用于生产(+)-客烯的方法

用于生产(+)-客烯的方法
【专利摘要】本发明提供一种用于生产(+)-客烯的方法，所述方法包含将至少一种多肽与法呢基焦磷酸酯(FPP)接触。特别是，所述方法可以在体外或体内进行以产生(+)-客烯，其是一种可以用作各种在香料和调味料领域中非常有用的化合物的前体的化合物。本发明还提供可用于本发明方法的多肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸和含有所述核酸的表达载体也是本发明的一部分。本发明的另一个目的是一种经转化以在生产(+)-客烯的方法中使用的非人宿主生物体或细胞。
【专利说明】用于生产(+)-客烯的方法
[0001]本发明是2010年5月12日申请的发明名称为“用于生产(+)_客烯的方法”的第201080022036.X号发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明提供一种生产(+)_客烯(zizaene)的方法，所述方法包含将至少一种多肽与法呢基焦磷酸酯(FPP)接触。特别是，所述方法可以在体外或体内进行以产生(+)_客烯，其是一种可以用作在香料和调味料领域中非常有用的多种化合物的前体的化合物。本发明还提供可用于本发明方法的多肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸和含有所述核酸的表达载体也是本发明的一部分。本发明的另一个目的是一种经转化以在生产(+)_客烯的方法中使用的非人宿主生物体或细胞。
【背景技术】
[0003]在大多数生物 体(微生物、动物和植物)中发现有萜。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元组成，并按其结构之中存在的这些单元的数目来进行划分。因此单萜、倍半萜和双萜分别是包含10、15和20个碳原子的萜。例如，倍半萜广泛见于植物界。许多倍半萜分子因它们的风味和香味性质以及它们的美容、医药和抗菌效果而众所周知。已经鉴定出了超过300多种倍半萜烃类和3000多种倍半萜化合物，并且每年都鉴定出许多新的结构。将通过不同方式如蒸汽蒸馏或溶剂萃取获得的植物提取物用作萜源。萜分子往往原样使用，但是有时候使用化学反应将该萜转化成其它的高价值分子。
[0004]萜的生物合成生产涉及的酶被称为萜合酶。事实上植物界中存在大量的倍半萜合酶，其全部使用相同的底物(法呢基焦磷酸酯，FPP)但是具有不同的产物分布。编码倍半萜合酶的基因和cDNA已经被克隆出来并且也已对相应的重组体酶进行了表征。在植物中及其他生物体中的萜的生物合成已经进行了广泛的研究，在此不进一步详述。
[0005]通常，植物天然提取物的价格和可用性取决于植物的丰度、含油率和地理来源。另外，天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候及其他当地条件，使得某些年在高品质香料中使用上述成分非常困难，甚至不可能使用。
[0006]岩兰草油是这些天然提取物中的一种。其是相对昂贵的加香成分，其由倍半萜醇类、醛类和具有复杂嗅觉分布的酸类的复杂混合物组成。岩兰草油的个体成分也可作为有用的加香成分，但是从油中对它们进行大规模的纯化是不可行的。
[0007]因此，非常需要一种独立于植物生产岩兰草油成分的方法，但是迄今为止，此类化合物的成本效益的化学合成尚不存在。
[0008](+)_客烯是天然产生的倍半萜分子。其可用作在香料和调味料领域中非常有用的各种化合物(特别是岩兰草油的成分如客烯醇(khusimol)、客烯-12-醒(zizaen-12-al)和客烯酸(khuzenicacid))的前体。因此，合成(+)_客烯的生物化学途径将受到极大的关注。
[0009]岩兰草油的成分分析显示，客烯衍生物是该油的主要组分并提供了岩兰草气味。参见例如，Weyerstahl等(2000)，Flav.Fragr.J.，15，395-412。然而，此文献并没有给出或者暗示生产(+)_客烯的氨基酸或核苷酸序列。
[0010]在 Del Giudice 等(2008)，The microbial community of Vetiver root and itsinvolvement into essential oil biogenesis, Environ.Microbiol., 10(10), 2824-2841 中研究了岩兰草根中岩兰草油的生物合成。该出版物描述了通过从岩兰草根中分离出的微生物生产倍半萜，并且支持在岩兰草倍半萜的生物合成中参与有微生物的设想。我们的结果与该文章中所做的暗示正好相反，因为我们的结果显示客烯是由岩兰草根自身表达的倍半萜合酶生产的，而非微生物群落所生产。
[0011 ] 倍半萜合酶能够合成岩兰草油成分的前体，特别是合成(+)-客烯，其在现有技术中从未公开过。
[0012]公知的倍半萜合酶与本发明的多肽之间的同一性百分比非常低。最接近于本发明的(+)-客烯合酶的蛋白质序列是来自玉米(Zeamays)的推定職合酶(NCBI检索号:ACG24265),其具有与本发明的(+)_客烯合酶有56%的氨基酸序列同一'丨生。目前尚未确认由该推定萜合酶获得的产物。最接近的、完全表征的合酶是来自玉米的(Ε)-β-丁子香烯合酶(NCBI检索号:ΑΒΥ79212)，其只有51 %同一于本发明的合酶。
[0013]除序列本身之间的差异之外，还应指出的是，由上述酶合成的产物的结构和性质与(+)_客烯的结构和性质相差悬殊。特别是(Ε)-β-丁子香烯不适合作为生产岩兰草油成分的前体。
[0014]尽管广泛研究了萜的环化，但是由于它们的低丰度、通常的瞬时表达模式和在其表达组织中从树脂和酚类化合物的混合物中纯化它们的复杂性的原因，萜合酶的分离和表征仍然是困难的，尤 其是在植物中。
[0015]本发明的目的是，如上所指出的，提供以经济的方式生产(+)_客烯的方法。因此，本发明的目的是生产(+)_客烯，同时有极少浪费、节约能源和资源的方法并同时减少对化石燃料的依赖性。本发明的另一目的是提供能够合成可用作香料和/或芳香成分前体的(+)_客烯的酶。
[0016]使用的缩写
[0017]bp碱基对
[0018]kb千碱基
[0019]BSA牛血清清蛋白
[0020]cDNA互补 DNA
[0021 ] CTAB十六烷基三甲基溴化铵
[0022]DMAPP 二甲基烯丙基二磷酸酯
[0023]DNA脱氧核糖核酸
[0024]dATP脱氧腺苷三磷酸
[0025]dNTP脱氧核苷三磷酸
[0026]DTT二硫苏糖醇
[0027]EDTA乙二胺四乙酸
[0028]FPP法呢基焦磷酸酯
[0029]GC气相色谱[0030]idi异戊烯基二磷酸酯异构酶
[0031]IPP异戊烯基二磷酸酯
[0032]IPTG异丙基-D-硫代半乳糖苷
[0033]LB溶菌肉汤
[0034]MOPSO3- (N-吗啉)~2~羟基丙磺酸
[0035]MS质谱
[0036]mvaKl甲轻戍酸激酶
[0037]mvaK2甲羟戊酸二磷酸激酶
[0038]PCR聚合酶链式反应
[0039]PVP聚乙烯吡咯烷酮
[0040]RMCE重组酶介导的盒式交换
[0041]3’ -/5’ -RACE 3’ /5’ cDNA 末端快速扩增
[0042]RNA核糖核酸
[0043]mRNA信使核糖核酸
[0044]TE三羟甲基氨基甲烷(tris)和EDTA
[0045]YNB无氨基酵母氮源

【发明内容】

[0046]本发明提供一种以经济、可靠并且可再现的方式生物合成生产(+)_客烯的方法。
[0047]“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”在此作为能够催化从无环萜前体FPP合成倍半職分子或倍半職分子混合物的多肽。
[0048]作为“⑴-客烯合酶”或作为“具有⑴-客烯合酶活性的多肽”，此处我们是指能够催化由FPP合成(+)_客烯的多肽。(+)_客烯可以是唯一的产物或可以是倍半萜混合物的一部分。
[0049]多肽催化合成特定倍半萜(例如(+)_客烯)的能力可以简单地通过实施实施例3详述的酶分析法来确认。
[0050]根据本发明，多肽也意味着包括截短的多肽，条件是它们保持了任何上述实施方案所定义的倍半萜合酶活性并且它们与SEQ ID NO:1的相应片段共有至少规定百分数的同一性。
[0051]如本文以下所指出的，“通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列而获得的核苷酸序列”包含已经通过使用本领域公知的任何方法(例如通过引入任何类型的突变如缺失、插入或取代的突变)改变SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 11或该两个序列之一的互补序列的序列所获得的任何序列。在与变体多肽及其制备方法有关的描述部分列举了上述方法的实例。
[0052]在两个肽或核苷酸序列之间的同一性百分比是在这两个序列的比对生成时，在这两个序列中相同的氨基酸或核苷酸残基数目的函数。相同的残基定义为在这两个序列中在给定的比对位置上相同的残基。在此处使用的序列同一性的百分比是由最优比对，通过将在两个序列之间的相同残基的数目除以在最短的序列中的残基的总数然后乘以100而计算得到的。该最佳比对是同一性百分比为最高可能的比对。可以在一或两个序列的比对的一个或多个位置中引入间隙以便获得最佳比对。然后在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残基来考虑。
[0053]以测定氨基酸或核酸序列同一性百分比为目的的比对可以使用计算机程序以多种方式来实现，例如在万维网上可获得的公开可用的计算机程序。优选地，可使用来自 National Center for Biotechnology Information (NCBI)的网址为 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi 的 BLAST 程序(Tatianaet al, FEMS MicrobiolLett.，1999，174:247-250, 1999)，其参数设为默认，来获得肽或核苷酸序列的最优比对，以及来计算序列同一性的百分比。
[0054]因此，本发明的一个目的是一种生产(+)_客烯的方法，包含:
[0055]a)将FPP与至少一种具有(+)-客烯合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ IDNO:1有至少50%同一性的氨基酸序列；
[0056]b)非强制选择地，分离在步骤a)中产生的(+)_客烯。
[0057]根据一个优选的实施方式，该方法是以(+)_客烯作为主产物的生产方法。根据一个更优选的实施方式，(+)_客烯占由本发明方法生产的产物的至少50%、优选至少60%、优先至少80%、优先至少90%。
[0058]该方法可在体外和体内实施，其在下文中将进一步详细说明。
[0059]要与FPP在体外接触的多肽可以通过使用标准蛋白质或酶提取技术从表达它的任何生物体中提取 来获得。如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基内的单细胞生物或细胞，可以简单地从该培养基内收集该多肽，例如通过离心法、非强制选择地随后进行洗涤步骤和在适合的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞将该多肽聚集在它的细胞之内，该多肽可以通过破裂或溶解该细胞并进一步从该细胞溶解产物提取来获得。
[0060]然后可以将具有(+)_客烯合酶活性的多肽(或以分离形式或与其它蛋白质一起，例如以从培养细胞或微生物中获得的粗蛋白提取物的方式)悬浮在最佳PH下的缓冲溶液中。如果适当，可以添加盐、BSA及其他种类的酶辅助因子以便优化酶活性。适当的条件将在下文的实施例中更详细地描述。
[0061]然后可将前体FPP添加到该多肽悬浮液或溶液中，再将其在最佳的温度下培养，例如在15°C和400C之间、优选在25°C和35°C之间、更优选在30°C下。在培养之后，可以非强制选择地在从该溶液去除多肽之后通过标准分离工序如溶剂萃取和蒸馏将产生的(+)_客烯从该培养的溶液中分尚出来。
[0062]根据另一个优选的实施方式，任何上述实施方式中的方法是在体内进行的。在这种情况下，步骤a)包含在有利于生产(+)_客烯的条件下培养能够生产FPP并且经转化以表达至少一种多肽的非人宿主生物体或细胞，其中该多肽包含与SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有(+)_客烯合酶活性。
[0063]根据一个更优选的实施方式，该方法还包含在步骤a)之前用编码多肽的至少一种核酸转化能够生产FPP的非人生物体或细胞以使所述生物体表达所述多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有(+)_客烯合酶活性。
[0064]本发明的这些实施方案是特别有益的，因为有可能在体内实施该方法，而无需预先分离多肽。该反应直接在经转化以表达所述多肽的生物体或细胞内发生。
[0065]根据本发明一个特定的实施方式，编码(+)_客烯合酶的该至少一种核酸包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列有至少50%、优选至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、更优选至少95%甚至更加优选至少98%同一'丨生的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方式，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11或它们的互补序列。在一个更加优选的实施方式中，所述核酸由SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 11或它们的互补序列组成。
[0066]根据一个更加优选的实施方式，任何上述实施方式中使用的该至少一种核酸包含通过修饰SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得的核苷酸序列。根据一个更加优选的实施方式，所述至少一种核酸由通过修饰SEQ IDN0:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得的核苷酸序列组成。
[0067]根据另一个实施方式,该至少一种核酸是从岩兰草(Vetiveria zizanoide)中分离得到的。
[0068]该生物体或细胞意在“表达”多肽，条件是该生物体或细胞被转化以包含编码所述多肽的核酸，该核酸被转录成mRNA并且在该宿主生物体或细胞中发现该多肽。术语“表达”包含“异源表达”和“过表达”，后者是 指mRNA、多肽和/或酶活性的水平超过在非转化生物体或细胞内测量得到的水平。随后在致力于将上述转化的非人宿主生物体或细胞作为本发明特定目的的说明书部分和实施例中对转化非人宿主生物体或细胞的适合方法作更详细地描述。
[0069]特定的生物体或细胞，当其天然产生FPP时或当其并不天然产生FPP但可经转化以产生FPP时，不管是用此处描述的核酸转化之前还是与所述核酸一起都意味着“能够产生FPP”。经转化的与天然存在的生物体或细胞相比产生更高量FPP的生物体或细胞也包括在“能够产生FPP的生物体或细胞”内。转化生物体(例如微生物)以便它们产生FPP的方法已经是本领域公知的。这些方法可以例如在文献中找到，例如在下列出版物中:Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D.,和 Keasling, J.D.NatBiotechnol.，2003，21 (7)，796-802 (大肠杆菌(E.coli)的转化)；Wu, S.，Schalk, Μ.，Clark, A., Miles, R.B., Coates, R.,和 Chappell, J., Nat Biotechnol., 2006, 24 (11), 1441-1447(植物的转化)；Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, B.T., McMul I in, T., Song, L., Maurina-Brunker, J., Rosson, R., Noel, J., Chappell, J, Biotechnology and Bioengineering, 2007,97(1)，170-181(酵母的转化)。
[0070]为了在体内实施本发明，在有利于生产(+)_客烯的条件下培养宿主生物体或细胞。因此，如果该宿主是转基因植物，则提供最佳的生长条件，例如，如最佳的光、水和营养条件。如果该宿主是单细胞生物，有利于生产(+)_客烯的条件可以包含在宿主的培养基内添加适合的辅助因子。另外，可以选择培养基，以便最大化(+)_客烯的合成。在下列实施例中更详细地描述了最佳的培养条件。
[0071]适合于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在一个优选的实施方式中，用于在体内进行本发明的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特别有用的植物是天然产生高含量職的植物。在一个更优选的方式中，该植物选自爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、锦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)。例如，该植物选自烟草属(Nicotiana)、爺属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜猜属(Medicago(紫花苜猜))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属(Mentha)。优选地，该植物属于烟草(Nicotianatabacum)种。
[0072]在一个更优选的实施方式中，用于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体是微生物。可以使用任何微生物，但是根据更加优选的实施方式，所述微生物是细菌或酵母。最优选地，所述细菌是大肠杆菌(E.coli),而所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
[0073]这些生物体中的一些天生不会产生FPP。为了适于进行本发明的方法，必须将这些生物体转化以产生所述前体。如以上所述，可以在如上述任何实施方式描述的用核酸修饰之前或者同时将它们进行转化。
[0074]还可以使用分离的高等真核细胞代替完整生物体作为宿主以便在体内实施本发明的方法。适合的真核细胞可以是任何非人的细胞，但是优选植物细胞或真菌细胞。
[0075]根据一个优选实施方式，在上述任何实施方式中使用的或由任何上述实施方式中使用的核酸编码的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一种多肽包含与SEQ ID NO:1有至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、更优选至少95%甚至更加优选至少98%同一'丨生的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方式，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一个更加优选的实施方式中，所述多肽由SEQ ID NO:1组成。
[0076]根据另一个优选的实施方式,在上述任何实施方式中使用的或由上述任何实施方式中使用的核酸编码的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一种多肽包含通过基因工程获得的SEQ ID NO:1的变体氨基酸序列。换句话说，所述多肽包含通过修饰SEQ ID NO: 2、SEQ IDNO: 11或它们的互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据更优选的实施方式，在上述任何实施方式中使用的或由上述任何实施方式中使用的核酸编码的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一种多肽由通过基因工程获得的SEQ ID NO:1的变体氨基酸序列组成，SP，通过修饰SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0077]在此处所使用的多肽指的是包含此处确定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如以上定义的活性而且它们与相应的SEQ ID NO:1片段共有至少定义的百分比的同一性。
[0078]变体多肽的实例是由选择性mRNA剪接或此处所述形成多肽的蛋白酶剪切而得到的天然产生的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解移除一个或多个末端氨基酸而导致在N末端或C末端的差异。本发明也包含如其后所描述的用由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。例如，如以下实施例4所详述的，SEQ ID NO: 11是通过人工突变SEQ ID NO: 2所获得的SEQ ID NO:2的变体，产生在大肠杆菌(E.coli)中的表达被优化的并且编码与SEQID NO: 2相同的(+)_客烯合酶的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1) ο序列SEQ ID NO: 2与SEQ IDNO: 11有76%的同一性。
[0079]由在氨基末端和羧基末端融合额外的肽序列而产生的多肽变体也可用于本发明的方法。尤其是这样的融合:可以提高多肽的表达，在期望的环境或表达系统中有利于蛋白质的提纯或多肽酶活性的 改善。这种额外的肽序列例如可以是信号肽。因此，本发明包含使用变体多肽的方法，例如通过与其它寡肽或多肽融合而获得的多肽和/或与信号肽连接的多肽。在本发明的方法中还可以有利地使用由与另外的功能蛋白(例如来源于萜生物合成路径的另外的蛋白质)融合而产生的多肽。
[0080]根据另一个实施方式，在上述任一实施方式中使用的或由上述任一实施方式中使用的核苷酸编码的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一种多肽是从岩兰草(Vetiveriazizanoide)中分离出来的。
[0081]实施本发明方法的重要工具为多肽本身。因此，具有(+)_客烯合酶活性的并且包含与SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽是本发明的另一目的。
[0082]根据一个优选的实施方式，该多肽能够生产作为主要产物的(+)_客烯。根据一个更加优选的实施方式，其能够生产倍半萜混合物，其中(+)_客烯占产生的倍半萜的至少60%、优选地至少80%、优选地至少90%。
[0083]根据一个更优选的实施方式，该多肽具有(+)_客烯合酶活性。
[0084]根据一个优选的实施方式，多肽包含与SEQ ID NO:1有至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、更优选至少95%甚至更加优选至少98%同一'丨生的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方式，该多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。根据一个更优选的实施方式，该多肽由SEQ IDNO:1组成。
[0085]根据另一个优 选的实施方式，多肽包含由基因工程获得的SEQ ID NO:1的变体氨基酸序列。换句话说，所述多肽包含通过修饰SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据更优选的实施方式，具有(+)_客烯合酶活性的多肽由通过基因工程获得的SEQ ID NO:1的变体氨基酸序列组成，即，通过修饰SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0086]根据另一个实施方式,多肽是从岩兰草(Vetiveria zizanoide)中分离得到的。
[0087]在此处所使用的多肽指的是包含此处确定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如以上定义的活性而且它们与相应的SEQ ID NO:1片段共有至少定义的百分比的同一性。
[0088]变体多肽的实例是由选择性mRNA剪接或此处所述形成多肽的蛋白酶剪切而得到的天然产生的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解移除一个或多个末端氨基酸而导致在N末端或C末端的差异。本发明也包含如其后所描述的用由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。例如，如以下实施例4所详述的，SEQ ID NO: 11是通过人工突变SEQ ID NO: 2所获得的SEQ ID NO:2的变体，产生在大肠杆菌中的表达被优化的并且编码与SEQ ID NO:2相同的(+)_客烯合酶的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1) ο序列SEQ ID NO: 2与SEQ ID NO: 11有76%的同一性。
[0089]由额外的肽序列在氨基和羧基末端融合而产生的多肽变体也包含于本发明的多肽之中。尤其是这样的融合:可以在期望的环境或表达系统中提高多肽的表达，利于蛋白质的提纯或多肽酶活性的改善。这种额外的肽序列例如可以为信号肽。因此，本发明包括本发明的多肽变体，例如通过与其它寡肽或多肽融合而获得的多肽变体和/或与信号肽连接的那些多肽变体。本发明的多肽还可以包括由与另外的功能蛋白(例如来源于萜生物合成路径的另外的蛋白质)融合而产生的多肽。
[0090]如上所述，编码本发明多肽的核酸是修饰在体内进行该方法时意欲使用的非人宿主生物体或细胞的有效手段。
[0091]因此，编码任何上述实施方式所述的多肽的核酸也是本发明的一个目的。
[0092]根据一个优选的实施方式，该核酸包含与SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列有至少50%、优选至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、更优选至少95%甚至更加优选至少98%同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方式，该核酸包含SEQ ID NO: 2、SEQID NO: 11或它们的互补序列。根据一个更加优选的实施方式，该核酸由SEQ ID NO:2,SEQ IDNO: 11或它们的互补序列组成。
[0093]根据另一个实施方式,该核酸是从岩兰草(Vetiveriazizanoide)中分离得到的。
[0094]本发明的核酸可以定义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物(DNA和/或RNA)。术语“核苷酸序列”也应该被理解为包含分离片段形式的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子或作为较大核酸组分。本发明的核酸还包含某些分尚的核苷酸序列，该核苷酸序列包括基本上无污染内源材料的那些核苷酸序列。本发明的核酸可以是截短的，条件是其编码本发明包含的如上所述的多肽。
[0095]根据一个更加优选的实施方式，任一上述实施方式所述的至少一种核酸包含通过修饰SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得的核苷酸序列。优选地所述核酸由通过修饰SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列获得的核苷酸序列组成。
[0096]本发明包括含有通过使SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列突变获得的序列的核酸，条件是该核酸包含的该序列与SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11或它们互补序列的相应片段有至少所定义百分比的同一性、并且该核酸编码如上任何实施方式所定义的具有(+)-客烯合酶活性的多肽。突变可以是这些核酸任何种类的突变，如点突变、缺失突变、插入突变和/或移码突变。可以制备变体核酸以便使其核苷酸序列适应特异性表达系统。例如，已知细菌的表达系统在由优选的密码子编码氨基酸时更有效地表达多肽。由于遗传密码的简并性，其中多于一个的密码子可以编码相同的氨基酸，多个DNA序列可以编码相同的多肽，本发明包含所有这些DNA序列。
[0097]另一个用于转化适于在体内实施本发明方法的宿主生物体或细胞的重要工具是包括本发明任何实施方式的核酸的表达载体。因此，这种载体也是本发明的一个目的。
[0098]此处所使用的“表达载体”包括任何直链的或环状的重组载体，其包括但不限于病毒载体、曬菌体和质粒。技术人员能够根据表达系统选择适合的载体。在一个实施方式中，该表达载体包括本发明的核酸并非强制选择地包括至少一种选择标记，该核酸可操作地与至少一种调控序列连接，该调控序列控制转录和/或翻译的开始和/或终止，如转录的启动子、操纵子或增强子，或mRNA核糖体的结合部位。当该调控序列功能上与本发明的核酸相关时，则核苷酸序列是“可操作地连接的”。
[0099]如下述公开中，本发明的表达载体可用于制备基因转化的宿主生物体和/或细胞的方法中，用于包含本发明核酸的宿主生物体和/或细胞中、和用于生产或制备具有(+)-客烯合酶活性的多肽的方法中。
[0100]经转化以包含本发明至少一种核酸以便使其异源表达或过表达本发明至少一种多肽的重组非人宿主生物体和细胞也是实施本发明方法的十分有用的工具。因此，这种非人宿主生物体和细胞是本发明的另一个目的。
[0101]任何上述实施方式所述的核酸都可用于转化非人宿主生物体和细胞并且所表达的多肽可以是任何上述的多肽。
[0102]本发明的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在优选的实施方式中，非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。任何植物、原核生物或真菌都是适合于本发明所述的转化。特别有用的植物是那些天然产生大量萜的植物。在一个更优选的实施方式中，该植物选自爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、锦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)类。例如，该植物选自烟草属(Nicotiana)、爺属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜猜属(Medicago (紫花苜猜))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属(Mentha)。优选地，该植物属于烟草(Nicotianatabacum)种。
[0103]在一个更优选的实施方式中，该非人宿主生物体是微生物。任何微生物都适合于本发明，但是根据一个更加优选的实施方式，所述微生物是细菌或酵母。最优选地，所述细菌是大肠杆菌，而所述酵母是酿酒酵母。
[0104]还可以将分离的高等真核细胞转化以代替完整的生物体。作为高等真核细胞，这里我们是指除酵母细胞之外的任何非人真核细胞。优选的高等真核细胞是植物细胞或真菌细胞。
[0105]术语“经转化”是指宿主经过遗传工程以便使其包含上述任何实施方式中所需要的每个核酸的一个、两个或更多个拷贝的事实。优选地，术语“经转化”涉及异源表达由该核酸编码的多肽以及过表达所述多肽的宿主，该宿主经所述核酸转化。因此，在一个实施方式中，本发明提供了经转化的生物体，其中该多肽的表达量高于未经如此转化的相同生物体的表达量。
[0106]现有技术中已知有多种方法用于生成转基因宿主生物体或细胞，如植物、真菌、原核生物或高等真核细胞的培养物。适用于细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体的描述参见，例如，Pouwels等，Cloning Vectors:A LaboratoryManual,1985,Elsevier, New York 和 Sambrook 等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。尤其用于高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体是技术人员可以得到的。参见例如Schardl等Gene61:1-11, 1987。
[0107]转化宿主生物体或细胞以使其包含转基因核酸的方法为技术人员所熟知。对于生产转基因植物，例如通用的方法包括:植物原生质体的电穿孔法、脂质体介导的转化法、土壤杆菌介导的转化法、聚乙二醇介导的转化法、粒子轰击法、植物细胞的显微注射法和应用病毒的转化法。
[0108]在一个实施方式中，经转化的DNA被整合到非人宿主生物体和/或细胞的染色体中，从而得到稳定的重组体系统。本领域中任何公知的染色体整合方法可以应用于本发明的实践中，包括但不限于重组酶介导的盒式交换(RMCE)、病毒位点特异性染色体插入法、腺病毒法和原核注射法。[0109]为了在体外实施如上所述生产(+)_客烯的方法，提供一种制备如本发明任何实施方式所述的至少一种具有(+)_客烯合酶活性的多肽的方法是非常有利的。因此，本发明提供一种本发明任何实施方式所述的至少一种多肽的生产方法，包含:
[0110]a)培养本发明任何实施方式所述的非人宿主生物体或细胞；
[0111]b)从步骤a)中培养的非人宿主生物体或细胞中分离多肽。
[0112]根据一个优选实施方式，所述方法还包含在步骤a)之前，用至少一种本发明任何实施方式所述的核酸转化非人宿主生物体或细胞，以便所述生物体表达所述核酸编码的多肽。
[0113]可以使用任何上述实施方式所述的核酸。
[0114]可以用如上所述的在体内生产(+)_客烯的方法来转化和培养非人宿主生物体或细胞。可以使用本领域公知的任何技术从生物体或细胞中分离出特定多肽以实施步骤b)。
[0115]“多肽变体”这里指的是这样一种多肽，其具有(+)-客烯合酶活性且基本上与任何上述实施方式的多肽同源，但是其具有的氨基酸序列因为一处或多处缺失、插入或取代而不同于由本发明任何核酸序列所编码的氨基酸序列。
[0116]变体可以包含保守取代序列，意味着 某一特定氨基酸残基被一具有类似理化特性的残基所取代。保守取代的实例包括:用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如Ile、Val、Leu或Ala之间相互取代；或者用一个极性残基取代另一个极性残基，例如在Lys和Arg之间、Glu和Asp之间或Gln和Asn之间相互取代。参见Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-ffesley Pub.Co。这类取代的效果可以用取代打分矩阵(如Altschul, J.Mol.Biol.，1991，219，555-565 中所述的 PAM-120、PAM_200 和 PAM-250)计算得出。其他这类保守取代，例如具有近似疏水性特性的完整区域的取代，已为本领域熟知。
[0117]天然产生的肽变体也包含在本发明范围之内。这种变体的实例是由于选择性mRNA剪接或者本文所述多肽的蛋白酶剪切而得到的蛋白质。蛋白水解引起的变体包括，例如，在不同类型宿主细胞中表达时，由本发明序列编码的多肽由于蛋白水解移除了一个或多个末端氨基酸而导致N末端或C末端的差异。
[0118]本发明多肽的变体可以用于获得例如期望的增强的或减弱的酶活性、改性的区域化学(regiochemistry)或立体化学、或者改变的底物利用或者产物分布、底物亲和力的增加、改进了特异性的一种或多种目标化合物的生产方法、酶反应速率的增加、在特定环境(pH、温度、溶剂等等)中的更高活性或稳定性、或者在目标表达系统中的改进的表达水平。变体或定位突变体可以通过本领域已知的任何方法来生成。天然多肽的变体和衍生物能够通过分离其它或相同植物品系或物种的天然产生的变体或者变体的核苷酸序列来获得，或者通过对编码本发明多肽的核苷酸序列进行人工规划突变来获得。天然氨基酸序列的改变可通过多种传统方法中的任一种完成。
[0119]由附加的肽序列在本发明多肽的氨基和羧基末端融合产生的多肽变体可用于增强多肽的表达，在期望的环境或表达系统中利于蛋白的纯化或提高多肽的酶活性。这种附加的肽序列例如可以是信号肽。因此，本发明包括本发明多肽的变体，例如通过与其它寡肽或多肽和/或连接到信号肽上的多肽融合获得的那些变体。包括在本发明范围内的融合多肽还包含由融合其它功能蛋白质(如来自萜生物合成路径的其它蛋白质)而产生的融合多肽。[0120]因此，在一个实施方式中，本发明提供一种上述任何实施方式所述的具有(+)-客烯合酶活性的变体多肽的制备方法，包含步骤:
[0121](a)选择上述任何实施方式所述的核酸；
[0122](b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；
[0123](C)用该突变核酸序列转化宿主细胞或单细胞生物以表达该突变核酸序列编码的多肽；
[0124](d)按照至少一种修饰的性质筛选该多肽；和，
[0125](e)非强制选择地，如果该多肽不具有期望的变体(+)_客烯合酶活性，则重复步骤(a)至(d)直到获得具有所期望的变体(+)_客烯合酶活性的多肽；
[0126](f)非强制选择地，如果在步骤(d)中鉴别出具有所期望的变体(+)_客烯合酶活性的多肽，则分离在步骤(C)中获得的相应突变核酸。
[0127]根据一个优选的实施方式，所制备的变体多肽能够生产作为主产物的(+)_客烯。根据一个更加优选的实施方式，其能够生产倍半萜混合物，其中(+)_客烯占有生产的倍半萜的至少60 %、优选至少80 %、优选至少90 %。
[0128]在步骤(b)中，例如通过随机诱变、位点特异性诱变或DNA改组方法可生成大量的突变核酸序列。基因改组的详细的步骤可在Stemmer的DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly:1n vitro recombination for molecular evolution.ProcNatl Acad Sci USA.，1994，91 (22): 10747 - 1075中找到。总之，DNA改组指的是已知序列在体外的随机重组的方法，其包括选择至少两种核酸用于重组。例如能够通过合成含有突变序列的寡聚核苷酸在特定位点引入突变，与能够连接到天然序列片段的限制性位点侧面相连。连接之后，得到的重构序列编码具有期望的氨基酸插入、置换或缺失的类似物。另外，可使用寡聚核苷酸-定点特异性诱变步骤以提供改变的基因，其中预先确定的密码子可通过置换、缺失或插入来改变。
[0129]因此，包含SEQ ID NO:1的多肽可与任何其它编码核酸的倍半萜合酶例如从除岩兰草之外的有机体中分离出来的倍半萜合酶进行重组。因此，可获得并分离出突变核酸，其可根据例如本实施例公开的标准步骤来转化宿主细胞。
[0130]在步骤(d)中，对步骤(C)中获得的多肽进行至少一种修饰的特性例如期望改变的酶活性的筛选。对表达的多肽进行活性筛选所期望的酶活性的实例包括由Km或Vmax值度量的增强或减弱的酶活性、修饰的区域化学或立体化学、和改变的底物利用或产物分布。酶活性的筛选可根据本领域的技术人员熟知的步骤以及在本实施例中公开的步骤来实施。
[0131]提供步骤(e)以重复步骤(a)~(d)的过程，优选其可平行操作。因此，通过生成大量的突变核酸，可同时用不同的突变核酸将多个宿主细胞转化，使较多数量的多肽进行随后的筛选。因此获得期望的多肽变体的机会随技术人员意愿增加。
[0132]本申请中提及的所有出版物均以参照的方式并入于此，以公开并描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。
【专利附图】

【附图说明】
[0133]凰1:由岩兰草( +)_客烯合酶(VzZS)产生的倍半萜的GC-MS分析。A:总离子色谱图。B:主峰⑴的质谱。C:真实(+)_客烯标准品的质谱。经鉴定峰I为(+)_客烯。峰2、3和4分别鉴定为前客烯(prezizaene)、α -柏木職烯和β-柏木職烯。用S标注的峰为未鉴定的倍半萜化合物。
[0134]S1:由岩兰草(+)_客烯合酶(VzZS)产生的主要倍半萜化合物的结构。
[0135]由体外(A)和体内(B)生产(+)_客烯所获得的产物分布。各分析中的主峰为(+)-客烯。
【具体实施方式】
[0136]现在将通过下列实施例进一步详细地描述本发明。
[0137]实施例1
[0138]RNA提取及cDNA f库构律
[0139]岩兰草植物来自植物苗圃(TheAustral Plants Company, Les Avirons, TheReunion Island,法国)。在Lullier Agronomy研究所(瑞士)的温室中、在盆中培养该植物，并且通过划分为六个月至一年生的簇进行无性繁殖。将植物从盆中取出并用自来水冲洗以收获其根部。
[0140]为制备cDNA文库，将从若干植物获取的根部收集在一起:将幼苗(繁殖后4~6个月)、具有良好发育的茂密 的根系统的老植物(繁殖后I~2年)和从盆中取出之后在室温下干燥24~36小时的幼苗。将根部从植物的地上部分切下并于液氮中冷冻。首先，使用 Waring Blendor (Waring Laboratory, Torrington, USA)在液氮中将其粗部切碎，然后使用研钵和碾槌将其研磨成细粉。按照Kolosova等(Kolosova, Miller, Ralph, Ellis, Douglas, Ritland and Bohlmann, Isolation of high-quality RNA from gymnosperm andangiosperm trees.J.Biotechniques, 36 (5), 821-4，2004)中描述的步骤使用下列改进以提取总RNA。每2克磨碎的组织使用20ml体积的提取缓冲液，并且该提取缓冲液添加有2% (w/v)的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Sigma-Aldrich)。对于CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Sigma-Aldrich)提取,将核酸颗粒重悬浮于2ml的TE缓冲液(IOmM Tris-HCl, pH8, ImMEDTA)中，并且用2ml的5M NaCl和lmll0% CTAB来实施该提取。对于异丙醇沉淀，将核酸颗粒溶于500 μ I TE中。将最终RNA颗粒重悬浮于50 μ I水中。
[0141]根据制造商手册，使用SMARTtmPCR cDNA合成试剂盒(ClontechLaboratories, Mountain View, CA)制备双链cDNA文库，并且在逆转录步骤中使用SuperScript?II RNAse H-逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)。使用 Iyg 的岩兰草地下组织总RNA作为cDNA合成的模板，将扩增步骤进行15个循环。将文库装载于I %的琼脂糖凝胶上，洗脱出1.3~3Kb范围大小的片段。取270ng该cDNA文库用于测序。
[0142]实施例2
[0143]倍半萜合酶cDNA的cDNA f库测序及扩增
[0144]将由Illumina(San Diego, California)开发的小DNA片段的大规模并行测序技术用于整个cDNA文库的测序。制备测序用DNA,通过Fasteris SA (Plan-les-Ouates,瑞士 )实施对读出序列(read)的测序和组装。接着用Genomic Sample Prep Kit (Illumina)处理cDNA文库并在基因组分析系统(Genome Analyzer system) (Illumina)上进行测序。总共获得4千2百万35bp读出序列(其中的3千6百万为单一序列)。使用EDENA2.1.1对这些读出序列进行拼接，该软件用于发现读出序列间的重叠并将从头重叠群(de novo contig)进行拼接(Hernandez D., Francois P., Farinelli L., 0steras Μ.,和 Schrenzel J., Denovo bacterial genome sequencing !Millions of very short reads assembled ona desktopcomputer.Genome Res.18(5)，802 - 809, 2008)。在排除短于 100喊基的重叠群(contig)后，获得最大长度为1882bp的4324个单一重叠群。另一拼接使用Velvetl.0程序(Zerbinoand Birney (2008), Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijngraphs.Genome Res.18 (5)，821-829)，得到 100 ~2006 之间碱基长度的 9264 个单一重叠群。
[0145]使用Blastx 算法(Altschul 等的 J.Mol.Biol.215，403-410，1990)将产生的所有重叠群与蛋白序列数据库(含有甄选的7000种植物蛋白质序列)进行比较。将显示出与植物倍半萜合酶具有显著的序列同源性的重叠群保留下来，并且通过对每个选出的重叠群在NCBI非冗余蛋白质序列(NCBI ；http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中进行blast检索以进一步确认其同源性。如此，15个重叠群被确认为编码cDNA的倍半萜片段。
[0146]选出的重量叠群之一(VzCtg306，SEQ ID NO: 3)为1090bp长度，并且其与全长萜合酶的序列比较显示缺失了 3’末端和5’末端。由该序列设计出了两个正向引物(ctg306-3Rl (SEQ ID NO: 4)和 ctg306_3R2 (SEQ ID NO: 5))和两个反向引物(ctg306-5Rl (SEQ ID NO:6)和 ctg306_5R2, (SEQ ID NO: 7))，并将这些引物用于 cDNA 末端的快速扩增(RACE)。将 SMART? RACE cDNA 扩增试剂盒(Clontech Laboratories, MountainView, CA)与PrimeScript 逆转录酶(TaKaRa Bio, Shiga,日本)一起使用。因此，各从 1.2 μ g岩兰草根总 RNA 制备了 SMART?5’RACE-Ready cDNA 和 SMART?3 ’ RACE-Ready cDNA 池。对于5’RACE，使用 UPM 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_5Rl 引物(SEQ ID NO:6)进行第一轮 PCR，接着使用 NUP 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_5R2 引物(SEQ ID NO: 7)进行第二轮PCR。对于 3’RACE，使用 UPM 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_3Rl (SEQID NO:4)引物进行第一轮 PCR，接着使用 NUP 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_3R2引物(SEQIDN0:5)进行第二轮PCR。该扩增是在制造商手册(Clontech)中详细描述的条件下进行的。
[0147]5’和3’ RACE的结合可以重构含有开放阅读框1668bp(SEQ ID NO:2)的1925bpcDNA(VzZS, SEQ ID NO: 8)，该开放阅读框可用于编码555氨基酸长度的蛋白质(SEQ IDNO:1)。
[0148]实施例3
[0149]异源表汰和酶的表征
[0150]使用引物ctg306-启动(SEQ ID NO:9)和 ctg306_ 终止(SEQ ID NO: 10)从SMART?5’RACE-Ready cDNA 池扩增出全长 VzZS 开放阅读框(VzZS-ORF, SEQ ID NO: 2) ? 表达构造体的该cDNA的扩增是使用Pfu DNA聚合酶(Promega, Madison, WI, USA)，在含有5 μ I的Pfu DNA聚合酶10Χ缓冲液、各200 μ M的dNTP、正向弓丨物和反向弓丨物各0.4 μ M、2.9单位Pfu DNA聚合酶和2.5 μ I的cDNA (如上所述进行制备)的终体积为50 μ I的条件下进行的。热循环条件如下:95°C下1.5分钟；95°C下45秒、54°C下30秒和72°C下4分钟，30个循环；和72°C下10分钟。
[0151]按照制造商手册，使用Champion pETlOl Directional T0P0表达试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)将PCR产物插入至pET101/D_T0P0载体中。筛选出若干克隆体并对质粒插入物进行测序以确认该序列与由RACE获得的序列相同。
[0152]使用质粒ρΕΤΙΟΙ-VzZS 转化 B121(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen, Madison, WI)。将转化细胞的单菌落接种于5ml的LB培养基中。在37°C下培育5~6小时后，将培养物转移至20°C的培养箱中并放置平衡I小时。然后，加入ImM IPTG以诱导蛋白质的表达，将培养物在20°C培育过夜。第二天，通过离心收集细胞，并将其重悬浮于0.1体积的50mM MOPSOpH7和10%的丙三醇中，超声使其溶解。离心(20，OOOg下30分钟)净化提取物，将含有可溶性蛋白质的上清液用于进一步的试验。
[0153]将含有重组蛋白质的粗大肠杆菌蛋白质提取物用于酶活性的表征。按Keller，R.K.和 Thompson, R., J.Chromatogr.645 (I), 161-167，1993 所述来合成法呢基二憐酸酷(FPP)。该测定是在10~100 μ M底物和0.1~0.5mg粗蛋白质的存在下，在I~4mL的50111]\?0?5(^!17、10%丙三醇、1111101'1'和IOmMMgCl2中进行的。将试管在30°C下培育12~24小时，并用I体积戊烷萃取两次。在氮气流下浓缩，用GC和GC-MS对提取物进行分析，并与对照蛋白质提取物的测试进行对比。该GC分析是使用0.25mm内径X 30m的SPB-1毛细管柱(Supelco, Bellefonte, PA)、在配置有火焰离子化检测器的Agilent6890Series GC系统上进行的。载气是以lmL/min恒流的He。初始炉温为80°C (保持I分钟)，随后以10°C /分钟的梯度升至300°C。GC-MS分析是在同样的条件下进行的，并且在Agilent5975质量检测器上记录图谱。
[0154]在这些条件下，由VzZS cDNA编码的重组蛋白质生产的一种主要倍半萜占所生产的倍半萜混合物的75%。通过将质谱和保留指数与可靠的标准样和公开数据(Joulain, D., and Konig ,Ik., The Atlas of Spectral Data of SesquiterpeneHydrocarbons, EB Verlag, Hamburg, 1998)的对比，该主产物鉴定为(+)-客烯。该酶还生产了 6.9%的前客烯(prezizaene)、2.8%的α -柏木職烯、2.7%的β_柏木職烯和比例在 0.85~8.7%间的至少3种其它倍半萜(图2)。因此，从岩兰草分离得到的VzZS cDNA编码生产岩兰草根部中最丰富倍半萜的烃前体(客烯醇、客烯-12-醛和客烯酸)的(+)-客烯合酶(SEQ ID NO:1)。该酶还产生了作为第二产物的若干岩兰草根部的次要成分的前体。
[0155]实施例4
[0156]重组VzZS蛋白质在细菌中体内生产(+)_客烯的应用
[0157]为了在大肠杆菌中VzZS的最佳表达，考虑到宿主密码子的使用以及影响mRNA的稳定性和翻译的其它参数，重新设计了了 VzCtg306cDNA的ORF的DNA序列。设计并用NdeI和KpnI限制性内切位点以及3’和5’末端合成了优化序列(VzZS-opt，SEQID NO: 11) (DNA2.0, Menlo Park, CA, USA)，并且将该序列亚克隆至 pETDuet-Ι 质粒(Novagene, Madison, WI)中，获得质粒 pETDuet-VzZS-opt。
[0158]为了评估体内(+)_客烯的生产，用pETDuet-VzZS-opt质粒转化大肠杆菌细胞,并且评估由内源性FPP池对倍半萜的生产。为了提高细胞的生产率，将FPP合酶和编码部分甲羟戊酸路径的基因在同一细胞中表达。将后者这些基因编排在单个的操纵子中并编码甲羟戊酸激酶(mvaKl)、磷酸甲羟戊酸激酶(mvaK2)、甲羟戊酸二磷酸酯脱羧酶(MvaD)和异戊烯基二磷酸酯异构酶(idi)和转化的外源性甲羟戊酸至FPP合酶的两个底物:异戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。
[0159]酵母FPP合酶基因是从酿酒酵母基因组DNA使用引物FPPy_NcoI (SEQ IDNO: 12)和 FPPy-Eco (SEQ ID NO: 13)扩增得到的。该基因组 DNA 是使用 Qiagen RNA/DNAMaxi Kit (Qiagen AG, Basel,瑞士)从酿酒酵母中分离得到的。PCR是使用Pfu DNA聚合酶(Promega AG, Dubendorf,瑞士)，在终体积为50 μ I含有各引物0.4 μ 1、200 μ MdNTPs、0.5μ I DNA聚合酶和5μ I酿酒酵母基因组DNA中进行的。该PCR循环条件如下:95°C下90秒；95°C下45秒、54°C下30秒和72°C下4分钟，28个循环；72°C下10分钟。在T7启动子的控制下，将扩增的DNA作为Nde1-EcoRI片段连接在pACYCDuet_l质粒(Novagen, Madison, WI)的第一多克隆位点(MCSl)上，获得包含有FPPs的质粒pACYCDuet-FPPs。
[0160]使用引物MVA-upl-start (SEQ ID NO: 14)和 MVA-up2_stop (SEQ ID NO: 15)从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) (ATCC BAA-334, LGC Standards, Mo I she im,法国)的基因组DNA扩增出了含有编码mvaKl、mvaK2、MvaD和idi的基因的操纵子。使用PfuUltra?IIFusion HS DNA 聚合酶(Stratagene, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)进行PCR。根据制造商手册混合PCR混合物的组分。其热循环条件为:95°C下2分钟；95°C下20秒、58°C下20秒和72°C下90秒，30个循环；和72°C下3分钟。在琼脂糖凝胶上纯化该3.8Kb片段，并且使用 In-Fusion?Dry-Down PCR Cloning Kit (Clontech Laboratories)将其连接至用NdeI和XhoI消化过的pACYCDuet-FPPs质粒的第二 MCS上，获得质粒pACYCDuet-4506。对该两个插入物的序列进行完全测序以排除任何突变。
[0161]用质粒pETDuet-VzZS-opt转化或用该质粒与质粒pACYQ)uet-4506共转化BL21Star?(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)。在羧节青霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB-琼脂糖平板上筛选转化的细胞。将单个菌落接种至添加有相同抗生素的5mL液体LB培养基中。将培养物在37°C培育过夜。第二天，取0.2mL该过夜培养物接种至2mL添加有相同抗生素的TB培养基中。在37°C培育6小时后，将培养物冷却至28°C，然后向每管加入ImM IPTG、2mg/mL甲羟戊酸(将甲羟戊酸内酯(Sigma)溶于0.5NNaOH制备浓度为lg/mL 并将该溶液在37°C培育30分钟)和0.2ml癸烷。在28°C将培养物培育48小时。然后用2体积的乙酸乙酯萃取该培养物两次，将有机相浓缩至500 μ L并按以上实施例3中所述进行GC-MS分析。用生产(+)_客烯合酶、FPP合酶和四种甲羟戊酸路径酶的细胞，获得了 0.lmg/mL的生产率，并且其产物分布与体外测试所观察到的分布相同(图 3)。
[0162]本实施例显示用本发明所定义的(+)_客烯合酶转化的大肠杆菌细胞能够生产(+)_客烯。用于转化大肠杆菌的其它酶对于生产(+)_客烯并不是必需的。事实上，当只用(+)_客烯合酶转化大肠杆菌细胞时，其也能生产(+)_客烯，只是产量较低。用于转化大肠杆菌细胞的其它酶的加入只是为了增加可用于(+)_客烯合酶的前体的量的目的。
[0163]实施例5
_4] 重组VzZS蛋白质在酵母中体内生产(+)_客烯的应用
[0165]为了在酵母细胞体内生产倍半萜，通过将原有的ERG9启动子替换为MET3启动子而下调酿酒酵母菌株(YNP5)中的ERG9基因(用于编码鲨烯合酶，该酶将FPP转化为鲨烯)的表达，从而获得具有弱化麦角留醇生物合成和提高的可用于倍半萜合酶的FPP池的菌株(Asadollahi, M.A., Maury, J., M0ller., K, Nielsen, K.F., Schalk, Μ., Clark, A.,和Nielsen, J., Biotechnology and Bioengineering99(3), 666-677，2008)。[0166]使用Ctg306_start_opt(SEQ ID NO:16)和 Ctg306_stop_opt(SEQ ID NO:17)从pETDuet-VzZS-opt质粒扩增出VzZS cDNA。使用Pfu DNA聚合酶(Promega)和下列热循环条件进行该PCR:94°C下90秒；94°C下30秒、55 °C下30秒、72 °C下4分钟，35个循环；和72°C下10分钟。将扩增的cDNA纯化并在0.2mM dATP和IU HotStart Taq DNA聚合酶的存在下
于72°C在适当缓冲液(Qiagen)中培育15分钟以添加3’A突出端。使用pYES2.1 TOPOi0TA 表达试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)将该 cDNA 连接至 pYES2.l/V5_His-TOPO*质粒上。以插入物的正确的序列和取向对质粒进行筛选，并使用S.c.EasyComp?转化试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)用该质粒转化YNP5酵母细胞。
[0167]取该转化酵母菌株的一个单一菌落接种20ml添加有2%葡萄糖的YNB培养基(5g/L (NH4)2SO4 ；3g/L KH2PO4 ；0.5g/L MgSO4.7H20 ；lmL/L 痕量金属溶液)。在 28°C下培育该培养物24小时。通过离心回收细胞并重悬浮于20mL添加有2%半乳糖的YNB培养基中。培养1小时后，向培养物中加入终浓度为0.5mM的甲硫氨酸和2mL癸烷。在28°C下培育24小时后，用乙酸乙酯萃取该培养物并按实施例3所述进行GC-MS分析。在这些条件下由酵母细胞生产的倍半萜的总质量估计为25mg/L。
【权利要求】
1.具有(+)-客烯合酶活性的多肽，该多肽包含与SEQID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于包含与SEQID NO:1有至少70%、优选至少90%同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于包含氨基酸序列SEQID NO:1。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于由SEQID NO:1组成。
5.编码权利要求1~4中任一项所述的多肽的核酸。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于包含与SEQID NO:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列有至少50%、优选至少70%、优选至少90%同一性的核苷酸序列。
7.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于包含核苷酸序列SEQID NO: 2,SEQ ID NO: 11或它们的互补序列。
8.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于由SEQID NO:2、SEQ ID NO: 11或它们的互补序列组成。
9.包含权利要求5~8中任一项所述的核酸的表达载体。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其为病毒载体、噬菌体或质粒的形式。
11.根据权利要求9 或10所述的表达载体，包括本发明的核酸并非强制选择地包括至少一种选择标记，该核酸可操作地与至少一种调控序列连接，该调控序列控制转录和/或翻译的开始和/或终止，如转录的启动子、操纵子或增强子或mRNA核糖体的结合部位。
12.—种非人宿主生物体或细胞，经转化以包含至少权利要求5~8中任一项所述的核酸，从而其异源表达或过表达权利要求1~4中任一项所述的至少一种多肽。
13.根据权利要求12所述的非人宿主生物体，其特征在于为植物、原核生物或真菌。
14.根据权利要求12所述的非人宿主生物体，其特征在于为微生物，优选细菌或酵母。
15.根据权利要求14所述的非人宿主生物体，其特征在于所述细菌为大肠杆菌并且所述酵母为酿酒酵母。
16.根据权利要求12所述的高等真核细胞，其特征在于为植物细胞或真菌细胞。
17.生产(+)_客烯的方法，包含: a)将FPP与权利要求1~4中任一项所述的至少一种多肽接触； b)非强制选择地，分离在步骤a)中产生的(+)_客烯。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于步骤a)包含在有助于生产(+)_客烯的条件下培养权利要求12~15中任一项所述的非人宿主生物体或细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于还包含在步骤a)之前用权利要求5~8任一项所述的至少一种核酸转化能够生产FPP的非人宿主生物体或细胞以使所述生物体表达由所述核酸编码的多肽。
20.生产权利要求1~4任一项所述的至少一种多肽的方法，包含: a)培养权利要求12~15任一项所述的非人宿主生物体或细胞； b)从步骤a)中培养的非人宿主生物体或细胞中分离多肽。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于还包含在步骤a)之前用权利要求5~8任一项所述的至少一种核酸转化能够生产FPP的非人宿主生物体或细胞，以使所述生物体表达由所述核酸编码的多肽。
22.制备具有(+)_客烯合酶活性的变体多肽的方法，包含步骤: (a)选择权利要求5~8任一项所述的核酸； (b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸； (c)用该突变核酸序列转化宿主细胞或单细胞生物以表达由该突变核酸序列编码的多肽； (d)按照至少一种修饰的性质筛选该多肽；和， (e)非强制选择地，如果该多肽不具有期望的变体(+)_客烯合酶活性，则重复步骤(a)至(d)直到获得具有所期望的变体(+)_客烯合酶活性的多肽； (f)非 强制选择地，如果在步骤(d)中鉴别出具有所期望的变体(+)_客烯合酶活性的多肽，则分离在步骤(C)中获得的相应突变核酸。
【文档编号】C12N15/60GK104017794SQ201410200220
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2010年5月12日 优先权日:2009年5月20日
【发明者】M·沙尔克, F·德盖里 申请人:弗门尼舍有限公司