一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成的序列如序列表中序列2和序列表中序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；PCR产物的检测：PCR反应产物中加入SYBR?Green?I核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为太子参药材或原植物，PCR反应产物未产生绿色荧光的样品即为其它植物材料。本发明可根据太子参药材或原植物的特异性DNA片段(其序列如序列表中序列1所示)设计得到的一组引物(其序列如序列表中序列2和序列表中序列3所示)快速、准确的鉴别出太子参药材或原植物，该方法重现性好，效果明显。
【专利说明】一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药材或原植物的真伪鉴别方法，尤其是一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法。
【背景技术】
[0002]太子参，石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax etHoffm的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效，用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、肺燥干咳等症的治疗。作为药食两用品种，太子参近年来得到了广泛的开发与利用。同时为牟取私利，市场上出现了以淡竹叶Lophatherum gracile.、繁缕Stellariamedia、宝择草 Disporum sessile、直立百部 Stemona sessilifolia、百部 S.japonica、对叶百部S.tuberosa、禾叶山麦冬Liriope graminifolia、阔叶山麦冬L.spicata、矮小山麦冬L.minor植物的根或块根冒充太子参销售的现象，严重危害了消费者的健康。因此对太子参药材或原植物进行鉴别就显得尤为重要。
[0003]传统的太子参鉴别主要依靠性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定。但太子参伪品外形与正品外形较为相似，容易混淆，特别是加工粉碎后，药材饮片特征消失、细胞差别不明显、理化反应繁锁等等，一般人难以区分，因此上述鉴别方法均难以真正达到鉴别的目的，针对这种粉末类的、传统鉴定方法难以准确判定的易混药材、掺伪药材，建立一种操作简捷、结果准确可靠的新型鉴定方法具有重要的现实价值和实践意义。
[0004]DNA分子鉴定方法是一种新型的鉴别方法，其根据基因组序列进行比较研究，在很大程度上弥补和克服了传统鉴定的缺陷和难题。一般进行DNA分子鉴定的流程是这样的:根据正品、伪品药材特定区域的DNA序列(即特异性DNA片段)，设计有高度特异性的正品鉴别引物，利用鉴别引物对所提取样品的DNA进行PCR扩增，经凝胶电泳检测鉴别样品真伪。但是目前由于确定太子参药材或其原植物的特异性DNA片段存在困难，无法根据特异性DNA片段来设计正品鉴别引物，因而并不能采用分子鉴别的方法来快速鉴别太子参药材或其原植物。此外，DNA分子鉴定方法中采用凝胶电泳检测的方法进行鉴别，不仅电泳过程繁琐、耗时，而且电泳所用的溴化乙锭(EB)试剂污染环境、危害人体的健康。因此探讨一种更安全、更灵敏的分子标记检测方法将有助于特异性PCR鉴定技术的推广及大规模样品的鉴定。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供可快速、准确的鉴别太子参药材或原植物的一段特异性DNA片段及一组引物；
[0006]本发明的另外一个目的是提供一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案:太子参药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。序列表中序列I为太子参药材或原植物的rDNA-1TS2核苷酸序列的一个片段。[0008]太子参药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列I所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。
[0009]权利要求2所述的引物在太子参药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。
[0010]包括权利要求2所述引物的试剂盒。
[0011]太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，包括以下步骤:利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；PCR反应产物中加入SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为太子参药材或原植物，PCR反应产物未产生绿色荧光的样品即为其它植物材料。
[0012]优选的，所述的对鉴别样品进行PCR反应包括:提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。
[0013]更优选的，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤:取鉴别样品I~5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。
[0014]前述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法中，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液5~13 μ L，上游和下游引物各为10~25pmol，DNA模板20~150ng,灭菌重蒸 水加至25 μ L ;反应程序为:93~96°C预变性I~5min, 93~96°C变性5~30s，52~64°C退火延伸15~40s，变性、退火延伸共进行30~40次循环；最后71~73°C后延伸I~5min ;PCR产物的检测:PCR反应产物中加入I~5 μ LlOO X SYBR GreenI核酸荧光染料，混匀后在300~400nm紫外光下观察。
[0015]优选的，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液5.5~7 μ L，上游和下游引物各为10~15pmol, DNA模板20~IOOng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:94~95°C预变性I~2min，94~95°C变性5~8s，56~62°C退火延伸15~20s，变性、退火延伸共进行30~35次循环；最后72~73°C后延伸I~2min ;PCR产物的检测:PCR反应产物中加入I~2μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在340~380nm紫外光下观察。
[0016]更优选的，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液5.5 μ L，上游和下游引物各为10pmol，DNA模板20~80ng，灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:95°C预变性lmin，95°C变性5s，56°C退火延伸15s，变性、退火延伸共进行30次循环；最后72°C后延伸lmin ;PCR产物的检测:PCR反应产物中加入I μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察。
[0017]发明人进行了一系列实验，以选择本发明提供的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法的鉴别条件等，证明本发明鉴别方法的有效性。具体如下:
[0018]一、序列的获取与比对
[0019]在NCBI (美国国立生物技术信息中心，National Center for BiotechnologyInformation)下载到太子参、阔叶山麦冬、繁缕等的物种rDNA_ITS2片段，共计25条序列，登录号分别为 JF830349.1、EF197887.1、EF197886.1、EF197885.1、EF197884.1、EF197883.UEF197882.UEF197881.UEF197880.UEF197879.UFJ384025.UAY849797.1、JF327839.UJF327838.UJF327840.UJF327841.UAB721393.UKC439470.UEU930852.1、EU930853.1、EU930854.1、JN589063.1、EU785985.1、L78051.1、AY936245.1。发明人运用Clustal X2.1软件对这些序列进行排序、比对、分析后发现:rDNA_ITS2序列能较好地反映出太子参及其混伪品之间的种间差异，基于该差异，发明人进一步设计获得了具有稳定差异的太子参特异性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
[0020]二、引物的设计与筛选
[0021]运用Premier Primer5.0软件对上述太子参特异性DNA片段进行引物设计，调整参数使上游引物在太子参的特异性片段内，长度在100~500bp，共设计了 3组引物，分别命名为Tzs-lF/Tzs-lR、Tzs-2F/Tzs-2R、Tzs-3F/Tzs-3R，各引物序列见表1。由上海生工生物科技有限公司合成。
[0022]根据引物序列Tzs-lF/Tzs-lR、Tzs-2F/Tzs-2R、Tzs-3F/Tzs_3R 的 Tm 值(DNA 熔解温度)及扩增产物的长度，预先设置了特异性PCR扩增体系与扩增程序验证此3组引物的特异性。其体系及扩增程序见表1。取6yL PCR扩增产物加入含EB的1.0%琼脂糖凝胶中，80V稳定电压电泳lh，紫外凝胶成像系统观察，拍照保存。结果如图5所示。
[0023]表1引物及PCR反应条件
【权利要求】
1.太子参药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列I所/Jn ο
2.太子参药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列I所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。
3.权利要求2所述的引物在太子参药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。
4.包括权利要求2所述引物的试剂盒。
5.太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤:利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；PCR反应产物中加入SYBR GreenI核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为太子参药材或原植物，PCR反应产物未产生绿色荧光的样品即为其它植物材料。
6.根据权利要求5所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的对鉴别 样品进行PCR反应包括:提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。
7.根据权利要求6所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤:取鉴别样品I~5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。
8.根据权利要求5~7任一所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液5~13 μ L，上游和下游引物各为10~25pmol,DNA模板20~150ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:93~96°C预变性I~5min，93~96°C变性5~30s，52~64°C退火延伸15~40s，变性、退火延伸共进行30~40次循环；最后71~73°C后延伸I~5min ；PCR产物的检测:PCR反应产物中加入I~5μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在300~400nm紫外光下观察。
9.根据权利要求8所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液5.5~7 μ L，上游和下游引物各为10~15pmol, DNA模板20~IOOng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:94~95°C预变性I~2min，94~95°C变性5~8s，56~62°C退火延伸15~20s，变性、退火延伸共进行30~35次循环；最后72~73°C后延伸I~2min ；PCR产物的检测:PCR反应产物中加入I~2μ LlOOXSYBRGreen I核酸荧光染料，混匀后在340~380nm紫外光下观察。
10.根据权利要求9所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25 μ L,反应液组成为:Taq酶预混液5.5 μ L,上游和下游引物各为IOpmol,DNA模板20~80ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:95°C预变性lmin, 95°C变性5s，56°C退火延伸15s，变性、退火延伸共进行30次循环；最后72°C后延伸lmin ;PCR产物的检测:PCR反应产物中加入I μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察。
【文档编号】C12N15/11GK104017863SQ201410206387
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】周涛, 赵丹, 江维克, 袁媛, 肖承鸿 申请人:贵阳中医学院, 贵州三泓药业股份有限公司