一种细胞生存保护剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞生存保护剂及其应用。本发明提供的细胞生存保护剂是含0.01mg/L～0.1g/L亚硒酸钠的普通细胞培养液；其应用于细胞保存及细胞抗病毒中。本发明提供的细胞生存保护剂具有延长培养细胞生命力的作用，而且能保护细胞免受致病性病毒的攻击；为增强人类及动物的抗病能力及研制富硒疫苗提供了一种新的思路，具有重要的研究价值。
【专利说明】—种细胞生存保护剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞学领域，尤其涉及的是一种细胞生存保护剂及其应用。
【背景技术】
[0002]1918年瑞典人发现硒元素后，1957年法国人施瓦茨发现Se是一种预防肝坏死的保护因子，1973年世界卫生组织宣布硒为人体必需的元素。硒(Se)作为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的成分，能催化还原型谷胱甘肽为氧化型谷胱甘肽，是一种强力抗氧化元素，它抗氧化力比VE大50-500倍，人类有490多种疾病与缺Se有关。Se能保护缺铁缺氧心肌细胞结构和功能完整性，并保护细胞膜功能及预防细胞坏死和突变。硒通过其强力抗氧化作用，清除机体内过剩的自由基(氧毒)，减少或延迟脂褐素的形成，拮抗汞等重金属之毒害，从而达到抗细胞衰老和死亡的目的。
[0003]据国际施瓦茨奖获得者于树玉教授的研究表明:硒可使培养细胞分裂指数下降，生长速度缓慢，贴壁能力增强，生长饱和密度下降；硒对HL-60细胞有诱导分化作用。硒增加细胞代谢中的环核苷酸，从而分裂减慢，它又能保护淋巴细胞免受致癌物引起DNA损伤作用。细胞培养表明，硒可抑制食管癌，肝癌，胃癌和口腔癌，人肺腺癌细胞的生长，硒又能抑制肿瘤细胞的增殖并促其凋亡。为此研究探索Se对培养细胞的影响力及对当前流行的重大动物病毒性传染病的预防和控制，具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种细胞生存保护剂及其应用。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]一种细胞生存保护剂，是含0.01mg/L~0.lg/L亚硒酸钠的普通细胞培养液。
[0007]所述的细胞生存保护剂应用于细胞保存及细胞抗病毒中。
[0008]所述的细胞是BHK-21细胞、Marcl45细胞、ST细胞、PK15细胞及IBRS-2细胞中的一种。
[0009]本发明提供的细胞生存保护剂具有延长培养细胞生命力的作用，而且能保护细胞免受致病性病毒的攻击；为增强人类及动物的抗病能力及研制富硒疫苗提供了一种新的思路，具有重要的研究价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为正常BHK-21细胞加0.01mg/LSe的培养液培养5年时形态(100X)。
[0011]图2为正常细胞Marcl45加0.lg/L硒的培养液培养5年时(100X)。
[0012]图3为正常细胞Marcl45加0.0 lg/L硒的培养液培养5年时(100X)。
[0013]图4为正常细胞Marcl45加0.lmg/L硒的培养液培养5年时(100X)。
[0014]图5为正常细胞Marcl45加0.lmg/L硒的培养液培养I年后传代至第四年时(IOOX)。
[0015]图6为BHK-21细胞接种FMDV后加0.01mg/LSe的培养液后三年半时形态(100X)。
[0016]图7为BHK-21细胞接种FMDV后加含0.01mg/LSe的培养液一年后又传第二代至两年半时(100X)。
[0017]图8为Marcl45接PRRSV后补加含0.0 lg/L硒的培养液培养3年时(100X)。
[0018]图9为Marcl45接PRRSV后补加含lmg/L硒的培养液培养5年时(100X)。
[0019]图10为Marcl45接PRRSV后补加含0.lmg/L硒的培养后传代至两年(100X)。
[0020]图11为Marcl45接PRRSV后补加含0.01mg/L硒的培养液培养3年时(100X)。
[0021]图12为普通培养液培养的ST细胞4日龄时(100X)。
[0022]图13为ST细胞接种TGEV后补加含有0.01mg/L亚硒酸钠的培养液培养三年多时(100X)。
[0023]图14为普通培养液培养的PK-15细胞6日龄时。
[0024]图15为普通培养液培养的PK-15细胞接种TGEV后24h。
[0025]图16为PK-15细胞加含0.01mg/L亚硒酸钠的培养液后接种TGEV(75天)时。
[0026]图17为普通培养液培养的IBRS-2细胞4日龄时。
[0027]图18为普通培养液培养的IBRS-2细胞接种FMDV24h时。
[0028]图19为IBRS-2细胞加含0.01mg/L亚硒酸钠的培养液后接种FMDV后细胞形态。【具体实施方式】
[0029]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例
[0030]1、材料
[0031]硒元素:亚硒酸钠(Na2SeO3),为天津恩化学试剂有限公司出品；抗生素青霉素、链霉素、卡那霉素等，均为天津制药厂出品；细胞株(BHK-21、PK-15、IBRS-2、Marcl45、及ST细胞)及病毒株(口蹄疫病毒(FMDV)OMIII毒株、猪繁殖与呼吸征病毒(PRRSV) JXAl毒株及传染性胃肠炎(TGEV)TS毒株，均由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病研究室保存；主要试剂:胎牛血清-Hyclone、胰酶、DMEM均购自Gibco公司。
[0032]2、方法
[0033]2.1细胞生存保护剂的配制
[0034]I)普通细胞培养液的配制
[0035]细胞普通培养基成份为:普通的DMEM溶液，加2% -10%的牛血清(Hyclone) ,1%的三抗(青霉素、链霉素、卡那霉素)，1% NaHCO3。
[0036]2) I %亚硒酸钠水溶液的配制
[0037]称取Ig亚硒酸钠，加新煮沸过的冷双蒸水100ml，滤过除菌后分装保存；临用前进行稀释。
[0038]3)细胞生存保护剂的配制
[0039]细胞普通培养基中添加0.01mg/L—0.lg/L的亚硒酸钠即为本发明中的细胞生存保护剂。
[0040]2.2 方法[0041]2.2.lBHK-21、Marcl45、ST、PK15 及 IBRS-2 细胞的复苏传代
[0042]各取液氮冻存细胞管一支，37°C水浴迅速解冻，用无菌吸管吸出细胞悬液，移入无菌细胞瓶中，补加DMEM细胞培养液至10ml，37°C培养5_6小时，换新的细胞培养液，37°C培养3-4天，待细胞生长为致密单层后，用无菌吸管吸出液体，加入细胞消化液(1:20胰酶)，37°C消化2-5分钟，吸出大部分细胞消化液，待细胞层松散、细胞圆缩时，吸出所有细胞消化液，补加细胞培养液，用吹打管吹打细胞制成细胞悬液，按需要的比例补加细胞培养液后吹打均匀，取适量细胞悬液移入新细胞瓶中，370C培养。
[0043]2.2.2普通培养及加入亚硒酸钠培养对比试验
[0044]对不同的细胞，细胞铺满整个视野时，分别按1:4分细胞，共四瓶，两瓶加普通细胞培养液培养，另两瓶加入含0.01mg/L亚硒酸钠的普通培养液培养，观察细胞的变化情况。
[0045]2.2.3 结果
[0046]I)硒对BHK-21细胞的影响
[0047]培养成单层的BHK-21细胞，弃旧营养液加入普通细胞培养液后，到第五天细胞已全部死亡。而含亚硒酸钠0.01mg/L的培养液培养BHK-21细胞，培养5年时，仍有60% -70%的细胞存活(如图1所示)；用 普通的细胞培养液培养细胞，5-10天全部凋亡。
[0048]2)硒对Marcl45细胞的影响:
[0049]在培养成单层的Marcl45细胞中加入含0.01mg/L亚硒酸钠的培养液，培养5年时仍旧有60%的细胞存活；Marcl45细胞对硒的耐受性较其他细胞强，在含0.lg/L亚硒酸钠的培养液中，仍旧有细胞30% -40%的细胞存活(见图2-5)。
[0050]2.2.4硒抗病毒感染细胞试验
[0051]两日龄的传代细胞，用DMEM洗涤细胞I次，对照细胞洗涤后加普通培养液；病毒对照细胞不加0.01mg/L亚硒酸钠，只按1:10接毒；加硒后接毒细胞按1:10接毒；37°C培养I小时后补充含有不同浓度(0.ΟΙ-lmg/L)亚硒酸钠的含2%牛血清的细胞营养液。37°C静置培养，倒置显微镜观察细胞病变情况并记录，阶段性进行摄影并保存结果。培养观察细胞病变情况并做记录。
[0052]2.2.5 结果
[0053]I)硒对BHK-21细胞抵抗FMDV感染试验
[0054]培养成单层的BHK-21细胞，接种FMDV细胞，培养到24h全部病变脱壁。而BHK-21细胞接种FMDV病毒后又补充了含0.01mg/L亚硒酸钠培养液的BHK-21细胞，培养5年时仍有60%细胞存活(如图6-7所示)。该试验仍在进行中。
[0055]2)硒对Marcl45细胞抵抗猪繁殖与呼吸综合症的效力试验结果
[0056]Marc 145正常细胞，在DMEM培养液中，培养到第9天全部凋亡，而接种了接种病毒的细胞2-6天全病变凋亡。而用含0.01g/L亚硒酸钠的培养液培养的细胞及接种病毒细胞，观察到16个月，仍有约70%细胞正常存活。为了证实该病毒活力及细胞活力，培养到18个月和36个月时，对用含0.01g/L亚硒酸钠的培养液培养的细胞，消化后重新培养，该细胞一直观察5年多，仍有60%细胞存活(图8-11)
[0057]3)硒对ST细胞抵抗TGEV感染试验
[0058]普通培养液培养的ST细胞，培养到21天全部凋亡脱壁，接种TGEV的细胞培养3天，细胞全部病变凋亡。用含有0.01mg/L亚硒酸钠细胞培养液培养的ST细胞以及接种TGEV病毒后补加含0.01mg/L亚硒酸钠的培养液培养的接毒细胞到120天细胞数量无明显变化。换含0.01mg/L的亚硒酸钠的新鲜培养液继续培养，到380天时，为了证实细胞的存活性，加胰酶消化后，继续在含0.01mg/L亚硒酸钠的培养液中原瓶培养,一直观察两年多，仍有50%的细胞存活(图12-13)。
[0059]4)硒对PK15细胞抵抗猪流行性腹泻病毒感染试验
[0060]对培养两日龄的PK15单层细胞，弃旧液，更换含亚硒酸钠0.01g/L及lmg/L的细胞培养液，另一瓶用含亚硒酸钠lmg/L培养的PK15细胞接种了 TGEV病毒，同时继续培养观察。结果表明，普通培养液培养的细胞，第6天已全部凋亡；而接毒对照细胞培养70h，全部病变死亡；而用含亚硒酸钠lmg/L的培养液培养的细胞及相同硒量液培养细胞后接种TGEV病毒，观察到75天，仍均有90%的细胞存活(如图14-16所示)。
[0061]5)硒对IB-RS-2细胞培养的生长影响力及抗病毒感染效力试验
[0062]用3日龄单层细胞，加入含亚硒酸钠0.01mg/L的细胞培养液中，观察11天时，接种FMDV，结果用含亚硒酸钠0.01mg/L的培养液培养的细胞仍有90%细胞正常生长，而普通培养的对照细胞培养到第6天时全部凋亡，接毒对照细胞到第2天时细胞全部病变死亡(图 17-19)。 [0063]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种细胞生存保护剂，其特征是，含0.01mg/L~0.lg/L亚硒酸钠的普通细胞培养液。
2.根据权利要求1所述的细胞生存保护剂的应用，其特征是，应用于细胞保存及细胞抗病毒中。
3.根据权利要求1所述的细胞生存保护剂的应用，其特征是，所述细胞是BHK-21细胞、Marc 145细胞、ST细胞、PK15细胞及IBRS-2细胞中的一种。
【文档编号】C12N5/071GK103981143SQ201410208537
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】杨彬, 刘兆弼, 兰喜, 刘光远, 娄中子, 张韵, 柳纪省 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所