一种甲型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种甲型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用，其命名为A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)，微生物保藏号为：CCTCCNO.V201253。该毒株能在Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度保持在1:512~1:1024，感染性滴度保持在7.0～8.5log10TCID50/ml，经鉴定具有Ca、Ts表型和Att特性。该毒株可以作为母本株与流行株遗传重配或采用反向遗传学技术，将其6个内部基因与流行株2个表面蛋白基因进行基因重配，获得含流行株表面抗原的Vero细胞冷适应株，可应用于制备Vero细胞流感减毒活疫苗或流感减毒活疫苗，也可用于流感灭活疫苗的生产。
【专利说明】—种甲型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甲型流感病毒VeiX)细胞冷适应株，并涉及以此适应株作为母本毒株与其他流行毒株进行重配，从而获得含有流行株表面抗原的Vero细胞冷适应株，以作为制备Veix)细胞流感减毒活疫苗或流感减毒活疫苗以及流感灭活疫苗的毒种，属于生物制品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]流感病毒属于正粘病毒科，其病毒颗粒呈球形或丝状，核衣壳呈螺旋对称，病毒基因组为单股负链分节段的RNA，有包膜。根据病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的抗原性，可将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型和乙型流感病毒的基因含有8个RNA片段，丙型流感病毒的基因含有7个片段；甲型流感病毒又可根据流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，再分为若干亚型。甲型流感病毒常以流行形式出现，乙型流感呈局部爆发，丙型流感主要是以散发形式出现。其中甲型和乙型流感病毒与人类有密切联系，甲型流感病毒除感染人外，还可感染飞禽、猪、马等动物。而人在生活中与这些动物接触频繁，为流感病毒产生变异提供有利条件，变异后的病毒会导致流感流行，变异程度大则导致大流行。
[0003]流感病毒表面抗原的变异是流感流行的主要原因，其表面抗原的变异存在两种机制:一种被称为抗原漂移，另一种变异被称为抗原大变异。抗原漂移在甲型流感病毒和乙型流感病毒上都会发生，主要是通过在HA和NA基因上的点突变和多种氨基酸选择性突变，来逃过机体的免疫作用和以前感染病毒后获得的抗体对病毒的抑制作用，抗原漂移会产生新的流行株，同时也是流感病毒能感染人类，并继续进化的原因。抗原大变异仅发生在甲型流感病毒上，当宿主细胞同时被两种不同亚型的甲型流感病毒感染时，新生的子代病毒可获得来自两个亲代病毒的基因片断，成为基因重配病毒。基因重配产生甲型流感病毒抗原性突变株，如果该突变株在未接种免疫疫苗的易感人群中传播，就会引起流感大流行。
[0004]在人群中广泛流行的甲型流感病毒有H1N1, H2N2和H3N2三个亚型。甲型流感病毒的16种HA和9种NA组成的亚型也广泛存在于一些野生动物,如水鸟中。如果病毒没有经过遗传重配，禽流感亚型一般不对人产生有效的感染，但这种迅速扩散的病毒由于经常性的基因再分化，可能感染人类。例如，自从1997年香港爆发禽流感以来，H5N1亚型经过遗传修饰，除了导致在禽类中大规模爆发，还产生了多例人感染的事件。2003年发现了该病毒株的变异，出现了可以感染人的新变异株。据法新社的数据，H5N1禽流感病毒2003年至2011年间在全球共计致死超过300人，导致大约4亿只家禽遭扑杀，造成大约200亿美元损失。
[0005] 接种流感疫苗是预防和降低流感严重程度的最有效手段，包括灭活疫苗和减毒活疫苗。1941年鸡胚制备的流感灭活疫苗在美国首次获得批准，在全世界得到广泛应用。目前使用的主要是用鸡胚制备的灭活流感三联裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。疫苗株的组分是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律推荐的，用于下一年度疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来确定的。甲型流感病毒联合体实验室利用反向遗传学技术，采用鸡胚高产株的六个内部基因与野生流行株的HA和NA基因重配(6+2重配)得到的，含有流感病毒流行株的HA和NA表面糖蛋白的新疫苗株，具有在鸡胚上高产的特性。
[0006]流感减毒活疫苗因具备滴鼻途径接种，提供粘膜免疫和细胞免疫，且免疫保护更持久等特点而优于灭活疫苗。目前只有美国和俄罗斯生产流感减毒活疫苗，其疫苗种子批均来源于鸡胚高产的流感病毒冷适应株，在美国为A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)和B/AnnArbor/1/66，在俄罗斯为 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)和 B/USSR/60/69。但是，以鸡胚作为培养基质存在以下不足:(I)因潜在污染可能造成鸡传染病因接种疫苗而波散；(2)因连续传代常发生变异，造成疫苗与人群中流行毒株不匹配，使疫苗效力降低；(3)因培养周期过长，难于大规模生产出能满足流感大流行突发性需求；(4)纯化过程复杂；(5)易引起过敏反应。尤其是2003年以来全世界范围内高致病性禽流感的流行，使采用鸡胚生产流感病毒疫苗风险性增加。因此，研究出安全有效的疫苗，已成为流感疫苗重要研究方向，尤其要应对流感大流行时不受鸡胚来源限制，世界卫生组织建议用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗。
[0007] 目前，用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是狗肾细胞(MDCK)和非洲绿猴肾细胞(Vero)。虽然MDCK细胞是培养和分离流感病毒较好的哺乳动物细胞系，但其存在潜在的致瘤性，使得其应用于疫苗生产顾虑重重。非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织批准的可用于人用疫苗生产的传代细胞系，其遗传背景较为清楚，无潜在的致瘤性，安全可靠，且能利用生物反应器进行大规模培养，短期内供给量大。目前VeiO细胞已广泛用于狂犬、乙脑、脊髓灰质炎、肾综合征出血热等疫苗的生产。但是，Vero细胞并不是流感病毒的敏感培养基质，产量较低且多数病毒不能在VeiO细胞上连续增殖。我们研究VeiO细胞流感多年，现已成功筛选出一株甲型流感病毒Vero细胞高产适应株，可以使机体产生相对较强的体液免疫效应和细胞毒性T淋巴细胞反应。在此基础上，如何进一步选育出流感病毒Vero细胞冷适应株，使其能够在25°C也能大量复制且连续高产，成为了 Vero细胞流感减毒活疫苗研发的难题。
[0008]反向遗传学，相对于经典遗传学而言，是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失及基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。目前反向遗传学已应用于流感病毒跨种属传播机制、病毒毒力及其致病性研究和疫苗研发。应用于疫苗研发，即6+2重配，例如将鸡胚高产株的六个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、Μ、NS)和当前流行毒株的HA和NA加以重配，获得流行株的鸡胚高产株，用以生产疫苗。相对于传统流感疫苗研制方法耗时繁琐，并且要求足够的鸡胚供应，反向遗传学可以使疫苗的研制周期缩短、工艺简化。因此反向遗传学是应对流感大流行的一个重要手段。
[0009]综上所述，流感仍是人类尚不能有效控制的世界性传染病，接种流感疫苗是预防流感的主要手段，流感疫苗中减毒活疫苗又优于灭活疫苗。目前使用鸡胚作为制备流感疫苗的基质，存在很多不足之处，而使用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)制备流感疫苗已成为流感疫苗发展的重要方向。如何选育出流感病毒Vero细胞冷适应株，使其不仅在33°C而且在25°C也能大量复制且连续高产，成为了 Veix)细胞流感减毒活疫苗研发的难题。因为通常情况下，25°C是Veix)细胞维持正常生长的最低温度，在这个温度下，细胞的代谢都趋于缓慢，因此会影响流感病毒在细胞内的复制，而流感病毒的复制是需要细胞提供支持的。
[0010]目前所用的流感疫苗生产毒种都是与鸡胚高产株重配或天然的鸡配适应株，其一般在Vero细胞上不敏感。国内和国外有厂家直接将WHO提供的流感疫苗生产毒种接种Vero细胞产毒量低或产量不稳定，制约了利用Vero细胞培养流感病毒制备流感疫苗的应用。
【发明内容】
[0011]本发明的目的之一在于提供一种新的甲型流感病毒VeiX)细胞冷适应株，且在Vero细胞上25°C可连续传代并保持稳定高产，该甲型流感病毒Veix)细胞冷适应株具有G、7?表型和特性。
[0012]本发明提供的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株，命名为A/Yunnan/l/2005Vca(H3N2),其保藏号为:CCTCC N0.V201253，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心，保藏地址为:武汉市，武汉大学；保藏时间为:2012年12月20日。
[0013]本发明的目的之二是提供所述甲型流感病毒VeiO细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的制备方法。
[0014]本发明提供的保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)通过下列方法获得:
A.在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种IMOI的血凝滴度达到1:1024的甲型流感病毒 A/kunming/l/2005Va (H3N2)；
B.在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液
0.3 - 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶浓度 0.5 - 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，30 ± I °C条件下，培养步骤A的甲型流感病毒72小时后，收获病毒液；
C.将步骤B收获的病毒液反复冻融3次，再接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上，再重复步骤B和C，如此在Vero细胞上连续传20代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:1024，得传代甲型流感病毒；
D.在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种IMOI步骤C的传代甲型流感病毒；
E.在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液
0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶浓度 0.5 — 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，25±1°C条件下，培养步骤D的传代甲型流感病毒120-168小时后，收获病毒液；
F.将步骤E收获的病毒液反复冻融3次，再接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上，再重复步骤E和F，如此在VeiO细胞上连续传72代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:1024，得甲型流感病毒Vero细胞冷适应株。
[0015]所述步骤A的甲型流感病毒A/kunming/l/2005Va (H3N2)为现有的甲型流感病毒Vero细胞高产适应株，其保藏号为=CCTCC N0.V200514，专利号为ZL 2009 I 0094223.8。
[0016]本发明提供的保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca ( H3N2)的基本特征:(a)透射电镜观察到所得的流感病毒直径约为80-120nm,具有囊膜的较为典型的流感病毒形态；(b)基因序列分析表明在连续传代培养过程中，不易产生流感病毒基因变异；(c)流感病毒在25°C Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度可保持在1:1024 ;(d)HI实验表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它动物抗H3亚型流感病毒高免血清特异性识别；(e) A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)活病毒经自然途径感染SPF鸡后，感染鸡无发病和死亡。
[0017]本发明的目的之三是提供保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的应用，即以甲型流感病毒Vero细胞冷适应株作为母本株与其他流行毒株进行重配，从而获得流行株的Vero细胞冷适应株，具体通过以下两种方法实现:
第一种方法:用常规的重配技术获得流感病毒流行株的Vero细胞冷适应株:
Al.以1:100-100:1的体积比，将保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)与其他亚型流感病毒混合，得混合病毒，具体比例由病毒血凝滴度和不同毒株生长性而定；
A2.在9-10日龄SPF鸡胚上，按每胚接种0.1-0.3ml的量，接种步骤Al的混合病毒，于33±1°C孵育12-48小时，2-8°C过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液，得病毒液；
或者在新鲜的Vero细胞上，按0.004-0.008ml/cm2Vero细胞的量，接种步骤Al的混合病毒，置于33±1°C培养48-72小时,得病毒液；
或者在新鲜的MDCK细胞上，按0.004-0.008ml/cm2MDCK细胞的量，接种步骤Al的混合病毒，置于33±1°C培养48-72小时,得病毒液；
A3.将步骤A2的病毒液中加入抗A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的抗血清至抗血清浓度为1_80%(体积比)，具体浓度视抗体效价为1:10240 - 1:2560而定，并在Vero细胞上25°C传代筛选，从而选育出流行株的Vero细胞冷适应株；
第二种方法:用现有的反向遗传学技术重配获得流感病毒流行株的Vero细胞冷适应
株:
B1.将保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的6个内部基因，即PB2、PB1、PA、NP、M、NS，分别克隆于双向转录载体pHW2000上或其它双向转录载体上，得克隆的Vero细胞冷适应株6个内部基因质粒；将流行株的2个表面蛋白基因HA和NA，也克隆于此双向转录载体上，得流行株2个表面蛋白基因质粒；
B2.将步骤BI所得克隆的Vero细胞冷适应株6个内部基因质粒与流行株2个表面蛋白基因质粒混合后，共转染哺乳动物细胞297T、Cosl、Vero或MDCK细胞上，37 ± I °C培养48-72小时，收获细胞液；
B3.在9-10日龄SPF鸡胚上，按每胚接种0.1-0.2ml的量，接种步骤B2的收获细胞液，25±1°C培养96-120小时，收获病毒液，即获得流行株的Vero细胞冷适应株；
或者在24小时长成致密单层的MDCK细胞上，按0.04-0.08ml /cm2MDCK细胞的量，接种步骤B2的收获细胞液，置于25± 1°C培养120-168小时，收获病毒液，即获得流行株的Vero细胞冷适应株；
或者在24小时长成致密单层的Vero细胞上，按0.04-0.08ml/cm2Vero细胞的量，接种步骤B2的收获细胞液，置于25± 1°C培养120-168小时，收获病毒液，即获得流行株的Vero细胞冷适应株。
[0018]本发明的难点在于:
(!)甲型流感病毒Vero细胞冷适应株在25°C培养时也能大量复制且连续高产。[0019](2)对甲型流感病毒A/Yunnan/1/2005 Vca (H3N2)在Vero细胞上的种毒培养条件进行了系统的优化。
[0020](3)甲型流感病毒Vero细胞冷适应株在鸡胚25°C培养时也能大量复制且连续高产，同时具有减毒特征。
[0021](4)如何应用甲型流感病毒A/Yunnan/1/2005 Vca (H3N2)与其他病毒株遗传和反向遗传学重配，进而获得Vero细胞冷适应株进行了研究。
[0022]本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:
(I)本发明提供的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株，可采用微载体发酵罐进行大规模培养Vero细胞和流感病毒，以制备流感减毒活疫苗和大流行流感疫苗。较现有的以鸡胚作为培养基质生产出的流感疫苗具有以下优点:
①可以采用微载体发酵罐大规模培养Vero细胞和流感病毒，生产工艺易于标准化②采用标准化的Veix)细胞，不含外源生物因子污染；③不含易于引起人体过敏的鸡胚蛋白；④
避免了流感病毒在鸡胚培养后病毒的血凝素抗原易产生变化使疫苗效力降低；⑤在流感
大流行突发性时，不受鸡胚来源的影响，能够生产出足够的疫苗满足需求。
[0023](2)本发明在保藏号为CCTCC N0.V200514的甲型流感病毒Vero细胞高产适应株A/kunming/1/2005Va (H3N2)基础上，采用连续梯度降温法，连续传72代，成功选育出保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/1/2005Vca (H3N2),其能在Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度保持在1:512 — 1:1024，感染性滴度保持在
7.0 - 8.51og10TCID50/ml，经鉴定具有ca、Ts表型和ATT特性。将其作为母株与流行株流感病毒重配，可获得Vero细胞甲型流感病毒疫苗生产用毒种，大大促进了 Vero细胞流感减毒活疫苗和VeRo细胞大流行流感疫苗的开发与生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)在30°C的连续传代血凝效价图。
[0025]图2为A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)在25°C连续传代血凝效价图。
【具体实施方式】
[0026]以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
[0027]实施例1
保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的制备方法:
1.在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种IMOI的血凝滴度达到1:1024的保藏号为 CCTCC N0.V200514 的甲型流感病毒 A/kunming/l/2005Va (H3N2)；
2.在维持母液成分为MEM,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰胺溶液0.6mg/ml,牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml, pH7.2，30± 1°C条件下，培养步骤I的甲型流感病毒72小时后,收获病毒液；3.将步骤2收获的病毒液反复冻融3次，再接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上，再重复步骤2和3，如此在VeiO细胞上连续传20代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:1024，得传代甲型流感病毒；
4.在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种IMOI步骤3的传代甲型流感病毒；
5.在维持母液成分为MEM,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰胺溶液0.6mg/ml,牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶浓度1.0ug/ml, pH7.2，25± I°C条件下，培养步骤4的传代甲型流感病毒72小时后,收获病毒液；
6.将步骤5收获的病毒液反复冻融3次，再接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上，再重复步骤5和6，如此在Vero细胞上连续传72代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:1024，得保藏号为CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero细胞冷适应株，命名为A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)。
[0028]该甲型流感病毒A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的相关试验数据见图1 一图2和表I 一表2，证明此毒株具有在Vero细胞上25°C培养时高效稳定增殖的特性。
[0029]表1，温度降低过程中的流感病毒病变时间
【权利要求】
1.一种甲型流感病毒Vero细胞冷适应株，命名为A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)，该毒株的微生物保藏号为:CCTCC N0.V201253。
2.如权利要求1所述甲型流感病毒Vero细胞冷适应株在制备流行株的Vero细胞适应株中的应用。
3.如权利要求1所述甲型流感病毒Vero细胞冷适应株在制备流感疫苗中的应用。
4.一种甲型流感病毒VeiO细胞冷适应株的制备方法，其特征在于经过以下步骤: A.在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种IMOI的血凝滴度达到1:1024的甲型流感病毒 A/kunming/l/2005Va (H3N2)； B.在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 - 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml, TPCK-胰酶浓度 0.5 - 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，30 ± I °C条件下，培养步骤A的甲型流感病毒72小时后，收获病毒液； C.将步骤B收获的病毒液反复冻融3次，再接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上，再重复步骤B和C，如此在Vero细胞上连续传20代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:1024，得传代甲型流感病毒； D.在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种 IMOI步骤C的传代甲型流感病毒； E.在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶浓度 0.5 — 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，25±1°C条件下，培养步骤D的传代甲型流感病毒120 - 168小时后，收获病毒液； F.将步骤E收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上，再重复步骤E和F，如此在VeiO细胞上连续传72代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:1024，得甲型流感病毒Vero细胞冷适应株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤A的甲型流感病毒A/kunming/l/2005Va (H3N2)为现有的甲型流感病毒Vero细胞高产适应株，其保藏号为:CCTCC N0.V200514。
【文档编号】C12R1/93GK103898066SQ201410039468
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】廖国阳, 李卫东, 杨景晖, 周芳烨, 马磊, 周健, 蔡玮, 寸怡娜, 高菁霞, 张新文, 戴宗祥, 姜述德 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所