发酵培养制得的发酵液提取物或菌丝体提取物的成分分析显示，喜树碱主要存在于发酵液提取物中，菌丝体提取物中仅含有痕量喜树碱。与现有技术相比，本发明的有益效果是:(I)从喜树植物中分离出新的喜树内生真菌深绿木霉LY357 ; (2)深绿木霉LY357具有产喜树碱特性，能够应用于制备喜树碱；(3)深绿木霉LY357经发酵培养具备较高的喜树碱产量(见表I); (4)深绿木霉LY357分离方法简单易控制；(5)利用深绿木霉LY357获得喜树碱的方法简单易控制。
表I深绿木霉LY357与现有产喜树碱株菌产量的比较
权利要求
1.一种从珙桐科植物喜树中分离得到内生真菌LY357，属深绿木霉，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏编号CGMCC6858。
2.根据权利要求1所述的内生真菌，其特征在于:ITS和5.8S rDNA片段608bp JBSEQID N0.1 所示。
3.根据权利要求1所述的内生真菌应用于制备喜树碱。
4.一种从珙桐科植物喜树中分离得到内生真菌深绿木霉LY357的方法，其特征在于:将喜树植物材料按照常规操作切段、清洗、消毒后接种到5%水琼脂固体培养基，28°C ±2°C恒温培养2 3周，待植物材料长出菌丝，挑取菌丝移至沙氏琼脂固体培养基继续培养，最后经纯化后得到内生真菌深绿木霉LY357。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述喜树植物材料是喜树树根或树皮或果实或树叶或树枝。
6.一种利用珙桐科植物喜树内生真菌深绿木霉LY357获得喜树碱的方法，包括深绿木霉LY357菌株发酵培养步骤、喜树碱粗提物步骤；其特征在于: 在所述发酵培养步骤中，依常规方法制得深绿木霉LY357菌株种子液，将种子液接种到沙氏琼脂液体培养基，28±2°C，摇床160±20rpm，培养8 15d，得到发酵混合物； 在所述喜树碱提取步骤中，将发酵混合物经4000rpm离心15min，过滤，分别收集滤液与菌丝体；所述滤液经4:1 (V/V)氯仿-甲醇混合溶剂萃取，有机相于40°C减压浓缩至干得到发酵液提取物，加入4:1 (V/V)氯仿-甲醇混合溶剂溶解，经针头滤器过滤得到喜树碱粗提物；所述菌丝体研磨破碎，甲醇浸泡过夜，等体积4:1 (V/V)氯仿-甲醇混合溶剂萃取，有机相40°C减压浓缩至干得到菌丝 体提取物，加入4:1 (V/V)氯仿-甲醇溶解，经针头过滤器过滤得到喜树碱粗提物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:在深绿木霉LY357菌株发酵培养步骤前有深绿木霉LY357菌株种子液制备步骤，所述深绿木霉LY357菌株种子液制备方法为:将菌株LY357接种至沙氏琼脂固体培养基，培养5 7d,得活化菌种；再将经活化的菌种接种至沙氏琼脂液体培养基，28±2°C，摇床160±20rpm，培养2 3d，制得种子液。
全文摘要
本发明公开了一种产喜树碱的喜树内生真菌及其在制备喜树碱中的应用。深绿木霉LY357是从珙桐科植物喜树器官组织中分离得到的内生真菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏编号CGMCC6858。该菌株采用常规的液体发酵培养方法可应用于制备喜树碱，所得喜树碱主要存在于发酵液提取物中。深绿木霉LY357从喜树植物材料中分离获取的方法简单易操作，利用深绿木霉LY357发酵培养获得喜树碱的方法简单易操作，并且所得喜树碱产量较高。
文档编号C12P17/18GK103074236SQ201210590518
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者罗应刚, 蒲祥, 屈细兴, 陈菲, 张国林 申请人:中国科学院成都生物研究所