一种tale聚体库的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种TALE聚体库的构建方法，该方法通过TALE单体扩增、构建酶切连接产物、酶切连接产物扩增、BP反应后建立TALE聚体库。利用TALE聚体库，可以组装识别20-25bpTales模块，扩大识别区域。本发明的方法准确率高，灵活性和高通量，可以准确地高通量构建载体，大大节约成本。该方法可以扩大识别区域，准确地高通量构建载体，大大节约成本。
【专利说明】一种TALE聚体库的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学领域中的构建方法，特别是涉及一种TALE聚体库的构建方法。【背景技术】
[0002]TALEN(Transcription Activator-Like (TAL)Effector Nucleases)革巴向基因敲除技术是一项崭新的分子生物学工具，是基因功能研究领域的一项重大技术突破。该技术利用TAL序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，可以实现在特异的位点打断目标基因，从而敲除该基因。
[0003]TALE 蛋白 N端和 C端分别是核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)和转录激活结构域(Activation domain, AD),而中部则是介导其与DNA特异识别与结合的结构域。TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列，其序列重复的部分由长度为33~35个氨基酸残基的重复单位(或称重复单元)构成，在每个重复单位中，+12和+13位的氨基酸残基是实现靶向识别特异DNA碱基的关键位点，随靶点核苷酸序列的不同而异，被称作重复可变双残基(Repeat variable d1-residue, RVD);其他位置的氨基酸残基则相对固定。不同的RVD能够相对特异地分别识别A、T、C、G4种碱基中的一种，其中分别与这4种碱基相对应的最常见的5种RVD分别是NI (Asn He) ,NG (Asn Gly) ,HD (His Asp)、NN(Asn Asn)和NH(Asn His)。这5种常见的可变区能分别特异性结合4种不同的碱基(NG识别T, HD识别C，NI识别A, NN和NH识别G)。
[0004]由于TALE由大量重复的序列构成，然而，为了保证TALE蛋白识别DNA序列的特异性，人工构建的TALE蛋白DNA结合结构域通常需要含有10个以上的重复单元，总长度大于1000bp0因此，TALE串联重 复序列的构建难度较大，成为TALE应用中的主要瓶颈。目前，构建TALE串联重复序列及TALE蛋白DNA结合结构域的主要方法包括人工合成全长的TALE序列，以及基于Golden Gate的载体克隆技术等两种方法。但是上述两种方法构建载体比较慢，不利于高通量的TALE相关载体构建，不利于大规模的基因编辑。因此建立TALE重复区的高效组装技术平台非常重要。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，建立TALE重复区的高效组装技术。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种TALE聚体库的构建方法，包括如下步骤:
[0007](I) TALE 单体扩增:分别以 pTALE-NI，pTALE-NG, pTALE-NH, pTALE-HD 为模板，使用引物对TALE-Fn/TALE-Rn进行扩增，分别得到第一类至第十五类单体的混合物和第十六类单体N16，其中，所述η为I至16 ;
[0008](2)构建酶切连接产物:分别将所述第一类至第十五类单体进行进行酶切和连接，得到第一至第八酶切连接产物；
[0009](3)酶切连接产物和第十六类单体Ν16扩增:分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体N16为模板，使用引物对attBl-F/attBl-R进行扩增，分别得到第一类至第六类五聚体混合物、三聚体混合物、二聚体混合物和N16扩增产物；
[0010](4) TALE聚体克隆:分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物以及三聚体、二聚体混合物和第十六类单体N16扩增产物，与pDonr221载体(Kana+)进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序；
[0011](5) TALE聚体库构建:根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。
[0012]优选的，所述TALE单体扩增包括如下步骤:
[0013]分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD 为模板，
[0014]使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即Nil，NGl,NHl 和 HDl ;
[0015]使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2 和 HD2 ；
[0016]使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3 和 HD3 ；
[0017]使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4 和 HD4 ；
[0018]使用TALE-F5/TALE-R5引物对进行扩增，得到第五类单体的混合物，即NI5，NG5，NH5 和 HD5 ；
[0019]使用TALE-F6/TALE-R1引物对进行扩增，得到第六类单体的混合物，即NI6，NG6，NH6 和 HD6 ；
[0020]使用TALE-F5/TALE-R7引物对进行扩增，得到第七类单体的混合物，即NI7，NG7，NH7 和 HD7 ；
[0021]使用TALE-F8/TALE-R1引物对进行扩增，得到第八类单体的混合物，即NI8，NG8，NH8 和 HD8 ；
[0022]使用TALE-F5/TALE-R9引物对进行扩增，得到第九类单体的混合物，即NI9，NG9，NH9 和 HD9 ；
[0023]使用TALE-F10/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十类单体的混合物，即NI10，NG10, NHlO 和 HDlO ；
[0024]使用TALE-F5/TALE-R11引物对进行扩增，得到第十一类单体的混合物，即NI11，NGlI, NHll 和 HDll ；
[0025]使用TALE-F12/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十二类单体的混合物，即NI12，NG12, NHl2 和 HD12 ；
[0026]使用TALE-F5/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十三类单体的混合物，即NI13，NG13, NHl3 和 HD13 ；
[0027]使用TALE-F3/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十四类单体的混合物，即NI14，NG14, NH14 和 HD14 ；
[0028]使用TALE-F2/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十五类单体的混合物，即NI15，NG15, NHl5 和 HD15 ；[0029]使用TALE-F1/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十六类单体，即单体NI16，NG16，NH16 和 HD16，命名为 N16。
[0030]优选的，所述构建酶切连接产物包括如下步骤:
[0031]将第一类、第二类、第三类、第四类和第五类单体混合物进行酶切和连接，得到第一酶切连接产物；
[0032]将第六类、第二类、第三类、第四类和第七类单体混合物进行酶切和连接，得到第二酶切连接产物；
[0033]将第八类、第二类、第三类、第四类和第九类单体混合物进行酶切和连接，得到第三酶切连接产物；
[0034]将第十类、第二类、第三类、第四类和第十一类单体混合物进行酶切和连接，得到第四酶切连接产物；
[0035]将第十二类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第五酶切连接产物；
[0036]将第十类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第六酶切连接产物；
[0037]将第十二类、第二类、第十四类单体混合物进行酶切和连接，得到第七酶切连接产物； [0038]将第十二类，第十五类单体混合物进行酶切和连接，得到第八酶切连接产物。优选的，所述酶切连接产物扩增包括如下步骤:
[0039]分别以所述第一至第八酶切连接产物和N16为模板，使用引物对attBl-F/attBl-R进行扩增，分别得到第一类五聚体混合物N1N2N3N4N5 ;第二类五聚体混合物N6N2N3N4N7 ;第三类五聚体混合物N8N2N3N4N9 ;第四类五聚体混合物N10N2N3N4N11 ?’第五类五聚体混合物N12N2N3N4N13 ;第六类五聚体混合物N10N2N3N4N13 ;三聚体混合物N12N2N14 ;二聚体混合物N12N15和N16扩增产物。优选的，所述TALE聚体克隆包括如下步骤:
[0040]分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物、三聚体、二聚体混合物以及N16扩增产物，与pDonr221载体(Kana+)进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序。根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。
[0041]一种使用所述的TALE聚体库的构建方法构成的TALEN表达载体的构建方法，
[0042]从所述的五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库中，分别确定相应的质粒，与表达载体pTALEN-backbone (Amp+)进行Goldengate反应,构建TALEN表达载体，所述的TALE识别序列的长度为20-25个碱基。
[0043]本发明主要利用了在每一对存在的TALE重复单元之间交界位置的Gly-Leu双氨基酸的编码序列。根据密码子的简并性，两端的引物引入attBl，attB2位点，并引入BsmBI酶切位点。用带有attBl，attB2位点的引物扩增第一至第八酶切连接产物和N16，然后通过BP反应,分别把五聚体、三聚体、二聚体和单体克隆到pDonr221 (Invitrogen)载体上。几种不同的pDonr22-TALE放在一起通过酶切连接的方法克隆目的载体上。
[0044]通过这种本发明提供的方法，利用密码子的简并性。设计了一系列的两端带有attBl,attB2位点和BsmBI酶切位点的引物。然后用这些引物去扩增第一至第八酶切连接产物和N16，把扩增产物通过BP反应克隆到pDorn221载体上，建立五聚体库，三聚体库和二聚体库和单体库。利用这些库，可以组装识别20-25bpTales模块，扩大识别区域。本发明的方法准确率高，灵活性和高通量。这些库构建好之后，可以准确地高通量构建载体，大大节约成本。
【具体实施方式】
[0045]1、TALE单体的扩增:
[0046](I)分别以 pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD 为模板；
[0047]使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即Nil，NGl,NHl 和 HDl ;
[0048]使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2 和 HD2 ；
[0049]使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3 和 HD3 ；
[0050]使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4 和 HD4 ；
[0051]使用TALE-F5/TALE-R5引物对进行扩增，得到第五类单体的混合物，即NI5，NG5，NH5 和 HD5 ；
[0052]使用TALE-F6/TALE-R1引物对进行扩增，得到第六类单体的混合物，即NI6，NG6，NH6 和 HD6 ；
[0053]使用TALE-F5/TALE-R7引物对进行扩增，得到第七类单体的混合物，即NI7，NG7，NH7 和 HD7 ；
[0054]使用TALE-F8/TALE-R1引物对进行扩增，得到第八类单体的混合物，即NI8，NG8，NH8 和 HD8 ；
[0055]使用TALE-F5/TALE-R9引物对进行扩增，得到第九类单体的混合物，即NI9，NG9，NH9 和 HD9 ；
[0056]使用TALE-F10/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十类单体的混合物，即NI10，NG10, NHlO 和 HDlO ；
[0057]使用TALE-F5/TALE-R11引物对进行扩增，得到第十一类单体的混合物，即NI11，NGlI, NHll 和 HDll ；
[0058]使用TALE-F12/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十二类单体的混合物，即NI12，NG12, NHl2 和 HD12 ；
[0059]使用TALE-F5/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十三类单体的混合物，即NI13，NG13, NHl3 和 HD13 ；
[0060]使用TALE-F3/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十四类单体的混合物，即NI14，NG14, NH14 和 HD14 ；
[0061]使用TALE-F2/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十五类单体的混合物，即NI15，NG15, NHl5 和 HD15 ；[0062]使用TALE-F1/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十六类单体，即单体NI16，NG16，NH16 和 HD16，命名为 N16。
[0063](2)扩增单体的PCR体系和条件为:
[0064]PCR 体系:
[0065]模板:lul(5ng/ul)
[0066]5 X buffer: 10ul
[0067]dNTP (100mM):0.5ul
[0068]正向引物(20uM):0.5ul
[0069]反向引物(20uM):0.5ul
[0070]Taq DNApolymerase:0.5ul
[0071]ddH20:37ul
[0072]PCR条件:95°C预变性 3min，95°C变性 20s，60°C退火 20s，72°C延伸 10s，扩增 26 个循环，72°C 延 5min。
[0073]2、TALE五聚体库，三聚体库和二聚体库的构建:
[0074](I)将第一类、第二类、第三类、第四类和第五类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
[0075]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmB I1.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul，T4DNA 连接酶 0.5ul, ddH202ul ;反应条件为 37°C酶切 5min, 20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物I。
[0076](2)将第六类、第二类、第三类、第四类和第七类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
[0077]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul，T4DNA 连接酶 0.5ul，ddH202ul ;反应条件为 37°C酶切 5min，20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物2。
[0078](3)将第八类、第二类、第三类、第四类和第九类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
[0079]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2u, dATP2ul,T4DNA连接酶0.5ul，ddH202ul ;反应条件为37°C酶切5min，20°C连接5min，12个循环，得到酶切连接产物3。
[0080](4)将第十类、第二类、第三类、第四类和第十一类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
[0081]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul，T4DNA 连接酶 0.5ul，ddH202ul ;反应条件为 37°C酶切 5min，20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物4。
[0082](5)将第十二类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
[0083]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul，T4DNA 连接酶 0.5ul，ddH202ul ;反应条件为 37°C酶切 5min，20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物5。[0084](6)将第十类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
[0085]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul, T4DNA 连接酶 0.5ul, ddH202ul，反应条件为 37°C酶切 5min，20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物6。
[0086](7)将第十二类、第二类、第十四类单体混合物分别定量至20ng/ul，三种单体混合物进行酶切和连接；
[0087]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul，T4DNA 连接酶 0.5ul，ddH206ul ;反应条件为 37°C酶切 5min，20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物7。
[0088](8)将第十二类，第十五类单体混合物分别定量至20ng/ul，两种单体混合物进行酶切和连接；
[0089]体系为:每种单体混合物各取2ul，BsmBIl.5ul, 10Xbuffer2ul, DTT2ul,dATP2ul，T4DNA 连接酶 0.5ul，ddH208ul ;反应条件为 37°C酶切 5min，20°C连接 5min，12 个循环，得到酶切连接产物8。
[0090](9)分别以酶切连接产物1、2、3、4、5、6、7、8和N16为模板，使用引物对attBl-F/attBl-R进行扩增，分别得到第一类五聚体混合物N1N2N3N4N5 ;第二类五聚体混合物N6N2N3N4N7 ;第三类五聚体混合物N8N2N3N4N9 ;第四类五聚体混合物N10N2N3N4N11 ?’第五类五聚体混合物N12N2N3N4N13 ;第六类五聚体混合物N10N2N3N4N13 ;三聚体混合物N12N2N14 ;二聚体混合物N12N15 ；N16扩增产物。
[0091]PCR 体系:
[0092]酶切连接产物:2ul
[0093]5 X buffer: IOul
[0094]dNTP (IOOmM):0.5ul
[0095]attBl-F (20uM):0.5ul
[0096]attBl-R (20uM):0.5ul
[0097]Taq DNApolymerase:0.5ul
[0098]ddH20:36ul
[0099]PCR条件:95°C预变性 3min，95°C变性 20s，60°C退火 20s，72°C延伸 20s，扩增 26 个循环，72°C 延 5min。
[0100](10)分别将第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物以及三聚体，二聚体混合物，N16扩增产物与pDonr221载体(Kana+)进行BP反应，将BP反应产物进行转化，针对1-6类混合物分别挑取2400个单菌落，使用pDonr221-F/pDonr221-R引物进行菌落PCR，即总共挑取14400个单菌落，针对三聚体混合物则挑取300个单菌落进行菌落筛选，针对二聚体挑取60个单菌落进行菌落筛选，针对N16扩增产物即得到单体库，将菌落PCR阳性的单菌落进行扩大培养，抽提质粒后进行测序。
[0101]BP反应体系: [0102]混合物:2ul(100ng/ul)
[0103]pDonr221: Iul (100ng/ul)[0104]BP 酶:Iul
[0105]ddH20:lul
[0106]BP反应条件:25 °C反应2_3h
[0107](11)根据测序序列分析结果，针对每种五聚体混合物，得到序列确定的五聚体。每种五聚体混合物分别得到1024种五聚体，即总共会得到6144种五聚体，针对三聚体混合物，得到64种三聚体，针对二聚体混合物，得到16种二聚体。第一类五聚体库命名为TALE-N1N2N3N4N5 ;第二类五聚体库命名为TALE-N6N2N3N4N7 ;第三类五聚体库命名为TALE-N8N2N3N4N9 ;第四类五聚体库命名为TALE-N10N2N3N4N11 ;第五类五聚体库命名为TALE-Nl2N2N3N4N13 ;第六类五聚体库命名为TALE-N10N2N3N4N13 ;三聚体库命名为TALE-N12N2N14 ;二聚体库命名为TALE-N12N15 ;单体库则命名为TALE-N16。
[0108]3、根据上述的四种库，可以将TALE识别序列的长度增至20_25个碱基，可从TALE五聚体库，三聚体库，二聚体库和单体库中分别挑选相应的质粒与表达载体pTALEN-backbone (Amp+)进行Goldengate反应,完成TALEN表达载体的构建。
[0109](I)将序列确定的质粒 TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7, TALE-N8N2N3N4N9,TALE-N10N2N3N4N11, TALE-Nl2N2N3N4N13,分别 TALE 稀释至 20ng/ul,与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别25个碱基的TALEN表达载体ρΝ1Ν2Ν3Ν4Ν5Ν6Ν2N3N4N7N8N2N3N4N9N10N2N3N4N11N12N2N3N4N13 ；
[0110](2)将序列确定的质粒 TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7, TALE-N8N2N3N4N9,TALE-N10N2N3N4N13分别稀释至20ng/ul，与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别 20 个碱基的 TALEN 表达载体 ρΝ1Ν2Ν3Ν4Ν5Ν6Ν2Ν3Ν4Ν7Ν8Ν2Ν3Ν4Ν9Ν10Ν2Ν3Ν4Ν13 ；
[0111](3)将序列确定的质粒 TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7, TALE-N8N2N3N4N9,TALE-N10N2N3N4N11，TALE-N12N2N14 分别稀释至 20ng/ul，与表达载体 pTALEN-backbone 进行酶切连接，得到可识别23个碱基的TALEN表达载体ρΝ1Ν2Ν3Ν4Ν5Ν6Ν2Ν3Ν4Ν7Ν8Ν2Ν3Ν4Ν9N10N2N3N4N11N12N2N14 ；
[0112](4)将序列确定的质粒 TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7, TALE-N8N2N3N4N9,TALE-N10N2N3N4N11，TALE-Nl2N15 分别稀释至 20ng/ul，与表达载体 pTALEN-backbone 进行酶切连接，得到可识别22个碱基的TALEN表达载体ρΝ1Ν2Ν3Ν4Ν5Ν6Ν2Ν3Ν4Ν7Ν8Ν2Ν3Ν4Ν9Ν10N2N3N4N11N12N15
[0113](5)将序列确定的质粒 TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7, TALE-N8N2N3N4N9,TALE-N10N2N3N4N11, TALE-N16 分别稀释至 20ng/ul，与表达载体 pTALEN-backbone 进行酶切连接，得到可识别21个碱基的TALEN表达载体ρΝ1Ν2Ν3Ν4Ν5Ν6Ν2Ν3Ν4Ν7Ν8Ν2Ν3Ν4Ν9Ν10Ν2N3N4N11N16 ；
[0114]酶切连接体系:将需要进行反应的质粒各取lul，BsaI0.75ul, IOXbufferlul,100XBSA0.lul，dATPlul，T4DNA 连接酶 0.25ul，补足 ddH20 至 IOul ;反应条件为 37°C酶切5min，20°C连接5min，16个循环，80°C灭活20min，取5ul反应产物进行转化，使用Final-F/Final-R引物进行菌落PCR，菌落PCR为阳性的克隆则为目的克隆。
[0115]实施例
[0116]以敲除小鼠Mapkll基因为例，设计TALEN打靶位点，靶点识别序列位于第2个外显子。[0117]左侧TALE 识别的 DNA 序列为 5 ’ TCGCCCACCTTGCAGCTCGGCC
[0118]右侧TALE 识别的 DNA 序列为 5’ TTCTTTACAGCCACCTTCTGGCGC。
[0119]识别T和最后一个碱基的0.5repeat位于骨架载体上，我们只需将中间的序列克隆到骨架载体上。
[0120]根据左侧TALE 识别 DNA 序列(T) CGCCCACCTTGCAGCTCGGC (C),我们可以从第一类五聚体库中拿出TALE-HD1NH2HD3HD4HD5，从第二类五聚体库中拿出质粒TALE-NI6HD2HD3NG4NG7,从第三类五聚体库中拿出质粒TALE-NH8HD2NI3NH4HD9，第四类五聚体库中拿出质粒TALE-NG10HD2NH3NH4HD11，分别将这四个质粒稀释至20ng/u I，与pTALEN-backbone (HD)进行 go Idengate 反应；
[0121]根据右侧TALE 识别 DNA 序列(T) TCTTTACAGCCACCTTCTGGCG (C),我们可以从第一类五聚体库中拿出TALE-NG1HD2NG3NG4NG5，从第二类五聚体库中拿出质粒TALE-NI6HD2NI3NH4HD7,从第三类五聚体库中拿出质粒TALE-HD8NI2HD3HD4NG9，从第四类五聚体库中拿出质粒TALE-NG10HD2NG3NH4NH11，从二聚体库中拿出质粒TALE-HD12NH15，分别将这五个质粒稀释至20ng/ul,与pTALEN-backbone (HD)进行goldengate反应；
[0122]表1Goldengate 反应体系
[0123]
【权利要求】
1.一种TALE聚体库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)TALE 单体扩增:分别以 pTALE-NI，pTALE-NG, pTALE-NH, pTALE-HD 载体为模板，使用引物对TALE-Fn/TALE-Rn进行扩增，分别得到第一类至第十五类单体的混合物和第十六类单体N16，其中，所述η为I至16 ; (2)构建酶切连接产物:分别将所述第一类至第十五类单体进行酶切和连接，得到第一至第八酶切连接产物； (3)酶切连接产物扩增:分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体Ν16为模板，使用引物对attBl-F/attBl-R进行扩增，分别得到第一类至第六类五聚体混合物、三聚体混合物、二聚体混合物和第十六类单体N16扩增产物； (4)TALE聚体克隆:分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物、三聚体、二聚体混合物以及第十六类单体N16扩增产物，与pDonr221载体(Kana+)进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序； (5)TALE聚体库构建:根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。
2.根据权利要求1所述的TALE聚体库的构建方法，其特征在于，所述TALE单体扩增包括如下步骤: 分别以 pTALE-NI，pTALE-NG, pTALE-NH，pTALE-HD 为模板， 使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即Nil，NGl, NHl和 HDl ； 使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2和HD2 ； 使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3和HD3 ； 使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4和HD4 ； 使用TALE-F5/TALE-R5引物对进行扩增，得到第五类单体的混合物，即NI5，NG5，NH5和HD5 ； 使用TALE-F6/TALE-R1引物对进行扩增，得到第六类单体的混合物，即NI6，NG6，NH6和HD6 ； 使用TALE-F5/TALE-R7引物对进行扩增，得到第七类单体的混合物，即NI7，NG7，NH7和HD7 ； 使用TALE-F8/TALE-R1引物对进行扩增，得到第八类单体的混合物，即NI8，NG8，NH8和HD8 ； 使用TALE-F5/TALE-R9引物对进行扩增，得到第九类单体的混合物，即NI9，NG9，NH9和HD9 ； 使用TALE-F10/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十类单体的混合物，即NI10，NG10,NHlO 和 HDlO ； 使用TALE-F5/TALE-R11引物对进行扩增，得到第十一类单体的混合物，即NI11，NG11，NHll 和 HDll ；使用TALE-F12/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十二类单体的混合物，即NI12，NG12，NHl2 和 HD12 ； 使用TALE-F5/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十三类单体的混合物，即NI13，NG13，NHl3 和 HD13 ； 使用TALE-F3/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十四类单体的混合物，即NI14，NG14，NH14 和 HD14 ； 使用TALE-F2/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十五类单体的混合物，即NI15，NG15，NHl5 和 HD15 ； 使用TALE-F1/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十六类单体，即单体NI16，NG16，NH16和HD16，命名为N16。
3.根据权利要求1所述的TALE聚体库的构建方法，其特征在于，所述构建酶切连接产物包括如下步骤: 将第一类、第二类、第三类、第四类和第五类单体混合物进行酶切和连接，得到第一酶切连接产物； 将第六类、第二类、第三类、第四类和第七类单体混合物进行酶切和连接，得到第二酶切连接产物； 将第八类、第二类、第 三类、第四类和第九类单体混合物进行酶切和连接，得到第三酶切连接产物； 将第十类、第二类、第三类、第四类和第十一类单体混合物进行酶切和连接，得到第四酶切连接产物； 将第十二类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第五酶切连接产物； 将第十类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第六酶切连接产物； 将第十二类、第二类、第十四类单体混合物进行酶切和连接，得到第七酶切连接产物； 将第十二类，第十五类单体混合物进行酶切和连接，得到第八酶切连接产物。
4.根据权利要求1所述的TALE聚体库的构建方法，其特征在于，所述酶切连接产物扩增包括如下步骤: 分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体N16为模板，使用引物对attBl-F/attBl-R进行扩增，分别得到第一类五聚体混合物N1N2N3N4N5 ;第二类五聚体混合物N6N2N3N4N7 ;第三类五聚体混合物N8N2N3N4N9 ;第四类五聚体混合物N10N2N3N4N11 ；第五类五聚体混合物N12N2N3N4N13 ;第六类五聚体混合物N10N2N3N4N13 ;三聚体混合物N12N2N14 ;二聚体混合物N12N15以及第十六类单体N16扩增产物。
5.一种使用如权利要求1至4任一所述的TALE聚体库的构建方法构成的TALEN表达载体的构建方法，其特征在于， 从所述的五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库中，分别确定相应的质粒，与表达载体pTALEN-backbone (Amp+)进行Goldengate反应,构建TALEN表达载体，所述的TALE识别序列的长度为20-25个碱基。
【文档编号】C12N15/66GK103789840SQ201410045243
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月7日 优先权日:2014年2月7日
【发明者】王文忠, 施金秀, 张玮, 蒙伟能, 李春园, 温华杰 申请人:赛业（广州）生物科技有限公司