高gc含量或以复杂结构dna为模板的dna片段的重叠延伸pcr法
【专利摘要】高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物所得PCR产物进行等摩尔混合后作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行第二轮PCR反应，得到所需融合的目的基因。本发明为高GC含量DNA片段或以复杂结构DNA片段为模板的DNA片段重叠延伸PCR扩增，提供了有效的方法，解决了扩增中出现弥散带、非特异性条带、易发生突变的问题；具有耗时短、循环数少、操作简单的特点。
【专利说明】高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸
PCR法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重叠延伸PCR方法，具体的说是一种高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法。
【背景技术】
[0002]自 1989 年，重叠 PCR 技术(splicing by overlapping extension PCR, SOE-PCR)被Horton等首次应用于定向诱变和融合基因构建以来，该技术得到了广泛应用。重叠延伸PCR采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。重叠PCR不需要限制性内切酶消化和连接酶处理，同时由于中间无任何目的基因以外的其他序列，可避免因加入连接序列导致的表达蛋白的功能异常。具有简便、高效、快速，易于操作等优点。
[0003]但是我们在重叠延伸PCR构建融合基因的时候，发现针对某些高GC含量和复杂模板的片段有一定难度，如非特异性条带较多，易发生突变和电泳结果出现弥散带等缺点。同时常规重叠延伸PCR也都有PCR耗时较长、循环数偏多、及其过程中需要复杂的纯化步骤，操作比较繁琐等问题需要解决。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是通过对重叠延伸PCR技术的改进，特别是针对某些高GC含量和复杂结构模板的片段的重叠延伸PCR过程中出现的，如非特异性条带较多、易发生突变和电泳结果出现弥散带等问题，`建立一种更有效的构建融合基因的方法。
[0005]高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其具体制备步骤包括:
1、两个DNA小片段的连接，其具体步骤包括:
步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；
步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
[0006]2、三个DNA小片段的连接，其具体步骤包括:
步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；
步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A ；
步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
[0007]本发明高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，还可以用于三个以上小片段的连接。
[0008]有益效果是:本发明改进的重叠延伸PCR方法，针对高GC含量或复杂结构模板的DNA片段扩增，提供了有效的扩增手段；高GC含量或复杂结构模板的DNA片段扩增的过程中，容易较多扩增弥散带、非特异性条带，并且易发生突变；而本发明所提供的方法各个DNA小片段的仅5-8个循环扩增即可作为模板，且第一轮PCR产物不必纯化，直接将PCR产物与外侧引物混合，DNA小片段的完整扩增和片段之间的连接同时进行，从而降低了 PCR循环数，省略了纯化步骤，因而具有耗时短、循环数少、操作简单的特点，由于循环数少因而也提高了保真度高，因而降低了 PCR的工作量，也节省了时间和试剂，通过降低PCR循环数来降低模板浓度以及优化中间引物重叠区长度，因而可以将PCR特别是高GC含量或复杂结构模板PCR扩增弥散带或非特异性条带的加以去除。另外，本发明也适用于改进的重叠延伸PCR方法进行定点突变。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是例I人BTRCP-N基因的RT-PCR扩增电泳`图；其中，泳道I是人BTRCP-N基因的RT-PCR扩增，泳道M是DL2000分子量标准。
[0010]图2是第一轮PCR人CypA和BTRCP-N基因的扩增产物电泳图；其中，泳道I是人BTRCP -CypA基因的非特异性扩增PCR产物，泳道2是人CypA基因的扩增，泳道M是DL2000分子量标准。
[0011]图3是人BTRCP--CypA基因的扩增的PCR产物电泳图；其中，泳道I是SOE-PCR第二轮PCR产物人BTRCP -CypA基因的扩增产物，泳道M是DL2000分子量标准。
[0012]图4是人Cbl-N基因的RT-PCR扩增电泳图；其中，泳道I是人Cbl-N基因的RT-PCR扩增，泳道M是DL2000分子量标准。
[0013]图5是Cbl-Nl、Cbl-N2基因和人CypA片段的PCR扩增电泳图，其中M是DL2000分子量标准；泳道I为Cbl-Nl片段的PCR扩增；泳道2为人CypA片段的PCR扩增；泳道2为Cbl-N2片段的PCR扩增；
图6是人Cbl-CypA基因的特异性扩增的PCR产物电泳图，其中泳道I是SOE-PCR产物人CBl-CypA基因的特异性扩增产物，泳道M是DL2000分子量标准。
【具体实施方式】[0014]1、两个DNA小片段的连接，其具体步骤包括:
步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；
步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
[0015]2、三个DNA小片段的连接，其具体步骤包括:
步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；
步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A ；
步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
[0016]本发明高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，还可以用于三个以上小片段的连接。
[0017]以下实施例如无特殊说明，均为常规实验方法；关于实验材料:HEK-293细胞上海细胞生物学研究所。DMEM培养基购自GIBCO公司；rTaq酶和primestar HS DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNAmarker, I3UCm-T载体购自上海生工生物工程有限公司；引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司操作完成。
[0018]实施例1 BTRCP基因N端部分(该基因起始部分特别是设计引物的部分GC含量偏闻，其基因序列如序列表中序列I所不)和人未环素A (CypA )基因片段(其基因序列如序列表中序列2所示)的连接
步骤一、根据人BTRCP基因全长序列(GenBank登陆号:BC027994.1)，用Premier5.0软件设计三对引物BI和B2, BI和B2r, B3和B4，其中BI和B2用于RT-PCR扩增出BTRCP的N端片段，构建PUCm-BTRCP-N重组质粒；以PUCm-BTRCP-N重组质粒为模板，采用引物BI和B2r，PCR扩增出BTRCP的N端片段；B3和B4扩增CypA片段，各引物序列如表1 ;
【权利要求】
1.高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于:其具体步骤包括: 步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物； 步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
2.如权利要求1所述的高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于:其具体步骤包括: 步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物； 步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A ； 步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需`融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
【文档编号】C12N15/10GK103820430SQ201410045588
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月8日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】孟祥平, 杨建英, 梁高峰, 景爱华, 冯文坡, 乔晓岚 申请人:河南科技大学