一种用于检测鸡青胫性状连锁snp位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物、试剂盒及检测方法，属于生物检测【技术领域】。本发明针对鸡青胫性状特有的一个SNP位点，在其附近的DNA片段设计引物对P，PCR扩增后对扩增产物进行BamHI酶切，若该突变位点为G，存在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为263bp；若该突变位点为T，不存在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为317bp。与SSCP和直接测序法相比，该检测方法操作简便，成本低、周期短，能大大提高SNP位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验表明该方法能有效判定鸡青胫性状SNP位点的基因型，可用于鸡青胫性状分子标记辅助选择，为青胫鸡群的建立提供有效的分子标记。
【专利说明】-种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物、试 剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，以及包含 该引物的试剂盒，同时还涉及检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，属于生物检测
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着城市卫生的规范管理和环境控制要求的严格，大中城市农贸市场活禽销售量 将逐渐减少，白条鸡和分割鸡形式上市的肉鸡产品份额将不断增加。对于冷鲜鸡市场来说， 优质鸡区别于快大肉鸡的显著标识显得异常重要。我国的地方鸡常具有青胫的特征，因此 人们常常以白条鸡胫色来进行判定，所以青胫鸡在品种的培育中具有重要意义。
[0003] 对于鸡青胫基因位点，青胫鸡分为纯合型和杂合型两种类型。我们在青胫鸡的育 种中需要选育出纯合青胫基因型，来满足的育种需求。因此利用分子生物手段来诊断某个 体在青胫位点的基因型，这对我们育种来说是非常重要和必要的。
[0004] 近年来，人们发展了多种用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有限制性内切 酶片段长度多态性分析（PCR-RFLP)、单链构象多态技术（SSCP)和直接测序技术等，但SSCP 操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术的成本较高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物。
[0006] 同时，本发明还提供一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒。
[0007] 最后，本发明还提供一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法。
[0008] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，包括引物对P :
[0010] 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示），
[0011] 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）。
[0012] 一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，主要包括引物对P :
[0013] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0014] 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
[0015] 具体的，用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，还可以包括2XTaq PCRMaster Mix (含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+及缓冲液）、内切酶 BamHI、IXNEBuffer3. 1 (含NaCl、Mg2+、BSA及缓冲液)、超纯水及DNA Marker等。
[0016] 更具体的，用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，包括：引物对 P20 μ L、2XTaq PCR Master Mix (含 22mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)，55mM KCl，1.65mM MgCl2, 220 μ MdGTP，220 μ M dATP，220 μ M dTTP，220 μ M dCTP，22U 重组 Taq DNA 聚合酶 /ml) lmL、 1(^/^1^内切酶8&111!115(^1^、1\册811打6『3.1(10〇1111似(：1，5〇11111'1^8-!1(：1，1〇11111%(：1 2， 100yg/ml BSA) 200yL、灭菌超纯水 500yL及 DNA Marker (600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp) 30μ L。
[0017] 一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：
[0018] (1)以待检测鸡全基因组DNA为模板，采用引物对P进行PCR扩增，得到扩增片段；
[0019] (2)取扩增片段进行BamHI酶切，酶切产物电泳后根据电泳结果判定鸡青胫基因 型；
[0020] 所述步骤（1)中引物对P为：
[0021] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0022] 下游引物 P-R : 5 ' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3 '。
[0023] 所述步骤（1)中待检测鸡全基因组DNA可采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提 取。
[0024] 所述步骤（1)中PCR扩增的反应体系为：2 X Taq PCR Master Mix6. 25 μ L， ddH204. 25 μ L，P-FO. 5 μ L，P-RO. 5 μ L，DNA 模板 I. 0 μ L。
[0025] 所述的 2XTaq PCR Master Mix 的组分为：22mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)、55mM KC1、 1.65mMMgCl2、220yM dGTP、220yM dATP、220yM (1ΤΤΡ、220μΜ dCTP、22U 重组 Taq DNA 聚 合酶/ml。
[0026] 所述步骤（1)中PCR扩增的反应程序为：95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸20s，35个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0027] 所述步骤（2)中BamHI酶切的反应体系为：步骤（1)的扩增片段10 μ L， IX NEBuffer3. 11. 5μ L, lOU/μ L BamHIO. 5 μ L, ddH203. 0 μ L〇
[0028] 所述的 lXNEBuffer3. 1 的组分为：100mM NaCl、50mM Tris-HClUOmM MgCl2、 100yg/ml BSA。
[0029] 所述步骤（2)中BamHI酶切的反应条件为：温度37°C，酶切时间15min。
[0030] 所述步骤（2)中电泳采用质量浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶。
[0031] 所述步骤（2)中电泳的条件为：电压120V，电泳时间40min。
[0032] 所述步骤（2)中判定鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法为：TT基因型表现为 317bp条带；TG基因型表现为317bp和264bp条带；GG基因型表现为264bp。
[0033] 本发明的有益效果：
[0034] 本发明针对鸡青胫性状特有的一个SNP位点，在其附近的DNA片段设计引物对P， PCR扩增后对扩增产物进行BamHI酶切，若该突变位点为G (如SEQ ID NO. 3所示)，存在 BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为263bp ;若该突变位点为T (如SEQ ID NO. 4所示)，不存在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为317bp。
[0035] 本发明用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒使用方便，便于携带， 可根据PCR产物酶切后片段的电泳结果判定鸡青胫性状的基因型。对于鸡青胫性状连锁 SNP位点为TT的个体，PCR产物酶切前后，片段为317bp ;鸡青胫性状连锁SNP位点为TG的 个体，PCR产物酶切前后，片段为317bp和263bp ;SNP位点为GG的个体，PCR产物酶切前后， 片段为263bp。
[0036] 本发明通过对待测鸡进行翅静脉采血，提取基因组DNA，采用引物对P进行PCR扩 增，对扩增产物进行BamHI37°C酶切15min，酶切产物电泳后根据电泳结果判定SNP位点的 基因型。与SSCP和直接测法相比，本发明建立的分子生物学方法操作更加简便，成本低、周 期短，能大大提高SNP位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验表 明该方法能有效判定鸡青胫性状，可用于鸡青胫性状分子标记辅助选择，为青胫鸡群的建 立提供有效的分子标记。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例3中检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的技术流程示意 图；
[0038] 图2为实施例3中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点的PCR引物位置和扩增产物 中突变位点位置的示意图；
[0039] 图3为实施例3中各样本在鸡青胫性状连锁SNP位点的酶切电泳图。
【具体实施方式】
[0040] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0041] 实施例1
[0042] 本实施例中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，包括引物对P :
[0043] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0044] 下游引物 P-R : 5 ' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3 '。
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，包括：引物对 P20yL、2XTaq PCR Master Mix (含 22mM Tris-HCl(pH8.4)，55mM KCl，1.65mM MgCl2, 220 μ MdGTP，220 μ M dATP，220 μ M dTTP，220 μ M dCTP，22U 重组 Taq DNA 聚合酶 /ml) lmL、 1(^/^1^内切酶8&111!115(^1^、1\册811打6『3.1(10〇1111似(：1，5〇11111'1^8-!1(：1，1〇11111%(：1 2， 100 μ g/ml BSA) 200 μ L、灭菌超纯水 500 μ L 及 DNA Marker (600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp) 30μ L ;
[0047] 所述的引物对P为：
[0048] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0049] 下游引物 P-R : 5，-TTGCTGTTACACCATCATCT-3，。
[0050] 实施例3
[0051] 本实施例中检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的技术流程示意图如图1所示， 具体方法包括以下步骤：
[0052] (1)试样的制备与保存
[0053] 河南农业大学种鸡场固始鸡24只、丝羽乌骨鸡24只、海赛克斯A系24只、丝羽乌 骨鸡与海赛克斯A系正交Fl代24只和反交Fl代24只，翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用蛋 白酶K法提取血液DNA，将DNA样品保存于4°C冰箱保存备用；
[0054] (2 )以待检测鸡全基因组DNA为模板，采用引物对P进行PCR扩增，得到扩增片段；
[0055] 引物对P为：
[0056] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0057] 下游引物 P-R : 5 ' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3 ' ；
[0058] PCR 扩增的反应体系为：12· 5μ L 体系，2XTaq PCR Master Mix (含 22mM Tris-HCl (pH8. 4) ,55mM KCl,1.65mM MgC12,220 yM dGTP,220 yM dATP,220 yM dTTP, 220μMdCTP，22U重组TaqDNA聚合酶/ml)6·25μL，ddH204·25μL，P-F0·5μL，P-R0·5μL， DNA 模板 I. 0 μ L ;
[0059] PCR扩增的反应程序为：95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 2〇8,35个循环；721：延伸1〇1^11;41：保存 ；
[0060] (3)取扩增片段进行BamHI酶切，酶切反应体系为：步骤（2)的扩增片段10 μ L， lXNEBuffer3. I (IOOmM NaCl,50mM Tris-HCl, IOmM MgCl2,100 μ g/ml BSA) I. 5 μ L, IOU/ μ L BamHIO. 5 μ L，ddH203. 0 μ L ;酶切反应条件为：温度37°C，酶切时间15min ;
[0061] (4)取8 μ L PCR扩增后的酶切产物，1. 5%的琼脂糖凝胶电泳（电泳条件为：电压 120V，电泳时间40min)点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱详见图3 (图中编号说明如下： 2?5、7为TT基因型，1、6为TG基因型，8为GG基因型，M为DNA Marker);
[0062] (5)根据电泳图谱中出现的条带的大小判定鸡青胫基因位点的基因型：若只有 263bp的片段，则为黄（白)胫纯合子(表型为黄（白)胫);若只有317bp的片段，则为青胫纯合 子(表型为青胫）；若既有263bp又有317bp的片段，则为青胫杂合子(表型为青黄（白）胫）； 试验结果如下表1所示。
[0063] 表1待测鸡在青胫位点的判型结果
[0064]
【权利要求】
1. 一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，其特征在于：包括引物对P : 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'， 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
2. -种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于：主要包括引 物对P : 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'， 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
3. 根据权利要求2所述的用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，其 特征在于：还包括2XTaq PCR Master Mix、内切酶BamHI、lXNEBuffer3.1、超纯水及 DNAMarker 〇
4. 根据权利要求3所述的用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，其特 征在于：包括引物对 P20yL、2XTaq PCR Master MixlmL、10U/yL 内切酶 BamHI50yL、 1 XNEBuffer3. 1200 μ L、灭菌超纯水 500 μ L 及 DNA Marker30 μ L。
5. -种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 以待检测鸡全基因组DNA为模板，采用引物对P进行PCR扩增，得到扩增片段； (2) 取扩增片段进行BamHI酶切，酶切产物电泳后根据电泳结果判定鸡青胫基因型； 所述步骤（1)中引物对P为： 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'， 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
6. 根据权利要求5所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，其特征在于： 所述步骤（1)中 PCR 扩增的反应体系为：2XTaq PCR Master Mix6. 25μ L，ddH204. 25 μ L， P-FO. 5 μ L，P-RO. 5 μ L，DNA 模板 1· 0 μ L。
7. 根据权利要求6所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，其特征在于： 所述步骤（1)中PCR扩增的反应程序为：95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s， 72°〇延伸2〇8,35个循环；721：延伸1〇1^11;41：保存。
8. 根据权利要求5所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，其特 征在于：所述步骤（2)中BamHI酶切的反应体系为：步骤（1)的扩增片段10yL， lXNEBuffer3. 11. 5μ L, lOU/μ L BamHIO. 5μ L, ddH203. 0μ L〇
9. 根据权利要求8所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，其特征在于： 所述步骤（2)中BamHI酶切的反应条件为：温度37°C，酶切时间15min。
10. 根据权利要求5所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，其特征在于： 所述步骤（2)中判定鸡青胫基因型的方法为：TT基因型表现为317bp条带；TG基因型表现 为317bp和264bp条带；GG基因型表现为264bp。
【文档编号】C12Q1/68GK104293905SQ201410145047
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】康相涛, 杨朋坤, 蒋瑞瑞, 韩瑞丽, 李转见, 任俊晓, 王顺红, 田亚东, 刘小军, 孙桂荣, 李国喜, 闫峰宾, 王彦彬 申请人:河南农业大学