miRNA在心肌纤维化疾病治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，所述miRNA序列为SEQ?ID1、SEQ?ID2、SEQ?ID3、SEQ?ID4、SEQ?ID5或SEQID6。尤其是将不同人源miRNA-19b序列与非人源miRNA-19b混合应用，即将人源miRNA-19b序列SEQ?ID1或SEQ?ID2，与非人源miRNA-19b序列SEQ?ID3、SEQ?ID4、SEQ?ID5以及SEQ?ID6中的一种或多种进行混合，对于在治疗心肌纤维化疾病中的应用，取得了显著的效果。
【专利说明】miRNA在心肌纤维化疾病治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学专业领域，涉及miRNA、miRNA的前体RNA、miRNA反义寡核苷酸序列及其表达载体，及其在诊断和治疗心肌纤维化疾病中的应用。
【背景技术】
[0002]心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我国居民的死亡谱中，心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，并且每年另有数以万计的人因患该病导致残疾。该病种类繁多、病因复杂。其中，由中、重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄所引起心肌纤维持续性和/或反复加重的缺血缺氧将导致心肌纤维化疾病。在该疾病的早期，左心室舒张功能受损。任其发展将由于心室重塑致心肌正常结构丧失，最终使心室收缩功能也受损，从而导致心功能不全。心肌纤维化疾病发展过程中，心肌组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，现认为心肌纤维化与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关[Jessup M and Brozena S:Heart fai lure.N Engl J Med2003 ；348:2007-2018 ；Swynghedauw B:Molecular mechanisms of myocardial remodeling.Phys1l Revl999 ；79:215-262.]。
[0003]细胞外基 质蛋白(ECM)在心肌组织内的积累是心肌纤维化的主要特征，而结缔组织生长因子(CTGF)已被确定为ECM的强力诱导因子[Koitabashi N，et al !Increasedconnective tissue growth factor relative to brain natriuretic peptide as adeterminant of myocardial fibrosis.[J]Hypertens1n2007 ；49:1120-1127 ；TsoutsmanT，et al:CCN2plays a key role in extracellular matrix gene express1n in severehypertrophic card1myopathy and heart failure.[J]J Mol Cell Card1l.2013 ；62C:164-178 ;ChenMM，et al:CTGF express1n is induced by TGF-beta in cardiac fibroblastsand cardiac myocytes:a potential role in heart fibrosis.[J] J Mol Cell Card1l2000 ；32:1805-1819.]。多项研究结果表明，心脏衰竭过程中，CTGF积极参与了血管紧张素IKAng II)诱导的心肌纤维化进程。因此，CTGF的表达在心肌纤维化所导致的多种心血管疾病中起及其重要作用[Finckenberg P，et al:Ang1tensin II induces connectivetissue growth factor gene express1n via calcineurin-dependent pathways.[J]Am J Pathol2003 ；163:355-366 ；Ahmed MS，et al:Connective tissue growth factor—anovel mediator of ang1tens in ΙΙ—stimulated cardiac fibroblast activat1n inheart failure in rats.[J] J Mol Cell Card1l2004 ；36:393-404 ；Sopel MJ, et al:Treatment with activated protein C(aPC)is protective during the development ofmyocardial fibrosis:an ang1tensin II infus1n model in mice.[J]PloS one2012 ；7:e45663 ；Matsui Y and Sadoshima J:Rapid upregulat1n of CTGF in cardiac myocytes byhypertrophic stimuli:implicat1n for cardiac fibrosis and hypertrophy.[J]J MolCell Card1l2004 ；37:477-481 ；He Z，et al:Differentiai regulat1n of ang1tensinΙΙ—induced express1n of connective tissue growth factor by protein kinase Cisoforms in the myocardium.[J] J B1l Chem2005 ；280:15719-15726.]。
[0004]心血管疾病发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多，严重威胁人类的生命和健康。因此，世界各国对心脑血管疾病的研究、预防及治疗均十分重视。在心脏纤维化疾病的治疗过程中，如何能有效的降低CTGF在心肌组织结构中表达量，进而减少ECM在在心肌组织内的积累、降低心脏组织中胶原浓度，将成为治疗心脏纤维化所导致的多种心血管疾病的关键。
[0005]微小RNAOniRNA或microRNA)是一种长度为18~25个核苷酸单链的内源性非编码性小RNA，是由前体在酶的加工下生成，前体的序列一般为70~120个核苷酸。通过与靶基因序列特异性相互作用在转录水平调苄基因表达，参与多种生物学过程，进化过程保守。最初发现的内源性miRNA是lin24和let27，它们参与基因表达转录后调节，通过与靶mRNA的3’端非编码区或编码区(3’ -UTR)相结合而发挥负性调节作用。近年来已经鉴定出超过400种miRNA,但仍有很多种尚未被发现[Berezikov E, Thuemmler F, van LaakeLff, et al.Diversity of microRNAs in human and chimpanzee brain [J].Nat Genet, 2006,38(12):1375-1377.]。对miRNA空间表达的系统性分析表明，很多miRNAs以组织特异性方式表达[ffienholds E, KloostermanffP, Miska E, et al.MicroRNA express1n in zebrafishembryonic development [J].Science, 2005, 309 (5732):310-311.]。每一种 miRNA 可以定位于很多种mRNA，使其转录抑制或降解，因此很多种转录子可能受到miRNA的精细调节，使转录-翻译系统有效运转，进而细胞得以快速而有效地控制阈值依赖性的细胞事件。目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程如生长发育、器官形成、造血、细胞增殖与凋亡、应激反应和肿瘤生成等。
[0006]最初科学 家们发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，对肿瘤抑制基因起作用的miRNA下降或者缺失会导致肿瘤的发生。已发现的的miRNA与肺癌、乳腺癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病等多种癌症密切相关。2006年末，科学家开始注意到miRNA在心脏疾病发生发展过程中所起的重要作用[Van Rooij E, Sutherland LB, L iu N, et al.A signaturepattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heartfailure [J].PNAS，2006，103:18255-18260.]，并在心律失常、心力衰竭等疾病的研究中取得了一系列重要进展，使miRNA成为国际心血管研究领域的热点。
[0007]心血管疾病相关miRNA的发现可能对该疾病的相关基因治疗产生重大的影响。通过对心血管疾病患者和正常人群的miRNA差异表达分析，可以鉴定得到相关的敏感miRNA，进而通过引入特异性的miRNA互补的反义核苷酸抑制或者通过病毒载体或质粒载体过表达的方法，调控相关miRNA或其前体的表达量，从而达到治疗心血管疾病的目的。因此，发现特异性表达的miRNA对于心血管疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于通过体外实验发现miRNA_19b的一种新用途。
[0009]本发明提供miRNA-19b作为制备治疗心肌纤维化疾病的药物治疗应用。
[0010]具体的说，本发明所提供的人源miRNA_19b (has-miR_19b)和鼠源miRNA-19b (mmu-miR-19b 和 rno_miR-19b)均包含如下序列:[0011]5，-UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA-3，(SEQ ID7)。
[0012]本发明所提供的人源miRNA-19b的前体RNA有2种，包含如下序列:
[0013]hsa-mir-19b-l(M10000074):
[0014]5，-CACUGUUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUGUGAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUAGUG-3’ (SEQ IDl)
[0015]hsa-mir-19b-2(M10000075):
[0016]5，-ACAUUGCUACUUACAAUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCAGCGUAUAUAUGUAUAUGUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGAUAAUGU-3，(SEQ ID 2)
[0017]本发明所提供的小鼠鼠源miRNA_19b的前体RNA有2种，包含如下序列:
[0018]mmu-mi r~19b~1(M10000718):
[0019]5， -CACUGGUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUAUAAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUGGUG-3’ (SEQ ID3)
[0020]mmu-mir~19b~2(M10000546)
[0021 ] 5，-ACUUACGAUUAGUUUUGCAGAUUUGCAGUUCAGCGUAUAUGUGAAUAUAUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGGGA-3’ (SEQ ID4)
[0022]本发明所提供的大鼠鼠源miRNA-19b的前体RNA有2种，包含如下序列:
[0023]rno-mir-19b-l(M10000847)
[0024]5， -CACUGGUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUAUAAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUGGUG-3’ (SEQ ID5)
[0025]rno-mir-19b-2(M10000848)
[0026]5，-ACAUUGCUACUUACGGUUAGUUUUGCAGAUUUGCAGUUCAGCGUAUAUGUGGAUAUAUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGAUGAUGU-3，(SEQ I D6)
[0027]本发明所提供的人源miRNA_19b (has-miRNA_19b),鼠源 miRNA_19b (mmu-miR-19b和rno-miR-19b)的反义寡核苷酸均包含如下序列:
[0028]5’ -UCAGUUUUGCAUGGAUUUGCACA-3’ (SEQ ID8)
[0029]本发明所提供的人源miRNA-19b的前体hsa-mir-19b_l在人染色体上定位于13q31.3，前体 hsa-mir-19b_2 定位于人染色体 Xq26.2。
[0030]本发明以新生SD大鼠的心肌细胞为材料进行miRNA分子的克隆分析。采用常规分子生物学技术，从细胞和组织中提取总RNA，经过特意性的引物进行反转录和PCR扩增。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明，miRNA_19b在血管紧张素诱导的心肌纤维化病理状态下其表达量明显降低；运用特异性合成的miRNA-19b前体RNA增加细胞内miRNA_19b的表达，能有效的降低结缔组织生长因子(CTGF)在心肌组织结构中表达量。
[0031]患有心肌纤维化疾病的病人，由于CTGF在心肌组织结构中表达量增高，心脏组织中胶原浓度含量极高。在该疾病的早期，左心室舒张功能受损。任其发展将最终使心室收缩功能也受损，从而导致心功能不全。在血管紧张素诱导的心肌纤维化病理状态下，miRNA-19b在心肌细胞中的表达量明显降低，用这一特征性的表现可以将其作为诊断心肌纤维化的指征；由于miRNA-19b对于心肌组织结构中CTGF的表达量有着明显的调节作用，因此能够运用病毒载体或质粒载体过表达的方法，将病人心肌细胞中的miRNA-19b表达量增加，将能有效的抑制CTGF在心肌细胞中的表达，进而降低心脏组织中胶原浓度，这将有效的延缓心肌纤维化的病理进程，控制心肌纤维化病情的发展，从而达到治疗目的。miRNA-19b这一功能的发现对于心肌纤维化等心血管疾病的诊断和治疗都有着极其重要的意义。
[0032]本发明将人源miRNA-19b序列SEQ IDl和SEQ ID2,或非人源miRNA_19b序列SEQID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6，单独或混合添加于含有血管紧张素(AngII)的心肌细胞培养液中，本发明的序列能显著抑制结缔组织生长因子(CTGF)在心肌细胞中的表达量，尤其是将优选将不同人源miRNA-19b序列与非人源miRNA_19b混合应用，更是取得了惊人的效果。
[0033]根据本发明，提供了一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，其特征在于，所述 miRNA 是 miRNA-19b。
[0034]如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选所述miRNA的来源于人、小鼠或大鼠。
[0035]如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选所述miRNA序列为 SEQIDU SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6。
[0036]如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选将不同人源miRNA-19b序列与非人源miRNA-19b混合应用，即将人源miRNA-19b序列SEQ IDl或SEQID2，与非人源miRNA-19b序列SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种或多种进行混
八
口 ο
[0037]如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选在所述的混合miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQID2的含有比例为10%~90%。
[0038]如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，更优选在所述的混合miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQ ID2的含有比例为30%~70%。
[0039]本发明还提供了一种制备治疗或诊断心肌纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体和有效量的miRNA序列SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQID4、SEQID5以及SEQ ID6中的一种或多种。
[0040]一种制备治疗或诊断心肌纤维化疾病的药物组合物，优选将人源miRNA-19b序列SEQ IDl 或 SEQ ID2，与非人源 miRNA_19b 序列 SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 以及 SEQ ID6 中的一种或多种进行混合。
[0041]本发明还提供了治疗或诊断心肌纤维化疾病的探针，其特征在于所述探针的序列为 SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6 的互补序列。
[0042]本发明还提供一种治疗或诊断心肌纤维化疾病的试剂盒，其特征在于，其特征在于含有序列为 SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6 的探针。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1.血管紧张素(AngII)诱导心肌细胞纤维化的过程中，miR_19b的表达明显降低；血管紧张素抑制剂替米沙坦(Telmisartan)可以阻断AngII作用，维持miR_19b表达水平。*:p<0.05，与对照组相比有统计学意义[0044]图2.AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，CTGF的mRNA表达明显增高。AngII抑制剂Telmisartan可以阻断AngII作用，维持CTGF的mRNA表达水平。A qRT-PCR检测CTGF的mRNA表达量；B琼脂糖凝胶电泳检测CTGF的mRNA表达量。*:p<0.05，与对照组相比有统计学意义
[0045]图3.AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，CTGF的蛋白表达水平明显增高。AngII抑制剂Telmisartan可以阻断AngII作用，维持CTGF的蛋白表达水平。A.Western-blot检测心肌细胞内CTGF的蛋白表达；B.灰度分析定量Western-blot检测CTGF结果。*:p<0.05，与对照组相比有统计学意义
[0046]图4.A.miR-19b与CTGF mRNA的3’非编码区(3，-UTR)结合位点分析。B.转染miR-19b前体(pre_miR-19b)可以明显增加心肌细胞内miR_19b的表达水平。*:p〈0.05,与对照组相比有统计学意义
[0047]图5.转染miR-19b前体(pre_miR-19b)可以明显降低心肌细胞内CTGF mRNA的表达水平。A.qRT-PCR检测CTGF的mRNA表达量；B.琼脂糖凝胶电泳检测CTGF的mRNA表达量。*:D<0.05，与对照组相比有统计学意义
[0048]图6.AngII诱导心肌细胞纤维化过程中，pre_miR-19b可以有效的降低心肌细胞内CTGF的mRNA表达水平。*:p<0.05，与对照组相比有统计学意义
[0049]图7.AngII诱导心肌细胞纤维化过程中,pre_miR-19b可以有效的降低CTGF的蛋白表达水平。A.Western-blot检测不同状态下心肌细胞内CTGF的蛋白表达量；B.灰度分析定量Western-b1t检测CTGF表达结果。*:p<0.05,与对照组相比有统计学意义 【具体实施方式】
[0050]以下通过实施例对本发明作进一步阐述。
[0051]本发明所公开的RNA序列均能够以人工合成的方法或其它生物学方法获得。
[0052]实施例1
[0053]新生大鼠心肌细胞培养及心肌细胞总RNA和总蛋白抽提
[0054]1.原代培养新生大鼠心肌细胞
[0055]1.1取新生1-3天的大鼠心脏置于预冷的Hanks平衡盐溶液(HBSS, Invitrogen)中。
[0056]1.2分离心室下端大约1/3位置的心肌组织，将其用手术剪切成小块。
[0057]1.3 将小块心肌组织放入 5mL 含有 75U/mL col lagenase II (Worthington)的消化溶液中37°C孵育20分钟后收集消化液并加入新鲜的消化溶液继续消化。该消化过程重复6次。
[0058]1.4细胞283g离心5分钟之后用含有10%胎牛血清，I %抗生素的DMEM-F12细胞培养液(1:1，Invitrogen)重悬。
[0059]1.5在细胞培养盘上培养细胞I小时，运用差速贴壁的方法分离非心肌细胞。没有贴壁的细胞用DMEM-F12细胞培养液培养在预包被Gelatin (Invitrogen)的培养瓶中。
[0060]1.6心肌细胞将在此含有0.1%牛血清白蛋白的DMEM-F12培养液中48小时内贴壁。
[0061]2.细胞总 RNA 提取(TRIzol 法)[0062]2.1.收获细胞1-5X107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
[0063]2.2.加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2min。
[0064]2.3.于预冷的4°C离心机中12000g离心15分钟。取上清。
[0065]2.4.加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置1min。
[0066]2.5.于预冷的4°C离心机中12000g离心10分钟。弃上清。
[0067]2.6.加入lml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。于预冷的4°C离心机中7500g离心10分钟，弃上清。
[0068]2.7.晾干，加入适量的 DEPC H2O 溶解(65°C促溶 10_15min)。测定 0D260 和 0D280
值，初步断定RNA质量。
[0069]2.8.总RNA提取采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。
[0070]3.细胞总蛋白提取(RIPA裂解法)
[0071]3.1.从贴壁细胞培养板中小心吸去培养液。
[0072]3.2.预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心吸去PBS。
[0073]3.3.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA裂解液(Iml裂解液中加入5 μ I蛋白酶抑制剂混合液，5 μ IPMSF和5 μ I磷酸酶抑制剂混合液)。
[0074]3.4.细胞培养板中加入预冷的含抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上5分钟。
[0075]3.5.用一预冷的细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。
[0076]3.6.裂解液于预冷的离心机中14000g，4°C离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
[0077]实施例2
[0078]miR-19b前体(pre-mir_19b)转染心肌细胞及血管紧张素Ang II刺激诱导心肌细胞纤维化
[0079]1.pre-mir-19b转染心肌细胞后总RNA和总蛋白的提取
[0080]1.1细胞接种于24孔培养板，每孔细胞数4X 104。
[0081]1.2 将 Iul 的转染试剂 siPORT NeoFX (AM4510, Amb1n)和 25ul 的 OPT1-MEM I 培养液(Invitrogen)混合放置于室温孵育10分钟。
[0082]1.3 将 pre-mir-19b (AM17100, Amb1n)用 0ΡΤΙ-ΜΕΜ I 培养液(Invitrogen)稀释，两者混匀后放置于室温孵育10分钟。运用无功能的miRNA序列pre-miR?-NegativeControl (AM17110, Amb1n)处理细胞作为对照组(Control)。
[0083]1.4混匀稀释好的pre-mir-19b和转染试剂，放置于室温孵育10分钟使其形成转染复合物。
[0084]1.5将含有转染复合物的培养液加入细胞培养板，与细胞共同孵育48小时。
[0085]1.6收集细胞总RNA，具体方法参照实施例1。
[0086]1.7收集细胞总蛋白，具体方法参照实施例1。
[0087]2.血管紧张素Ang II刺激诱导心肌细胞纤维化
[0088]2.1细胞接种于24孔培养板，每孔细胞数4X 104。[0089]2.2细胞用ΙΟμπι替米沙坦(Telmisartan, Abeam)预处理30分钟后加入含有10nM血管紧张素AngII (Sigma)的细胞培养液中培养48小时。将未预处理组和常规培养液培养组细胞作为对照组。
[0090]2.3收集细胞总RNA，具体方法参照实施例1中第2部分。
[0091]2.4收集细胞总蛋白，具体方法参照实施例1中第3部分。
[0092]实施例3
[0093]分析心肌细胞内miRNA_19b和CTGF的表达量
[0094]1.qRT-PCR检测心肌细胞内miRNA_19b和CTGF mRNA的表达量。
[0095]1.1以收集的心肌细胞总RNA作为模板，用miR_19b特异性的mirVana qRT-PCR引物(Amb1n)扩增miR-19b基因。使用实时TaqMan miRNA分析检测试剂盒(ABI)进行定量PCR检测细胞内miR-19b的表达量，运用U6snRNA基因作为检测的内参。详细操作原理和方法见试剂盒说明书。
[0096]1.2以收集的心肌细胞总RNA作为模板，用CTGF基因特异性的PCR引物扩增CTGF的mRNA，使用实时定 内参。PCR的产物用I %的琼脂糖凝胶电泳进行可视化和定量分析。详细操作原理和方法见试剂盒说明书。
[0097]2.ffestern-blott ing分析心肌细胞中CTGF蛋白表达水平
[0098]2.1以收集心肌细胞总蛋白进行Western-b1t检测CTGF蛋白表达量。等量的大约30μ g总蛋白用10%聚丙烯酰胺凝胶(B1-Rad)进行200伏特，2小时的电泳后电转至PVDF 膜上(Millipore).[0099]2.25%的牛血清白蛋白室温条件下封闭I小时。
[0100]2.3 加入特异性的 CTGF(1: 500 稀释，Santa Cruz)and GAPDH(I: 5000 稀释，Sigma) 一抗抗体,在4°C条件下孵育过夜。
[0101]2.4用含有1%的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分钟。
[0102]2.5加入特异性针对一抗的二抗，室温条件下孵育I小时。
[0103]2.6用含有I %的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分钟。
[0104]2.7加入ECL荧光显影液试剂(Thermo)，用x光胶片感光显影。
[0105]2.8运用ImageJ软件进行影像条带的灰度定量分析。
[0106]实施例4
[0107]MiRNA结合位点分析
[0108]运用生物信息学TargetScan 程序(http: //www.targetscan.0rg)分析预测miR-19b 与 CTGF mRNA 的 3’ -UTR 结合位点。
[0109]实施例5
[0110]统计学处理
[0111]所有数据以均数土标准差(?土 SD)表示，两样本之间比较用t检验，以p〈0.05具
有统计学意义。每个实验至少重复3次。
[0112]实验例
[0113]按照实施例2中的实验方法,将本发明的替代pre-mir-19b(AM17100,Amb1n),加入所培养的心肌细胞中，如表1所示的实验例及对照例，分别测定心肌细胞内CTGF蛋白表达量，其结果如表1所示，其中，将本发明的各rniR-19b序列配制成10ng/ml的溶液，在实验例7至实验例46中，个混合miR-19b序列溶液的总量为1y I。
[0114]本发明所取得的具体效果:
[0115]1.血管紧张素AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，miR_19b的表达明显降低；血管紧张素抑制剂替米沙坦(Telmisartan)可以部分阻断AngII作用，维持miR_19b表达水平(图1)。该结果提示:心肌纤维化过程中，miR-19b表达量将发生明显的降低；阻断外界致病因素作用将能有效的维持miR-19b的表达水平。检测心肌细胞内miR-19b的表达量的方法可以作为诊断心肌纤维化疾病的指针。
[0116]2.血管紧张素AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，CTGF的表达明显增高；用Telmisartan阻断AngII作用可以维持CTGF的表达水平。CTGF无论是在mRNA水平或者蛋白质水平均表现出相对一致的变化趋势(图2和图3)。该结果表明:CTGF的表达增高与心肌纤维化疾病的发生存在一定程度的相关性。
[0117]3.生物信息学研究结果显示:CTGF mRNA的3’非编码区(3’ -UTR)存在有特异性miR-19b抑制性结合位点。转染miR-19b前体(pre_miR-19b)可以明显增加心肌细胞内miR-19b的表达水平。(图4)。该结果表明:有可能通过调控细胞内miR-19b的表达水平来改变CTGF的表达。
[0118]4.通过转染pre-miR_1 9b增加心肌细胞内miR_19b的表达水平可以明显降低心肌细胞内CTGF的表达水平。(图5)。
[0119]5.无论是在mRNA水平或者蛋白质水平，转染miRNA-19b的前体pre-miR-19b都可以降低心肌细胞内CTGF的表达水平，有效的抑制由血管紧张素AngII诱导的心肌细胞纤维化，在一定程度上消除纤维化对心肌细胞功能的影响，达到治疗的作用(图6和图7)。
[0120]6.在各种不同条件下培养的心肌细胞中，CTGF蛋白的表达量如表1所示，结果显示本发明的 SEQ IDU SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 和 SEQ ID6 均能抑制 CTGF 蛋白质的表达,将人源miRNA-19b序列SEQ IDl或SEQ ID2,与非人源miRNA_19b序列SEQ ID3、SEQID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种(或多种)进行混合，其抑制效果更为明显。
[0121]表1.各实验例和对照例中CTGF蛋白的表达量(任意单位)
[0122]
【权利要求】
1.一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，其特征在于，所述miRNA是miRNA-19b。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于， 所述miRNA的来源于人、小鼠或大鼠。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述 miRNA 序列为 SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQID4、SEQ ID5 或 SEQ ID 6。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于， 将不同人源miRNA-19b序列与非人源miRNA_19b混合应用，SP 将人源miRNA-19b 序列 SEQ IDl 或 SEQ ID2，与非人源miRNA_19b 序列 SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种或多种进行混合。
5.根据权利要求4所述的应用，其中， 在所述的混合miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQ ID2的含有比例为10%~90%。
6.根据权利要求4所述的应用，其中， 在所述的混合miRNA- 19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQID2的含有比例为30%~70%。
7.一种制备治疗或诊断心肌纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体和有效量的 miRNA 序列 SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 以及 SEQ ID6中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，将人源miRNA-19b序列SEQIDl或SEQ ID2，与非人源 miRNA-19b 序列 SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 以及 SEQ ID6 中的一种或多种进行混合。
9.一种治疗或诊断心肌纤维化疾病的探针，其特征在于所述探针的序列为SEQ IDUSEQID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6 的互补序列。
10.一种治疗或诊断心肌纤维化疾病的试剂盒，其特征在于含有如权利要求9所述的探针。
【文档编号】C12N15/11GK104031987SQ201410196658
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】聂瑛洁, 高松, 池洪杰, 陈辉, 安宇 申请人:贵州省人民医院