一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，包括：利用由序列表中序列1设计合成序列表中序列2和序列3所示的引物，以序列2和序列3对鉴别样品的基因组DNA进行一次PCR反应；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：PCR反应产物经凝胶电泳后凝胶成像系统紫外观察，在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，未出现条带则为非杜仲药材或原植物；或者在PCR反应产物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察，产生绿色荧光则为杜仲药材或原植物，否则为非杜仲药材或原植物。本发明可快速、准确的鉴别出杜仲药材或原植物，操作简捷、实用性好。
【专利说明】一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药材或原植物的真伪鉴别方法，尤其是一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法。
【背景技术】
[0002]杜仲Eucommia ulmoides Oliv.为中国特有树种，早在一千年前已为民间栽培入药使用，具有补肝肾、强筋骨的作用，现代临床用于治疗高血压病，疗效良好。另外，杜仲的树干、枝、叶、果中含有大量橡胶，也是一种优良的经济树木。
[0003]杜仲的种质资源遗传多样性比较丰富，不同产地或生境的杜仲原植物，其叶、芽、花、果等方面会表现出不同的特点，树皮也存在多个变异类型，如深纵裂型、浅纵裂型、龟裂型和光皮型，这就导致以树皮入药的杜仲药材易于产生掺假现象，如以断面有白色橡胶丝的红杜仲藤 Urceola quintaretii (Pierre)D.J.Middleton、紫花络石 TrachelospermumaxilIare Hook.f.、白杜Euonymus maackii Rupr.等植物的莖皮混充杜仲药材销售，而这些植物树皮在药理、药效及临床应用上与杜仲药材有很大的差别，有的甚至会产生毒副作用。
[0004]目前，杜仲研究大都以树皮、叶片等形态差异和解剖学特征为基础进行鉴别，有时也结合理化分析来鉴别，但是这种鉴别方法不仅费时费力，而且鉴别的准确性也较差。另外，虽然也有关于使用DNA分子测序技术分析rDNA-1TS2、matK片段的核酸序列来鉴定杜仲原植物真伪的报道，但是该方法操作复杂、成本高、耗时费力，且适用性差，不能大范围推广应用，也不能满足大规模样品鉴定的需求。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供可快速、准确的鉴别杜仲药材或原植物的一段特异性DNA片段及一组引物；
[0006]本发明的另外一个目的是提供一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案:杜仲药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
[0008]杜仲药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列I所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。
[0009]前述的引物在杜仲药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。
[0010]包括前述引物的试剂盒。
[0011]杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，包括以下步骤:利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；再采用以下两种方法之一进行鉴别:将PCR反应产物加入含溴化乙锭(即EB)的琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物；或者在PCR反应产物中加入SYBR GreenI核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物。
[0012]本发明中所述的对鉴别样品进行PCR反应包括:提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。
[0013]具体的说，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤:取鉴别样品2~5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。
[0014]前述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法中，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为=Taq酶预混液5~11 μ L，上游和下游引物(所述的上游引物即引物序列表中序列2所示的引物，下游引物即引物序列表中序列3所示的引物)各为5~40pmol，DNA模板50~200ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:94~96°C预变性30~300s, 94~96°C变性2~30s，45~65°C退火2~30s，71~73°C延伸2~45s，变性、退火、延伸一共进行27~39次循环；最后71~73°C后延伸18~300s ;PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行:取4~7 μ L PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.0%~1.5%琼脂糖凝胶中，65~100V稳压电泳35~50min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入I~3μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在300~400nm紫外光下观察。
[0015]优选的，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液6.5~9 μ L，上游和下游引物各为10~20pmol, DNA模板50~150ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:94~95°C预变性30~120s，94~95°C变性2~10s，60~65°C退火2~15s，72~73°C延伸2~15s，变性、退火、延伸一共进行29~33次循环；最后72~73°C后延伸20~60s ;PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行:取5~6μ L PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.1%~1.3% 琼脂糖凝胶中，70~85V稳压电泳35~45min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2~3μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在340~380nm紫外光下观察。
[0016]更优选的，所述的PCR反应体系为25 μ L，反应液组成为:Taq酶预混液7.5 μ L，上游和下游引物各为1pmol, DNA模板80~120ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:950C预变性45s，95°C变性5s，62°C退火5s，72°C延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72°C后延伸30s ；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行:取5 μ L PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2 μ LlOOXSYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察。
[0017]发明人进行了一系列实验，以选择本发明提供的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法的鉴别条件等，证明本发明鉴别方法的有效性。具体如下:
[0018]一、序列的获取与比对
[0019]在NCBI (美国国立生物技术信息中心，Nat1nal Center for B1technologyInformat1n)下载至Ij杜仲 Eucommia ulmoides Oliver、大果卫矛 Euonymus myrianthusHemsl.、冬青卫矛 E.japonicus Thunb.、粗糖树 Ehretia macrophylla Wall.、毛杜仲藤 Parabarium huaitingii Chun&Tsiang、桅子皮 Itoa orientalis Hemsl.、紫花络石Trachelospermum axilIare Hook.f.等植物的物种rDNA-1TS片段,共计34条序列，登录号分别为 AY650004.1、AY650000.1、AY649994.1、AY649995.1、AY649998.1、AY649996.1、AY650005.UAY649992.UAY649993.UAY650006.UAY649997.UAY650001.UJF976307.1、JF976306.UJF755926.UKC999842.UKC904097.UJF755927.UKC999832.UHQ393721.1、KC999837.UKC999834.UKC999835.UKC999830.UKC999837.UKC999836.UKC999836.1、KC999839.UKC999839.UKC999840.UKC999831.UKC999838.UKC999841.UKC999833.1。发明人运用ClustalX2.1软件对这些序列进行排序、比对、分析后发现:rDNA_ITS序列能较好地反映出杜仲及其混伪品之间的种间差异，基于该差异，发明人进一步比对分析获得了具有稳定差异的杜仲特异性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
[0020]二、引物的设计与筛选
[0021]发明人使用Premier Primer5.0软件对上述杜仲特异性DNA片段进行引物设计，调整参数使上游引物在杜仲的特异性片段内，长度为100~500bp，共设计了 3组引物，分别命名为 duzhong-lF/duzhong-lR、duzhong-2F/duzhong_2R、duzhong-3F/duzhong_3R,各引物序列见表1。由上海生工生物科技有限公司及北京博迈德生物有限公司合成。
[0022]根据引物序列duzhong-lF/duzhong-lR、duzhong-2F/duzhong_2R、duzhong_3F/duzhong-3R的Tm值(DNA熔解温度)及扩增产物的长度，预先设置了特异性PCR扩增体系与扩增程序验证此3组引物的特异性。其体系及扩增程序见表1。取5yL PCR扩增产物加入含EB的1.2%琼脂糖凝胶中，80~85V稳定电压电泳50min，紫外凝胶成像系统观察，拍照保存。
[0023]表1弓丨物及PCR反应条件
[0024]
【权利要求】
1.杜仲药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
2.杜仲药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列I所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。
3.权利要求2所述的引物在杜仲药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。
4.包括权利要求2所述引物的试剂盒。
5.杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤:利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；再采用以下两种方法之一进行鉴别:将PCR反应产物加入含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物；或者在PCR反应产物中加入SYBR GreenI核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物。
6.根据权利要求5所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的对鉴别样品进行PCR反应包括:提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。
7.根据权利要求6所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤:取鉴别样品2~5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。
8.根据权利要求5~7任一所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为 25 μ L,反应液组成为:Taq酶预混液5~11 μ L,上游和下游引物各为5~40pmol,DNA模板50~200ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:94~96°C预变性30~300s，94~96°C变性2~30s，45~65°C退火2~30s，71~73°C延伸2~45s，变性、退火、延伸一共进行27~39次循环；最后71~73°C后延伸18~300s ;PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行:取4~7 μ L PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.0%~1.5%琼脂糖凝胶中，65~100V稳压电泳35~50min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入I~3μ LlOOXSYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在300~400nm紫外光下观察。
9.根据权利要求8所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25 μ L,反应液组成为:Taq酶预混液6.5~9 μ L,上游和下游引物各为10~20pmol,DNA模板50~150ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:94~95°C预变性30~120s，94~95°C变性2~10s，60~65°C退火2~15s，72~73°C延伸2~15s，变性、退火、延伸一共进行29~33次循环；最后72~73°C后延伸20~60s ；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行:取5~6μ L PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.1%~1.3%琼脂糖凝胶中，70~85V稳压电泳35~45min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2~3μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在340~380nm紫外光下观察。
10.根据权利要求9所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25 μ L,反应液组成为:Taq酶预混液7.5 μ L,上游和下游引物各为1pmol, DNA模板80~120ng,灭菌重蒸水加至25 μ L ;反应程序为:95°C预变性45s, 95°C变性5s，62°C退火5s，72°C延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72°C后延伸30s ;PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行:取5yL PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中 加入2 μ LlOO X SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察。
【文档编号】C12N15/11GK104073560SQ201410304972
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】周涛, 赵丹, 江维克 申请人:贵阳中医学院