与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术和医学【技术领域】，提供了一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物，该标志物为miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p和miR-150-5p的组合。还提供了一种上述miRNA标志物的引物。还提供了一种上述miRNA标志物在制备直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。还提供了一种直肠癌早期诊断试剂盒。本发明提供的与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p对结直肠癌进行早期筛查具有操作简单、高特异性、高灵敏性的特点。
【专利说明】与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医学【技术领域】，特别涉及一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物对直肠癌早期筛查的应用。
【背景技术】
[0002]结直肠癌是第三常见的恶性疾病和癌症致死的第二主要原因。就如其他恶性疾病一样，基因因素是导致结直肠癌形成的重要原因，但是，只有20%的结直肠癌病例可以追溯到家族性基因变异。事实上，大部分的散发性结直肠癌和环境因素密切相关，最常见的抑癌基因APC的突变导致了 Apc/GSK3 β /Axin复合物的破坏，从而激活了 Wnt/ β -catenin信号转导通路。Wnt/ β -catenin信号转导通路的异常激活不仅促进小肠上皮细胞的增殖，也抑制了其向腺窝底部的迁移 和凋亡。典型的“结直肠癌发生的基因途径”已经被充分的研究，环境因素导致结直肠癌发生的最新机制和慢性炎症有关，称为肠炎相关性结直肠癌(CAC)。近几年来随着中国人的饮食和生活方式的改变，结直肠癌的发生率迅速增高，而且大部分的结直肠癌病例和慢性肠炎相关。临床上已经发现，肠炎相关性结直肠癌往往伴随着慢性肠炎疾病，例如克罗恩病，溃疡性肠炎。流行病学和临床研究表明，在伴随慢性肠炎30年后，溃疡性肠炎增加了 18-20%的肠炎相关性结直肠癌的发病率，而克罗恩病增加了 8%的发病率。在小鼠模型中，注射致癌物azoxymethane (AOM)和慢性肠炎诱导物DSS会导致多发的肠肿瘤，但是如果没有炎症的存在，则需要注射多倍剂量的AOM并需要更长时间才能导致肿瘤的形成。这些临床和实验结果表明，CAC是典型的炎症致癌。但是，不像Apc/Wnt/β -catenin信号转导通路，肠炎相关的结肠直肠癌的发病机制，特别是肠炎恶性转变的机制尚不清楚，主要是因为缺少动态研究的合适模型。小肠上皮组织的杯状细胞能够分泌一层黏液蛋白，这层黏液蛋白能够保护上皮组织免受机械的和化学的损伤，以及炎症因素的损害。这种黏液蛋白主要是由Muc2基因所编码。已有研究表明，杯状细胞的减少和Muc2的表达降低在溃疡性肠炎和结直肠癌中非常常见。MUC2对于维持肠道稳态非常重要，将小鼠的Muc2基因敲除后，肠上皮细胞的增殖、迁移和凋亡都发生了改变，最重要的是，Muc2敲除小鼠能够自发地导致小肠、大肠和直肠肿瘤的发生。而研究发现肿瘤的发生与慢性炎症相关,与Wnt/ β-catenin信号通路无关。Muc2敲除引起的炎症促进了 Apc突变小鼠的肿瘤发生，而且在Muc2敲除小鼠中，周期依赖性激酶抑制物P21WAF1的表达降低促进了肿瘤的形成。我们更深入的研究发现，Muc2敲除小鼠在出生后3个月以内会自发形成慢性肠炎，其组织病理特点与人的溃疡性肠炎类似。在3个月之后，Muc2-/-小鼠会形成结肠和直肠肿瘤。因此，3个月可能是慢性肠炎发展为结直肠癌的关键时间点。所以Muc2-/-小鼠可以作为一种动态研究慢性肠炎恶性转变形成结直肠癌的理想模型。为了揭示肠炎恶性转变的分子机制，我们分离了 Muc2-/_小鼠的肠上皮细胞来做miRNA，我们在肠炎恶性转变的关键时间点发现了一些异常表达的miRNA。我们在人的肠炎和结直肠癌组织中对上述的一些miRNA做了验证，有趣的是，这些表达降低的miRNA在小鼠组织中同样表达降低，并且和一些细胞因子的表达增高相关，这些发现预示着表观改变可能在肠炎恶性转变中起着重要的作用。
【发明内容】
[0003]针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物和试剂盒。
[0004]为实现上述目的，本发明提供一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物，该标志物为 miR-138-5p、miR-145_5p、miR-146a_5p 和 miR-150_5p 的组合。以上四种 miRNA在Muc2-/_小鼠模型的慢性肠炎恶性转变过程中表达明显降低，在人肠炎组织及结直肠癌组织中表达也明显降低，说明其与慢性肠炎恶性转变密切相关。
[0005]本发明还提供一种上述miRNA标志物的引物，该引物为:
[0006]miR-138-5p 的正向引物序列为:5’ -TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3’，如 SEQ ID NO:1所示；
[0007]miR-145-5p 的 正向引物序列为:5’-GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’，如 SEQ ID NO:2 所示；
[0008]miR-146a-5p 的正向引物序列为:5’ -TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’，如 SEQ ID NO:3所示；
[0009]miR-150-5p 的正向引物序列为:5’-CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA_3’，如 SEQ ID NO:4所示；
[0010]通用反向引物序列为:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3，，如 SEQ ID NO: 5 所示。
[0011 ] 本发明还提供一种上述miRNA标志物在制备直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。具体地，通过检测被试者结直肠组织中的四种miRNA的含量，并与正常水平相比较来对患者的病情发展做出预判，以此来指导临床治疗。在一个特定的实施方案中，使用定量PCR的方法来检测被试者结直肠组织中的四种miRNA含量。
[0012]优选的，上述miRNA标志物的引物在制备直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。
[0013]本发明还提供一种直肠癌早期诊断试剂盒，试剂盒含有上述miRNA标志物的引物。
[0014]优选的，该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。
[0015]优选的，该试剂盒包括组织总RNA提取试剂、总RNAWpoly(A)试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂。
[0016]优选的，所述RT-PCR试剂中包括RT-引物:
[0017]hsa-miR-138:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT-3’ ；
[0018]hsa-miR-145:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT-3’ ；
[0019]hsa-miR-146a:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA-3，；
[0020]hsa-miR-150:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG-3’ ；
[0021]内参 SN0RD44:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTagtcag_3，；
[0022]所述定量PCR试剂中包括序列:
[0023]通用反向引物:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3，；
[0024]通用Taqman 探针:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAATTT/3 IABkFQ。[0025]本发明的有益效果:
[0026]本发明提供的与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物miR-138_5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p对结直肠癌进行早期筛查具有操作简单、高特异性、高灵敏性的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1 Muc2_/_小鼠肠上皮miRNA array聚类分析结果；
[0028]图2 Muc2+/+和Muc2-/_小鼠的肠上皮细胞因子表达水平；
[0029]图3在Muc2+/+和Muc2-/_小鼠的肠上皮细胞中验证差异表达的miRNA ；
[0030]图4 miR-138-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；
[0031]图5 miR-145-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；
[0032]图6 miR-146a-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；
[0033]图1 miR-150-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；
[0034]图8 miR-138-5p在6对结肠炎组织中的表达水平；
[0035]图9 miR-145-5p在6对结肠炎组织中的表达水平；
[0036]图10 miR-146a-5p在6对结肠炎组织中的表达水平；
[0037]图11 miR-150-5p在6对结肠炎组织中的表达水平。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039]实施例1结肠炎相关的癌模型Muc2基因敲除小鼠结肠上皮细胞中miRNA表达谱
[0040]小鼠的肠上皮细胞的收集:选择3月龄的Muc2+/+和Muc2-/_，每组包括四只小鼠，将小鼠处死，取结肠洗净，纵向剖开，各取一段置于20ml冰PBS ;将组织移入37°C 15mMEDTA30ml中；37°C振荡，220rpm, 30min,充分振荡，去除肠组织；4°C离心5000rpm, 5min ;先弃去上清，5ml冷PBS重悬细胞,分装于1.5mlEP管中；4°C离心,3000rpm, 5min ;弃去上清，EP管开盖置于液氮中；取出后开盖置于_80°C过夜,次日将EP管盖上。
[0041]总RNA的提取:按照操作手册用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取总RNA0
[0042]miRNA array(表达谱):实验操作由芝加哥大学基因研究所实施。
[0043]聚类分析结果如图1所示:21个miRNA下调,70个miRNA上调(changefold>2or<0.5 ；T<0.01,p value<0.05, q value<0.05)。
[0044]实施例2Muc2小鼠结肠上皮细胞中细胞因子的表达、差异表达miRNA的验证
[0045]小鼠结肠上皮细胞RNA提取与实施例1中方法相同；
[0046]利用qRT-PCR检测细胞因子mRNA表达水平，反应体系:正向引物(20μπι)0.15 μ 1，反向引物(20μL?)0.15μ l，cDNA0.7μ 1，Η209 μ 1，荧光染料 SYBR Green (2X) 10 μ I ;反应条件:50°C 2min，95°C 2min ;变性 95°C 15sec，退火 / 延伸 60°C lmin，共 40 个循环。
[0047]细胞因子mRNA表达水平如图2所示:与对照相比，Muc2_/_小鼠的结肠上皮细胞中几种细胞因子IL-6、COX-2、IL-10、TNF α、IL-1 β表达水平明显上升。
[0048] IL-6:[0049]正向引物:TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，
[0050]反向引物:TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；
[0051]COX-2:
[0052]正向引物:TGAGCAACTATTCCAAACCAGC，
[0053]反向引物:GCACGTAGTCTTCGATCACTATC；
[0054]IL-10:
[0055]正向引物:GCTCTTACTGACTGGCATGAG，
[0056]反向引物:CGCAGCTCTAGGAGCATGTG；
[0057]IL-1 β:
[0058]正向引物:GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，
[0059]反向引物:ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；
[0060]TNF α:
[0061]正向引物:CCCTCACA CTCAGATCATCTTCT，
[0062]反向引物:GCTACGACGTGGGCTACAG；
[0063]IKK β:
[0064]正向引物:CTGAAGATCGCCTGTAGCAAA，
[0065]反向引物:TCCATCTGTAACCAGCTCCAG；
[0066]GAPDH:
[0067]正向引物:TCTGGAAAGCTGTGGCGTGAT，
[0068]反向引物:GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG。
[0069]为了验证小鼠miRNA array的结果，选择15个miRNA利用荧光定量PCR技术来验证，如图 3 所不:mmu_miR-146a、mmu-miR-138、mmu-miR-5123、mmu_miR-196b、mmu-miR-5099、mmu-miR-150、mmu-miR-145、mmu_miR-27a、mmu_miR-23a 表达下调；mmu-miR-705、mmu-miR-760_3p、mmu-miR-1962、mmu_miR-669c、mmu-miR-3104_5p、mmu-miR-5132表达上调,突光定量PCR的结果与miRNA array的结果一致。
[0070]mmu-miR-146a-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA ；
[0071 ]定量正向引物:TTCGGTGAGAACTGAATTCCA ；
[0072]mmu-miR-138-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT ；
[0073]定量正向引物:TGGAGCTGGTGTTGTGAATC；
[0074]mmu-miR-5123 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACACC ；
[0075]定量正向引物:TGGTGTAGATCCATATGCCAT；
[0076]mmu-miR-196b-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCAAC ；
[0077]定量正向引物:TTCGGTAGGTAGTTTCCTGTT；
[0078]mmu-miR-5099 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAGCA ；[0079]定量正向引物:TGTCGGTTAGATCGATGTGG；
[0080]mmu-miR-150-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG ；
[0081 ]定量正向引物:CGGTCTCCCAACCCTTGTA ；
[0082]mmu-miR-145a-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT ；
[0083]定量正向引物:GGGTCCAGITTTCCCAGGA；
[0084]mmu-miR-27a-3p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGGAA ；
[0085]定量正向引物:TTCGGTTCACAGTGGCTAAG；
[0086]mmu-miR-23a-3p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAAAT ；
[0087]定量正向引物:TCGGATCACATTGCCAGGG；
[0088]mmu-miR-705 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCCCAC ；
[0089]定量正向引物: TGGGGTGGGAGGTGGGG；
[0090]mmu-miR-760-3p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCCAC ；
[0091 ]定量正向引物:CGGCGGCTCTGGGTCTG ；
[0092]mmu-miR-1962 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTATGTGT ；
[0093]定量正向引物:TGAGAGGCTGGCACTGGG；
[0094]mmu-miR-669c-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACACAC ；
[0095]定量正向引物:TTCGGATAGTTGTGTGTGGAT；
[0096]mmu-miR-3104-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGAGGG ；
[0097]定量正向引物:TAGGGGGCAGGAGCCGGAG；
[0098]mmu-miR-5132-5p 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCTGAG ；
[0099]定量正向引物:GGGCGTGGGGTGGTGGA；
[0100]内参 snoRNA202 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAAITITITITITTCATCAG ；
[0101 ]定量正向引物:GTACTTTTGAACCCTTTTCCAT ；
[0102]定量通用反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT；
[0103]定量通用Taqman 探针:56_FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAITT/3 IABkFQ。
[0104]实施例3人结肠癌组织标本收集
[0105]16对结直肠癌组织、6对结肠肠炎组织及其配对正常组织皆从新乡医学院第一附属医院和新乡医学院附属中心医院收集，标本储存于-80°C环境中。[0106]实施例4RNA提取
[0107]按照操作手册步骤用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取冰冻的结肠癌及其邻近正常结肠组织的 RNA。用 A-Plus? Poly(A) Polymerase Tailing Kit (CELLSCRIPT,INC)按操作手册对miRNA进行加polyA。
[0108]实施例5通过qRT-PCR对四个miRNA表达水平进行检测
[0109]为了检测来自结肠癌模型鼠中差异表达的miRNA是否有临床意义，我们选择了四个miRNA:即miR-138、miR-145、miR-146a、miR-150，在临床病人标本中进行验证。
[0110]使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo SCIE NTIFIC, USA)按操作手册对加poly (A)的miRNA进行逆转录。
[0111]使用实时荧光定量PCR (Applied Biosystem Inc.)对miRNA进行定量分析。定量的反应体系:GoTaq Hot Start Colorless Master MixlO μ I,上游引物 0.4 μ I,下游引物0.4 μ I,probe0.5 μ I, diluted cDNA2 μ I, RNase-free water6.7 μ I。反应条件:95°C 2min ；变性95°C 10s，退火/延伸60°C 30s，共40个循环。
[0112]所使用的引物如下 :
[0113]hsa-miR-138 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT ；hsa-miR-138 定量正向引物:TGGAGCTGGTGTTGTGAATC。
[0114]hsa-miR-145 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT ；hsa-miR-145 定量正向引物:GGGTCCAGITTTCCCAGGA。
[0115]hsa-miR-146a 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA ；hsa-miR-146a 定量正向引物:TTCGGTGAGAACTGAATTCCA
[0116]hsa-miR-150 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG ；hsa-miR-150 定量正向引物:CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA
[0117]内参 SN0RD44 逆转录引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAAITITITITITTagtcag ;内参 SN0RD44 定量正向引物:TGGCCTGGATGATGATAAGCA。
[0118]定量通用反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT；
[0119]定量通用Taqman 探针:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAITT/3 IABkFQ。
[0120]结肠癌组织与癌旁正常组织中4个miRNA的表达结果如图4_7所示:与正常组织相比，16个癌组织中miR-138、miR-145、miR_146a、miR-150的总体表达水平分别减少了
3.37,3.39,2.56,4.99 倍(Ρ〈0.001)。16 个癌组织中 miR-138 和 miR-150 的表达都是降低的，15个癌组织中miR-145和miR_146a的表达是降低的。
[0121]结肠炎组织与正常结肠组织中4个miRNA的差异表达结果如图8_11所示:这4个miRNAs在人的结肠炎组织中的表达也是下调的，因此，这几个miRNA可能参与结肠炎的恶性转化。
[0122]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p 和 miR-150_5p 的组合。
2.一种如权利要求1所述的miRNA标志物的引物，其特征在于，该引物为: miR-138-5p 的正向引物序列为:5’ -TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3’ ； miR-145-5p 的正向引物序列为:5’ -GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’ ； miR-146a-5p 的正向引物序列为:5’ -TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’ ； miR-150-5p 的正向引物序列为:5’ -CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA-3’ ； 通用反向引物序列为:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
3.权利要求1所述的miRNA标志物在制备直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的miRNA标志物的引物在制备直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。
5.一种直肠癌早期诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒含有权利要求2所述的miRNA标志物的引物。
6.根据权利要 求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试 剂。
【文档编号】C12N15/11GK103966328SQ201410191812
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】鲍永华, 杨万才, 郭永臣, 李泽信, 薛会朝, 朱绍辉, 徐红伟, 游焜, 韩荣飞, 贾慧婕, 李凯, 王倩 申请人:新乡医学院