鱼鳃细胞系的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种鱼鳃细胞系的建立方法，包括用抗生素水在室温下处理暂养的健康鱼类，用冰水将鱼体麻醉后浸入5%二氯乙醚消毒5min，再用70%乙醇棉球对鱼体表面进行灭菌处理，然后在超净台内将鳃组织切成0.8-1.51mm3的小块，用含有抗生素的Leibovitz’sL-15培养基冲洗3次，接种到含有5mLLeibovitz’sL-15完全培养基的25cm2细胞培养瓶中，放入温度为28°C的培养箱中培养，每隔3-4d换1次完全培养基液；当鳃组织细胞达到95%融合时，按照标准的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶传代培养，如此传代培养至50代，便建立起鱼鳃细胞系。本发明方法使难于培养的鱼鳃细胞得到了顺利培养，能在体外稳定生长并建系成功，可传代超过50代，并能稳定增殖，成为无限细胞系。
【专利说明】鱼鳃细胞系的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于鱼类细胞培养【技术领域】，特别涉及一种鱼鳃细胞系的建立方法。
【背景技术】
[0002]鱼类组织培养及细胞系的发展对于病毒、毒物、致癌物质的分离和细胞生理学、基因表达等具有重要的意义。Wolf和Quimby等(1962)从虹鳟性腺分离培养了第一个鱼类细胞系-RTG-2。迄今为止,该细胞系已经广泛应用于病毒学和毒物学研究。鱼类细胞系已经在鱼类免疫学、毒理学、生态毒理学、内分泌学、病毒性、生物医学研究、疾病防治、生物技术、水产养殖和辐射生物学等领域作出了重要贡献。细胞培养系统还为显带技术的应用提供了最佳的染色体制备方法。鱼类细胞系已经广泛用作病毒性、基因表达和水产毒理学研究的体外模型。此后，开发鱼类细胞系的工作取得了很大进展，细胞系数量大幅增至283个。大多数鱼类细胞系来源于淡水或溯河性鱼类。对鱼类细胞系或细胞培养的知识在发达国家很成熟，但是文献资料显示，中国在这一领域的资料非常有限，特别是在鱼类细胞系的培养方面更加稀少。
[0003]鱼鳃是维持体内平衡的非常重要的器官。鳃上皮细胞有很多功能，包括气体交换、酸碱平衡和离子调节、废物的排泄等。这些功能对水、离子和水通过由三种复杂细胞(呼吸细胞，氯细胞，粘液细胞)构成的上皮从而直接与外界环境进行接触是非常必要的。鳃上皮与水接触时必须要适应外部环境，如温度，溶解氧，pH,或污染物，从而维持或调节其正常功能。许多在体研 究已经表明鱼鳃在遇到环境干扰时的功能及其调节作用。例如，使用探针(抗体，cDNA)或拮抗剂已经证明某些离子转运蛋白参与渗透调节和酸碱调节。然而，由于鱼鳃上皮结构复杂，要想更好地理解鳃的功能，特别是细胞类型及细胞之间的相互作用，进行体外鱼鳃细胞系/的建立或鱼鳃的培养迫在眉睫。
[0004]目前所用的几种鱼鳃体外培养方法都有其各自的优缺点。第一种体外培养方法是分离新鲜的鳃上皮细胞以获得有关呼吸细胞及富含线粒体细胞的离子转运信息。另一种体外培养方法是器官培养系统(分离鳃丝并在培养基中培养f 4 d)。该技术已经有可能测量皮质醇或铜对几种鳃参数的影响。第三种方法是建立了几种鱼鳃细胞系。RTgill-Wl细胞系已经被用于毒理学和病原体试验研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鱼鳃细胞系的建立方法，为鱼类生理学、免疫学、毒理学、生态毒理学、内分泌学、病毒性、生物医学研究等研究提供技术支持和保障。
[0006]本项发明通过下列技术方案完成的。
[0007]本发明的鱼鳃细胞系的建立方法，包括如下步骤:
(1)用含500IU/mL青霉素和500 μ g/mL链霉素的抗生素水在室温下处理暂养的健康鱼类；
(2)将(I)处理的鱼体用冰水麻醉后，浸入5%的二氯乙醚消毒5min，然后用70%乙醇的棉球对鱼体表面进行灭菌处理；
(3)将(2)处理的鱼体放在超净台内，在无菌条件下将鳃组织切成0.8-1.51 mm3的小块，然后用含有抗生素的Leibovitz’ s L-15培养基冲洗3次；
(4)将(3)获得的组织片段接种到含有5mL Leibovitz’s L-15完全培养基的25 cm2细胞培养瓶中，放入温度为28。C的培养箱中培养，每隔3 -4 d换I次完全培养基液；
(5)当(4)的组织细胞达到95%融合时，按照标准的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶传代培养，如此传代培养至50代，便建立起鱼鳃细胞系。
[0008]所述步骤(3)中的抗生素种类及剂量分别为:500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL链霉素和2.5 μ g/mL两性霉素。
[0009]所述步骤(3)中所用的Leibovitz’ s L-15培养基为市购产品。
[0010]所述步骤(4)中所用的Leibovitz’ s L-15完全培养基的组分为:Leibovitz’sL-15培养基，15% (V/V)胎牛血清，500 IU/mL青霉素，500 μ g/mL链霉素，2.5 μ g/mL两性霉素O
[0011]所述步骤(4)中的胎牛血清为市购的灭活胎牛血清。
[0012]所述步骤(5)中所用的胰蛋白酶消化方法中所用的试剂为胰蛋白酶-EDTA溶液磷酸缓冲液，即:0.25%胰蛋白酶和0.0296ETDA。
[0013]本发明具有下列优点和效果:采用本发明的技术方案，对鱼鳃细胞进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了鱼鳃细胞系，使难于培养的鱼鳃细胞得到了顺利培养，能在体外稳定生长并建系成功。所培养的鱼鳃细胞中，由于增殖而进行传代培养，并且让细胞系度过了传代的危机，传代超过50代，并能稳定增殖，成为无限细胞系。从而为鱼类生理学、免疫学、毒理学、生态毒理学、内分泌学、病毒性、生物医学研究等研究提供技术支持和保障。
【具体实施方式】
[0014]本发明的鱼鳃细胞系的建立方法，包括如下步骤:
(1)将实验室驯化的健康鲤鱼幼鱼放在含500IU/mL青霉素和500 μ g/mL链霉素的抗生素处理水中，温度22.0 - 24.0° C ;然后用冰水将幼鱼麻醉后,浸入5%的chlorex消毒5 min,最后用70%乙醇棉球酒精棉球将鱼体表面消毒；
(2)将表面消毒后的幼鱼放入超净台内解剖取鳃，将鳃组织在无菌条件下切成约Imm3的小块，并用含有500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL链霉素和2.5 μ g/mL两性霉素的市购Leibovitz’ s L-15培养液冲洗3次；
(3)制备好Leibovitz’sL-15完全培养基,其组分包括市购市购的Leibovitz’s L-15培养基、15%(V/V)市购的灭活胎牛血清、500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL链霉素和2.5 μ g/mL两性霉素；然后将鲤鱼鳃组织片段接种到含有5 mL Leibovitz’s L_15完全培养基的25cm2细胞培养瓶中，放入温度为28。C的培养箱中培养，每隔3 d或4 (!换I次完全培养基液；当鲤鱼鳃组织的细胞达到95%融合时，按照标准的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶传代培养；其中胰蛋白酶消化方法中所用的试剂为胰蛋白酶-EDTA溶液磷酸缓冲液，即:0.25% 胰蛋白酶和 0.0296ETDA。
[0015](4)如此传代培养至50代，即建立起鱼鳃细胞系。
【权利要求】
1.鱼鳃细胞系的建立方法,包括如下步骤: (1)用含500IU/mL青霉素和500 μ g/mL链霉素的抗生素水在室温下处理暂养的健康鱼类； (2)将(1)处理的鱼体用冰水麻醉后，浸入5%的二氯乙醚消毒5min，然后用70%乙醇的棉球对鱼体表面进行灭菌处理； (3)将(2)处理的鱼体放在超净台内，在无菌条件下将鳃组织切成0.8-1.51 mm3的小块，然后用含有抗生素的Leibovitz’ s L-15培养基冲洗3次； (4)将(3)获得的组织片段接种到含有5mL Leibovitz’s L-15完全培养基的25 cm2细胞培养瓶中，放入温度为28。C的培养箱中培养，每隔3 -4 d换1次完全培养基液； (5)当(4)的组织细胞达到95%融合时，按照标准的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶传代培养，如此传代培养至50代，便建立起鱼鳃细胞系。
2.根据权利要求1所述的鱼鳃细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中的抗生素种类及剂量分别为:500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL链霉素和2.5 μ g/mL两性霉素。
3.根据权利要求1所述的鱼鳃细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中所用的Leibovitz’ s L-15培养基为市购产品。
4.根据权利要求1所述的鱼鳃 细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中所用的Leibovitz’s L-15完全培养基的组分为:Leibovitz’s L-15培养基、15% (V/V)胎牛血清、500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL链霉素和2.5 μ g/mL两性霉素。
5.根据权利要求1所述的鱼鳃细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中的胎牛血清为市购的灭活胎牛血清。
6.根据权利要求1所述的鱼鳃细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(5)中所用的胰蛋白酶消化方法中所用的试剂为胰蛋白酶-EDTA溶液磷酸缓冲液，即:0.25%胰蛋白酶和.0.02%ETDAo
【文档编号】C12N5/071GK103937736SQ201410133077
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】曹谨玲, 陈剑杰, 罗永巨, 王俊东, 李宏全, 宋晶 申请人:山西农业大学