用于鉴定琉球螫蝇的dna条形码标准基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因及应用。该用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。可将该用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因应用于鉴定待检标本是否为琉球螫蝇。该DNA条形码标准基因的应用，实现了对蛹、幼虫等非成虫态、残缺不全的虫体以及成虫的快速鉴定；且克服了现有技术中的如下不足之处：对非成虫态需要培养，耗时较长；对残缺不全的虫体基本上不能检测；对成虫的检测需要对琉球螫蝇形态非常熟悉的专业人员。
【专利说明】用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基 因及应用。
【背景技术】
[0002] 目前在国际范围内对昆虫的种类鉴定主要是依据成虫的形态学特征。相近种类 昆虫的幼虫、蛹、卵等非成虫态的虫体形态特征差异小，有些特征在不同的发育时期不够稳 定，根据非成虫态的虫体形态学特征进行种类鉴定很难确保其准确性，并且需要鉴定者具 有非常丰富的分类学知识和经验，因此昆虫的非成虫虫态的鉴定一直是一个技术难题。在 口岸检疫工作中，如果截获的是幼虫、卵、蛹等非成虫虫态，通常需要将其培养成成虫后再 进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周，而对于肢体残缺的样本更是无计可施，大大加 长了通关周期，影响贸易的往来。
[0003] 近代分子生物学技术的兴起，为古老的昆虫分类学科注入了新的活力。在昆虫学 研究领域，分子生物学技术主要应用于系统演化及分类鉴定两方面。昆虫系统演化的研究 是从分子水平上找出其种间的DNA序列的特异性差异，主要目的为探索昆虫种、属间的相 对亲缘关系，同时也为昆虫的分子鉴定奠定了基础。
[0004] DNA条形码（Barcoding)是一种近几年刚刚兴起的新技术，它的原理是利用基因 组DNA上一段标准的或者大家公认的基因片段，作为分子靶标来进行种级水平的物种鉴 定。用于条形码技术的DNA片段要具备以下两个特点：一是与整个基因组DNA相比要短得 多；二是非常容易获得。线粒体C0I基因在细胞内的拷贝数高，获得技术简单，而且序列 非常保守，在物种内不同个体之间只有1-2%的差异，而近缘种间的差异大，非常适合作为 DNA条形码技术的分子标记。
[0005] DNA条形码技术为物种的鉴定提供了新的手段，弥补了传统形态分类的诸多不足。 尤其适用于难以用形态分类特征进行鉴定的幼虫、卵、蛹等非成虫虫态。利用分子标记进行 种类鉴定国际上已有不少的尝试，国际上第一篇用DNA条形码技术进行种类鉴定的文章发 表于2003年（Hebert，2003)，按照DNA条形码的定义，序列相似度大于98%时，可以判断为 同一种类。Ball等（2005)用DNA条形码鉴别了 70多种水生蜉蝣，游中华等（2007)用线粒 体C0I鉴别了入侵害虫西花蓟马及其他8种常见蓟马。岳巧云等（2010)直接将DNA条形 码技术应用于未知昆虫幼虫种类的鉴定，达到了预期的效果。
[0006] 但由于目前DNA条形码数据库中种类不全，缺乏多个物种的标准DNA条形码参考 序列，致使DNA条形码鉴定技术达不到实际应用的目的。
[0007] 琉球螫蝇（Stomoxys uruma)是一种常见的、重要的的医学媒介生物，主要分布于 日本、印度、泰国等国。在中国大部分地区也有分布，常滋生于食草家畜粪中。其携带和传 播多种致病微生物，是重要的检疫对象。但在检疫过程中截获的标本往往是以蛹、幼虫等各 种非成虫虫态出现，以及残缺不全的虫体，通常需要在实验室内将其培养成成虫后再进行 鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周，而对于肢体残缺的样本更是无计可施，大大加长了 通关周期，影响贸易的往来。
【发明内容】
[0008] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于鉴定琉球螫蝇 的DNA条形码标准基因。
[0009] 本发明的另一目的在于提供所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的 应用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准 基因，核苷酸序列（658bp)如下所示：
[0011] TACATTATATTTTATCTTCGGAGCATGATCAGGAATAGTAGGAACTTCTCTTAGAATTTTAATTCGAGC TGAATTAGGACATCCTGGAGCACTAATTGGTGATGATCAAATCTATAATGTAATTGTTACTGCACATGCTTTCATTA TAATTTTTTTTATAGTTATGCCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCCTTTAATATTAGGAGCTCCT GATATAGCTTTTCCCCGAATAAATAATATAAGTTTTTGATTACTCCCTCCTGCTCTTACTCTTTTATTAGTCAGTAG AATAGTAGAAAAGGGAGCTGGAACTGGATGAACGGTATACCCCCCATTATCTTCTAATATTGCACATGGAGGAGCTT CTGTTGATTTAGCAATTTTTTCATTACATTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGAGCTGTAAATTTTATTACAACT GTAATTAATATACGAGCTACAGGTATTACATTTGATCGAATACCTTTATTTGTTTGATCTGTTGTAATTACTGCTTT ATTACTTTTATTATCTCTTCCTGTTTTAGCTGGTGCAATTACTATATTATTAACAGATCGAAATTTAAATACCTCTT TTTTTGATCCAGCTGGAGGTGGAGATCCAATTTTATATCAACATTTATTT ；
[0012] 所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因可应用于鉴定待检标本是否为 琉球螫蝇；
[0013] 所述的待检标本包括蛹、幼虫等各种非成虫虫态、残缺不全的虫体以及成虫；
[0014] 所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因在应用时，可将该用于鉴定琉球 螫蝇的DNA条形码标准基因与载体构建成重组载体；
[0015] 所述的载体优选为克隆载体，更优选为T-VeCt〇r(T载体）；
[0016] 一种鉴定琉球螫蝇的分子生物学方法，包括如下步骤：
[0017] (1)提取待检标本的DNA ;
[0018] (2)使用如下引物进行PCR，得到PCR产物；
[0019] 正向引物 Leo 1490 :5 ' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 ' ；
[0020] 反向引物 Hco2198 :5 ' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ' ；
[0021] (3)将PCR产物进行电泳分析；如果能扩增出目的条带，则提取该目的条带中的 产物进行测序；如果扩增出的产物没有目的条带，则能排除该待检标本为琉球螫蝇的可能 性；
[0022] (4)测序得到的结果与用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的同源性在98% 以上时，则能判断待检标本为琉球螫蝇；
[0023] 步骤（1)中所述的待检标本包括蛹、幼虫等各种非成虫虫态、残缺不全的虫体以 及成虫；
[0024] 步骤（1)中所述的提取待检标本的DNA可通过基因组DNA提取试剂盒进行提取；
[0025] 步骤（2)中所述的PCR的条件优选为：94 °C变性5min ;94 °C 40S、54 °C 40S、 72°C lmin，29 个循环；72°C延伸 lOmin ;
[0026] 步骤⑵中所述的PCR的体系优选为：5倍Phusion HF缓冲液10 μ 1，lOmM dNTPs 1 μ 1，正向引物 Lcol490 (20 μ mol/L) 1 μ 1，反向引物 Hco2198 (20 μ mol/L) 1 μ 1，Phusion 超 保真DNA聚合酶0. 5μ 1，基因组DNA 2μ 1，用ddH20补足50μ 1 ;
[0027] 步骤（2)中所述的PCR在进行时优选设置阴性对照和阳性对照，避免假阴性和假 阳性结果；
[0028] 所述的阳性对照为上述用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因或含有上述用 于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的序列；
[0029] 所述的含有上述用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的序列优选为将该用 于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因与载体构建得到的重组载体；
[0030] 所述的载体优选为克隆载体，更优选为T-vect〇r(T载体）；
[0031] 步骤（3)中所述的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯胺凝胶电泳，优选为琼脂糖 凝胶电泳，更优选为浓度为质量百分比1%的琼脂糖凝胶电泳；
[0032] 步骤（3)中所述的目的条带为在DNAMarker (分子标记）700bp条带位置的电泳 带，或是与阳性对照同一位置的电泳带。
[0033] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0034] (1)本发明提供了一种用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因。该DNA条形码 标准基因的应用，实现了对蛹、幼虫等非成虫态、残缺不全的虫体以及成虫的快速鉴定。克 服了现有技术中的如下不足之处：对非成虫态需要培养，耗时较长；对残缺不全的虫体基 本上不能检测；对成虫的检测需要对琉球螫蝇形态非常熟悉的专业人员。
[0035] (2)本发明提供的PCR反应体系和反应条件，重复性高，经多次试验稳定性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1是琉球螫蝇的幼虫和蛹的C0I片段的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道Μ为DNA 标准分子量标，泳道1为阴性对照，泳道2为幼虫，泳道3为蛹，泳道4为阳性对照。
[0037] 图2是特异性检测结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道Μ为DNA标准分子量标， 泳道1为阴性对照，泳道2为厩螫蝇，泳道3为家蝇，泳道4为白头亚麻蝇，泳道5为阳性对 照。
[0038] 图3是待检标本幼虫的检测结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道Μ为DNA标准分 子量标，泳道1为阴性对照，泳道2为幼虫，泳道3为阳性对照。
[0039] 图4是待检标本幼虫的检测结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道Μ为DNA标准分 子量标，泳道1为阴性对照，泳道2为幼虫，泳道3为阳性对照。
[0040] 图5是待检标本蛹的检测结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道Μ为DNA标准分子 量标，泳道1为阴性对照，泳道2为蛹，泳道3为阳性对照。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0042] 实施例1
[0043] 用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的获得
[0044] 将在安徽巢湖采集的琉球螫蝇成虫标本（按"范滋德.中国常见蝇类检索表[Μ]. 科学出版社，1992, 316"进行鉴定）经形态学方法准确鉴定后，交于中山大学生命科学学院 复核鉴定。在鉴定无误后，从新鲜标本右侧后腿从股节处取下，用基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)，按试剂盒说明书纯化得到其基因组DNA。以得到的基因组DNA 为模板，经PCR(反应体系为：5倍Phusion HF缓冲液10 μ 1，10mM dNTPs 1 μ 1，20 μ Μ正反 引物（正向引物 Leo 1490 :5 ' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 ' ；反向引物 Hco2198 :5 ' -ΤΑΑ ACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'）各 1 μ 1，Phusion? 超保真DNA聚合酶（NEB 公司）0· 5μ 1， 基因组 DNA 2μ 1，用 ddH20 补足 50μ 1。98°C 变性 30S ;98°C 10S、65°C 30S、72°C lmin，30 个 循环；72°C延伸2min。反应结束后加入0. 5 μ 1 Taq-聚合酶在PCR产物末端加上Ploy-A 尾巴，将得到的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，将条带位置在700bp的电泳带纯 化，纯化试剂盒为天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANgel Midi Purification Kit DP 209-02)，按操作说明书进行纯化。将纯化得到的片段克隆到质粒pGM-T (pGM-T连接试 剂盒，天根生化科技（北京有限公司），编号为VT202-02,按说明书操作），得到重组载体 pGMT-COI，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（按《分子克隆》制备）后，涂布于含l〇〇mg/L 氨苄的LB平板。先用引物Lc〇1490和Hc〇2198进行菌落PCR，将筛选得到的阳性克隆送交 上海英潍捷基公司进行测序，将测序得到的序列在NCBI中进行BLAST，确定得到的是C0I片 段，具体序列如下所示 ：
[0045] GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGTACATTATATTTTATCTTCGGAGCATGATCAGGAATAGTAGGAA CTTCTCTTAGAATTTTAATTCGAGCTGAATTAGGACATCCTGGAGCACTAATTGGTGATGATCAAATCTATAATGTA ATTGTTACTGCACATGCTTTCATTATAATTTTTTTTATAGTTATGCCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATT AGTTCCTTTAATATTAGGAGCTCCTGATATAGCTTTTCCCCGAATAAATAATATAAGTTTTTGATTACTCCCTCCTG CTCTTACTCTTTTATTAGTCAGTAGAATAGTAGAAAAGGGAGCTGGAACTGGATGAACGGTATACCCCCCATTATCT TCTAATATTGCACATGGAGGAGCTTCTGTTGATTTAGCAATTTTTTCATTACATTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTT AGGAGCTGTAAATTTTATTACAACTGTAATTAATATACGAGCTACAGGTATTACATTTGATCGAATACCTTTATTTG TTTGATCTGTTGTAATTACTGCTTTATTACTTTTATTATCTCTTCCTGTTTTAGCTGGTGCAATTACTATATTATTA ACAGATCGAAATTTAAATACCTCTTTTTTTGATCCAGCTGGAGGTGGAGATCCAATTTTATATCAACATTTATTTTG ATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTA。
[0046] C0I片段的序列长度为709bp，划横线部分为引物部分。
[0047] 实施例2
[0048] 对确定为琉球螫蝇的非成虫形态的标本进行鉴定
[0049] 将饲养的琉球螫蝇的幼虫和蛹提取基因组DNA (TIANamp Genomic DNA Kit)。同实 施例1的操作，进行PCR，同时设置阴性对照（反应体系中不含模板，水代替为模板）和阳性 对照（成虫的基因组DNA，实施例1制备）。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，可见在幼虫 和蛹亦能成功扩增得到C0I片段。将扩增得到的C0I片段克隆至pGMT载体后，测序得到的 结果表明：幼虫的序列与成虫的DNA条形码标准基因相似度为99. 85%;蛹的序列与成虫的 DNA条形码标准基因相似度为100%。
[0050] 实施例3
[0051] 特异性的检测
[0052] 分别取与琉球螫蝇同属的厩螫蝇（在安徽巢湖采集，按"范滋德.中国常见蝇类检 索表[Μ].科学出版社，1992,316"进行形态学鉴定）、同科的家蝇（在广东中山采集，按"范 滋德，姜泰京.中国常见蝇类检索表[Μ].科学出版社，1992,274"进行形态学鉴定）、不同 科但同目的白头亚麻蝇（在广东惠州采集，按"范滋德，陈之梓.中国常见蝇类检索表[Μ]. 科学出版社，1992, 706"进行形态学鉴定），且都委托中山大学生命科学学院进行鉴定复核。 同实施例1操作，PCR时设置阴性对照（反应体系中不含模板，水代替为模板）和阳性对照 (成虫的基因组DNA，实施例1制备）。1%琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。测序后和实施 例1提供的DNA条形码标准基因对比，相似性分别为，厩螫蝇为93. 92%，家蝇为87. 39%， 白头亚麻蝇为85. 71%。
[0053] 实施例4
[0054] 对从安徽巢湖采集回的幼虫标本进行形态学鉴定，发现其形态学特征与实施例5 中的幼虫相似，查阅检索表发现无法鉴定到种，故采用DNA条形码技术对其进行检测。
[0055] 同实施例1操作，PCR时设置阴性对照（反应体系中不含模板，水代替为模板）和 阳性对照（成虫的基因组DNA，实施例1制备）。1%琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。测序 后和实施例1提供的DNA条形码标准基因对比，相似性为99. 70%，判断为琉球螫蝇的幼虫。
[0056] 将采集回剩余的幼虫置于合适的环境中饲养，等长成成虫后对其进行形态学鉴 定，且经中山大学生命科学院复核鉴定后确认是琉球螫蝇。
[0057] 实施例5
[0058] 对从安徽巢湖采集回的幼虫标本进行形态学鉴定，发现其形态学特征与实施例4 中的幼虫相似，查阅检索表发现无法鉴定到种，故采用DNA条形码技术对其进行检测
[0059] 同实施例1操作。1 %琼脂糖凝胶电泳图如图4所示。测序后和实施例1提供的 DNA条形码标准基因对比，相似性为93. 92%，判断为不是琉球螫蝇的幼虫。
[0060] 将采集回剩余的幼虫置于合适的环境中饲养，等长成成虫后对其进行形态学鉴 定，且经中山大学生命科学院复核鉴定后确认是厩螫蝇。
[0061] 实施例6
[0062] 从安徽巢湖采集回的蛹标本无法直接通过形态学方法进行鉴定，同样采用DNA条 形码技术检测。
[0063] 同实施例2操作。1%琼脂糖凝胶电泳图如图5所示。测序后和实施例1提供的 DNA条形码标准基因对比，相似性为100%，判断为琉球螫蝇的蛹。
[0064] 将采集回的新鲜的蛹置于合适的环境中饲养，等长成成虫后对其进行形态学鉴 定。经鉴定且经中山大学生命科学院复核鉴定后确认是琉球螫蝇。
[0065] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0001] _说 明书序 列 表_ SEQUENCE LISTING <110〉岳，巧云 <120〉用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因及应用 <130〉 1 <160> 4 <170> Patentln version 3.2 <210〉 1 <211> 658 <212> DNA <213〉琉球螫蝶 <400〉 1 tacattatat tttatcttcg gagcatgatc aggaatagta ggaacttctc ttagaatttt 60 aattcgagct gaattaggac atcctggagc actaattggt gatgatcaaa tctataatgt 120 aattgttact gcacatgctt tcattataat tttttttata gttatgccta ttataattgg 180 aggatttgga aattgattag ttcctttaat attaggagct cctgatatag cttttccccg 240 aataaataat ataagttttt gattactccc tcctgctctt actcttttat tagtcagtag 300 aatagtagaa aagggagctg gaactggatg aacggtatac cccccattat cttctaatat 360 tgcacatgga ggagcttctg ttgatttagc aattttttca ttacatttag caggaatttc 420 ttcaatttta ggagctgtaa attttattac aactgtaatt aatatacgag ctacaggtat 480 tacatttgat cgaatacctt tatttgtttg atctgttgta attactgctt tattactttt 540 attatctctt cctgttttag ctggtgcaat tactatatta ttaacagatc gaaatttaaa 600 tacctctttt tttgatccag ctggaggtgg agatccaatt ttatatcaac atttattt 658 <210〉 2 <211〉 25 <212〉 DNA <213> artificial sequence <220〉 <223〉正向引物Lcol490
[0002] <400> 2 ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25 <210> 3 <211〉 26 <212〉 DNA <213> artificial sequence <220〉 <223〉反向引物Hco2198 <400> 3 t￡i￡i&cttcag ggtg&ccaaa aaatca 26 <210> 4 <211〉 709 <212> DNA <213〉琉球螫蝇 <400> 4 ggtcaacaaa tcataaagat attggtacat tatattttat cttcggagca tgatcaggaa 60 tagtaggaac ttctcttaga attttaattc gagctgaatt aggacatcct ggagcactaa 120 ttggtgatga tcaaatctat aatgtaattg ttactgcaca tgctttcatt ataatttttt 180 ttatagttat gcctattata attggaggat ttggaaattg attagttcct ttaatattag 240 gagctcctga tatagctttt ccccgaataa ataatataag tttttgatta ctccctcctg 300 ctcttactct tttattagtc agtagaatag tagaaaaggg agctggaact ggatgaacgg 360 tatacccccc attatcttct aatattgcac atggaggagc ttctgttgat ttagcaattt 420 tttcattaca tttagcagga atttcttcaa ttttaggagc tgtaaatttt attacaactg 480 taattaatat acgagctaca ggtattacat ttgatcgaat acctttattt gtttgatctg 540 ttgtaattac tgctttatta cttttattat ctcttcctgt tttagctggt gcaattacta 600 tattattaac agatcgaaat ttaaatacct ctttttttga tccagctgga ggtggagatc 660 caattttata tcaacattta ttttgatttt ttggtcaccc tgaagttta 709
【权利要求】
1. 一种用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因，其特征在于：所述用于鉴定琉球螫 蝇的DNA条形码标准基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因在鉴定待检标本中的应 用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的待检标本为非成虫虫态、残缺不全 的虫体或成虫。
4. 一种重组载体，其特征在于：将权利要求1所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码 标准基因与载体构建得到。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的载体为克隆载体。
6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述的载体为T载体。
7. -种鉴定琉球螫蝇的分子生物学方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 提取待检标本的DNA ; (2) 使用如下引物进行PCR，得到PCR产物； 正向引物 Lcol490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ； 反向引物 Hco2198 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' ； (3) 将PCR产物进行电泳分析；如果能扩增出目的条带，则提取该目的条带中的产物进 行测序；如果扩增出的产物没有目的条带，则能排除该待检标本为琉球螫蝇的可能性； (4) 测序得到的结果与权利要求1所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的 同源性在98%以上时，则能判断待检标本为琉球螫蝇。
8. 根据权利要求7所述的鉴定琉球螫蝇的分子生物学方法，其特征在于：步骤（1)中 所述的所述的待检标本为非成虫虫态、残缺不全的虫体或成虫。
9. 根据权利要求7所述的鉴定琉球螫蝇的分子生物学方法，其特征在于：步骤（2)中 所述的 PCR 的条件为：94°C变性 5min ;94°C 40S、54°C 40S、72°C lmin，29 个循环；72°C延伸 lOmin ； 步骤⑵中所述的PCR的体系为：5倍Phusion HF缓冲液10μ l，10mM dNTPs 1μ 1，浓 度为20ymol/L的正向引物Ιχο1490() 1 μ 1，浓度为20ymol/L的反向引物Hco2198 1μ 1， Phusion超保真DNA聚合酶0. 5μ 1，基因组DNA2y 1，用ddH20补足50μ 1 ; 步骤（2)中所述的PCR在进行时设置阴性对照和阳性对照； 所述的阳性对照为权利要求1所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因或含有 权利要求1所述的用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的序列； 步骤（3)中所述的目的条带为在DNA Marker700bp条带位置的电泳带，或是与阳性对 照同一位置的电泳带。
10. 根据权利要求9所述的鉴定琉球螫蝇的分子生物学方法，其特征在于：所述的含有 用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标准基因的序列为将该用于鉴定琉球螫蝇的DNA条形码标 准基因与载体构建得到的重组载体。
【文档编号】C12N15/11GK104120121SQ201410200211
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】岳巧云, 陈健, 邱德义, 魏晓雅, 胡佳, 刘德星, 吴可量 申请人:岳巧云