神经细胞保护剂的制作方法

专利名称：神经细胞保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有盐酸多奈哌齐的神经细胞保护剂。
背景技术：
盐酸多奈哌齐是通过可逆地抑制分解乙酰胆碱的酶乙酰胆碱酯酶而使脑内的乙酰胆碱量增加，激活脑内胆碱能神经系统的物质。该物质作为阿耳茨海默氏型老年痴呆、阿耳茨海默病的治疗药而被广泛应用(日本专利第2578475号公报)，各研究机构对盐酸多奈哌齐进行着研究。Jin Zhou等发表了乙酰胆碱酯酶抑制剂对于大鼠PC12细胞(肿瘤细胞)的缺血性细胞损伤具有保护效果的论文，使用盐酸多奈哌齐作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的一例(Zhou，J，.Fu，Y.，Tang，X.C.，2001.Huperzine A and donepezil protect rat pheochromocytoma cellsagainst oxygen-glucose deprivation.Neurosci.Lett.306，53-56))。
但是，盐酸多奈哌齐对神经细胞损伤的保护效果的详细情况尚不明确。
上述文献中使用的PC12细胞是嗜铬细胞瘤(褐色細胞腫)，也称为嗜铬性细胞瘤，是由肾上腺髓质或交感神经节细胞等嗜铬细胞产生的儿茶酚胺生成肿瘤。因此，已知PC12细胞不是脑神经细胞，在细胞间不形成突触，此外也没有对兴奋性物质反应的功能(Sucher，N.J，1993.Expression of Endogenous NMDAR1 Transcripts without ReceptorProtein Suggests Post-transcriptional Control in PC12 Cells.Thejournal of Biological Chemistry.Vol.268，No.30，22299-22304.)。即，上述文献中仅对于癌变的细胞进行了研究，但完全没有进行使用通过脑神经细胞新制备的原代培养神经细胞的研究。因此，证明盐酸多奈哌齐对实际的神经细胞中的缺血性伤害的保护效果的数据尚不为人所知。

发明内容
本发明的目的为提供保护神经细胞(尤其是中枢神经系统的神经细胞)的药物。
本发明人为了解决上述课题进行了刻苦研究，结果意外地发现盐酸多奈哌齐具有保护神经细胞(尤其中枢神经系统的神经细胞)的作用，从而完成了本发明。即，本发明如下。
(1)含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中枢神经系统的神经细胞保护剂(包括日本特开平1-79151号公报所述的化合物)。优选这些化合物的盐为盐酸盐。
(i)以下述化学式表示的1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚满酮)-2-基]甲基哌啶或其可药用盐。
(特许2578475号权利要求项(以下称为[c1.])1)(ii)以下的通式(I)表示的环状胺衍生物或其可药用盐。
[式中，J表示选自以下式 茚满酮基 茚基
茚满二酮基 亚茚满酮基(インダノリテニル)
(式中，S表示碳原子数1～6的低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基、卤原子或羟基。t表示0或1～4的整数。(S)t可以在结合的苯环的相邻碳原子间形成亚甲二氧基或亚乙二氧基。式(1)中的Y表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基，式(k)中V表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基，式(n)中W1及W2相互独立、相同或不同，表示氢原子、碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基，W3表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基。式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯环A可以被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基取代。)表示的基团的一价或二价基团。B为以式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整数，R2分别独立地表示氢原子或甲基)表示的基团、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团。K作为取代基，表示可以被卤代的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、硝基、卤原子、羧基、苄氧基、碳原子数1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子数1～6的单烷基氨基、碳原子数1～6的二烷基氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6酰氨基、环己基氧基羰基、碳原子数1～6的烷基氨基羰基、碳原子数1～6的烷基羰基氧基、羟基、可以具有甲酰基或烷氧基(碳原子数1～6)烷基(碳原子数1～6)的苯基烷基。 表示单键或双键。
(iii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐。

(特许2733203号c1.7)(iv)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐。
(特许2733203号cl.8)
(v)以下通式(I-1)表示的环状胺衍生物或其可药用盐。
[式中，J1-1表示碳原子数1～6的低级烷基(以下简称为低级烷基)；环己基；可以具有低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基(以下简称为低级烷氧基)、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基(ピラジル基)；式 (式中，G表示式 表示的基团、式 表示的基团、式-O-表示的基团、式 表示的基团、式-CH2-O-表示的基团、式-CH2-SO2-表示的基团、式 表示的基团或式 表示的基团。B表示碳原子或氮原子。)ピ表示的基团；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氢原子或低级烷氧基羰基)表示的基团。B表示式-(CH2)n-表示的基团、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氢原子、低级烷基、苯基或低级烷基磺酰基)表示的基团、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氢原子、低级烷基、可以具有低级烷基、低级烷氧基、卤素或羟基作为取代基的苯基、苄基或吡啶基)表示的基团、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基团、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基团、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基团、式-CO-(CH2)n-表示的基团、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基团或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基团(以上的式中，n表示0或1～10的整数)。T1表示碳原子。K表示苯基可以具有低级烷基、低级烷氧基、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为具代基的苯基烷基(烷基的碳原子数1～2)；肉桂基；低级烷基；吡啶基甲基；环烷基(环烷基的碳原子数3～6)烷基；金刚烷甲基；糠基；碳原子数3～6的环烷基或酰基。q表示1或2(特许3078244号cl.1)(vi)以下通式(I-2)表示的环状胺衍生物或其可药用盐。
[式中，J1-2表示可以具有碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基作为取代基的茚满酮基。T2表示氮原子。B、K以及q含义如上所述。](特许3078244号cl.2)(vii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐。


(特许3078244号cl.4)(2)含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的，中枢神经系统的神经细胞障碍的预防剂和/或治疗剂。
(i)以下述化学式表示的1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚满酮)-2-基]甲基哌啶或其可药用盐。盐优选盐酸盐。
(特许2578475号cl.1)(ii)以下的通式(I)表示的环状胺衍生物或其可药用盐。
[式中，J表示选自下式 茚满酮基 茚基
茚满二酮基 亚茚满酮基(インダノリテニル)
(式中，S表示碳原子数1～6的低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基、卤原子或羟基。t表示0或1～4的整数。并且(S)t也可以在结合的苯环的相邻碳原子间形成亚甲二氧基或亚乙二氧基。式(1)中的Y表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基，式(k)中V表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷氧基，式(n)中W1及W2相互独立，相同或不同，表示氢原子、碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基，W3表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基。式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯环A可以被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基取代。)表示的基团的一价或二价基团。B为式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整数，R2表示分别独立地为氢原子或甲基)表示的基团、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团。K表示具有可以被卤代的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、硝基、卤原子、羧基、苄氧基、碳原子数1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子数1～6的单烷基氨基、碳原子数1～6的二烷基氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6酰氨基、环己基氧基羰基、碳原子数1～6的烷基氨基羰基、碳原子数1～6的烷基羰基氧基、羟基、甲酰基或烷氧基(碳原子数1～6)烷基(碳原子数1～6)作为取代基的苯基烷基。 表示单键或双键。(特许2733203号cl.1)(iii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐。

(特许2733203号c1.7)(iv)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐。

(特许2733203号cl.8)(v)以下通式(I-1)表示的环状胺衍生物或其可药用盐。
[式中，J1-1表示碳原子数1～6的低级烷基(以下简称为低级烷基)；环己基；可以具有低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基(以下简称为低级烷氧基)、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基、吡啶基或ピラジル基；式 (式中，G表示式 表示的基团、式 表示的基团、式-O-表示的基团、式 表示的基团、式-CH2-O-表示的基团、式-CH2-SO2-表示的基团、式 表示的基团或式 表示的基团。B表示碳原子或氮原子。)表示的基团；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氢原子或低级烷氧基羰基)表示的基团。B表示式-(CH2)n-表示的基团、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氢原子、低级烷基、苯基或低级烷基磺酰基)表示的基团、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氢原子、低级烷基、可以具有低级烷基、低级烷氧基、卤素或羟基作为取代基的苯基、苄基或吡啶基)表示的基团、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基团、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基团、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基团、式-CO-(CH2)n-表示的基团、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基团或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基团(以上式中，n表示0或1～10的整数)。T1表示碳原子。K表示苯基可以具有低级烷基、低级烷氧基、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基烷基(烷基的碳原子数1～2)；肉桂基；低级烷基；吡啶基甲基；环烷基(环烷基的碳原子数3～6)烷基；金刚烷甲基、糠基；碳原子数3～6的环烷基或酰基。q表示1或2(特许3078244号cl.1)(vi)以下通式(I-2)表示的环状胺衍生物或其可药用盐。
[式中，J1-2表示可以具有碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基作为取代基的茚满酮基。T2表示氮原子。B、K以及q含义如上所述。](特许3078244号cl.2)(vii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐。


(特许3078244号cl.4)在上述(1)以及(2)中，化合物的盐优选盐酸盐，特别优选如下式所示的盐酸多奈哌齐。
此外，在上述(2)中，作为神经细胞障碍可以列举由脑缺血、兴奋性毒性或Aβ毒性诱发的障碍，上述脑缺血以及兴奋性毒性，可以列举伴随脑中风、脑梗塞或脑栓塞的任意一种的毒性。此外，上述Aβ毒性可以是伴随阿耳茨海默病或唐氏病的毒性。
在上述(1)或(2)中，细胞为来源于脑的成熟神经细胞，特别可以列举来源于选自大脑皮质、中隔区域以及海马中的任意一种的成熟神经细胞。此外，该神经细胞也可以是原代培养细胞。
(3)含有上述(1)所述的保护剂、或(2)所述的预防剂和/或治疗剂的脑中风、脑梗塞或脑栓塞中任一疾病的预后改善剂。
(4)一种中枢神经系统的神经细胞保护方法，其特征在于，给予患者上述(1)所述的保护剂的有效剂量。
(5)一种中枢神经系统的神经细胞障碍的预防方法和/或治疗方法，其特征在于，给患者施用有效剂量的上述(2)所述的预防剂和/或治疗剂。
在上述(5)中，作为神经细胞障碍，可以列举由脑缺血、兴奋性毒性或Aβ毒性诱发的障碍，上述脑缺血以及兴奋性毒性，可以列举伴随脑中风、脑梗塞或脑栓塞的任意一种的毒性。此外，作为兴奋性毒性，可以列举例如由NMDA或红藻氨酸引起的毒性。进而，上述Aβ毒性，也可以是伴随阿耳茨海默病或唐氏病的毒性。
(6)一种脑中风、脑梗塞或脑栓塞的任一疾病的预后改善方法，其特征在于，给予患者上述(3)所述的预后改善剂的有效剂量。
(7)使用用于制备下述药物的(1)所示化合物，该药物选自上述(1)所述的保护剂、(2)所述的预防剂和/或治疗剂，以及(3)所述的预后改善剂的任意一种。
(8)在Aβ存在下使候选化合物作用对中枢神经系统的胆碱能神经细胞，以检测或测定Aβ凝聚量为特征的，具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可药用盐的筛选方法。
本发明的筛选方法，用上述Aβ凝聚量的检测或测定结果，通过与在不存在上述候选化合物的情况下的Aβ凝聚量比较，可以判定上述候选化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用，是否为目标化合物。
(9)用于在上述(8)所述的方法中使用的，具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可药用盐的筛选试剂盒。
(10)在Aβ存在下使候选化合物作用对中枢神经系统的胆碱能神经细胞，以检测细胞损伤或细胞死亡为特征的在由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或在治疗中有效的化合物或其可药用盐的筛选方法。
在本发明的方法中，用上述细胞损伤或细胞死亡检测的结果，通过与在不存在上述候选化合物的情况下的细胞损伤或细胞死亡程度比较，可以判定上述候选化合物是否具有对Aβ毒性的细胞保护作用，是否为目标化合物。
上述细胞损伤或细胞死亡，可以通过乳酸脱氢酶(LDH)的测定浓度或MTT测定检测。
(11)用于在上述(10)所述的方法中使用的，在由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或在治疗中有效的化合物或可药用盐的筛选试剂盒。


图1是表示在进行氧-葡萄糖(OGD)剥夺的12小时前，1小时前以及OGD处理1小时后向细胞中添加多奈哌齐情况下的大鼠原代培养细胞的LDH释放的直方图。OGD(-)表示没有进行OGD处理，OGD(+)表示进行了OGD处理。Cont以及Vehi为未给药组。采用Dunnett’s test对数据进行分析。图1中[***]表示P＜0.005(以‘未给药组’作为对照)。
图2表示有无OGD处理时的大鼠原代培养细胞的形态学观察，分别表示下述状态的显微镜照片，A为对照，B为实施OGD处理的照片，C为12小时前添加多奈哌齐后进行了OGD处理的照片。比例标尺表示0.1mm。
图3是表示从进行OGD处理12小时前添加各种乙酰胆碱酯酶抑制剂的情况与添加多奈哌齐的情况下的大鼠原代培养细胞的LDH释放的直方图。OGD(-)表示没有进行OGD处理，OGD(+)表示进行了OGD处理。Cont以及Vehi为未给药组。采用Dunnett’s test对数据进行分析。图3中[*]表示P＜0.05，[**]表示P＜0.01，[***]表示P＜0.005(以‘未给药组’作为对照)。
图4是表示从进行OGD处理12小时前添加多奈哌齐的同时添加莨菪胺(Sco)或异莰胺(Mec)情况下的大鼠原代培养细胞的LDH的释放的直方图。OGD(-)表示没有进行OGD处理，OGD(+)表示进行了OGD处理。Cont以及Vehi为未给药组。采用ANOVA和Welch’st-test对数据进行分析。图4中[*]表示P＜0.05，[**]表示P＜0.01，[***]表示P＜0.005(以‘未给药组’作为对照)。
图5为表示多奈哌齐对通过NMDA处理的大鼠原代培养神经细胞的LDH的释放的效果的直方图。多奈哌齐从12小时前添加。Cont以及Vehi为未给药组。采用Dunnett’s test对数据进行分析。图5中[***]表示P＜0.005(以‘未给药组’作为对照)。
图6表示多奈哌齐对通过红藻氨酸处理的大鼠原代培养神经细胞的LDH释放的效果。多奈哌齐从24小时前添加。Cont以及Vehi为未给药组。采用Dunnett’s test对数据进行分析。图6中[***]表示P＜0.005(以‘未给药组’作为对照)。
图7为将培养的大鼠中隔区域神经细胞用抗胆碱乙酰转移酶抗体免疫染色的图。
图8为以LDH作为指标评价多奈哌齐对Aβ(1-40)毒性的保护效果的结果的图。
图9为将培养大鼠中隔区域神经细胞用抗MAP2抗体免疫染色的图。
图10为表示采用CD的变化作为指标测定Aβ的凝聚的结果的图。
图11为表示siRNA对细胞内乙酰胆碱活性的效果的图。
图12为表示siRNA对Aβ(1-40)毒性的保护效果的图。
图13为表示siRNA对Aβ的凝聚的凝聚抑制效果的图。
具体实施例方式
1.概述本发明为含有如下所示的任一化合物(以下，称为“化合物Q”)的中枢神经系统的神经细胞的保护剂、该神经细胞障碍的预防剂和/或治疗剂。此外，通过本发明提供以适量给予预防剂和/或治疗剂为特征的，中枢神经系统的神经细胞的保护方法和/或该神经细胞障碍的预防方法和/或治疗方法。以下，对在本发明的保护剂、预防剂、治疗剂、预后改善剂中使用的化合物Q进行如下说明。
2.化合物Q以下的通式(I)表示的环状胺衍生物以及其可药用盐(参照特开平1-79151号公报、特开平07-252216号公报、特开平10-067739号公报)。
[式中，J表示(a)取代或未取代的如下所示的基团；①苯基、②吡啶基、③吡嗪基(ピラジル基)、④喹啉基、⑤环己烷基、⑥喹喔啉基或⑦呋喃基，(b)选自苯基可以被取代的如下组的一价或二价基团；①二氢化茚基、②茚满酮基、③茚基、④二氢化茚酮基、⑤茚满二酮基、⑥四氢萘酮基、⑦苯并环庚酮基⑧茚满醇基⑨式 表示的基团，(c)由环状胺化合物衍生的一价基团，(d)低级烷基，或(e)式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氢原子或低级烷氧基羰基)表示的基团。
B为式 表示的基团、式 表示的基团、式 (式中，R3表示氢原子、低级烷基、酰基、低级烷基磺酰基、可以被取代的苯基或苄基)表示的基团，式 (式中，R4表示氢原子、低级烷基或苯基)表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团{在以上式中，n表示0或1～10的整数。R2表示氢原子或甲基，即式 表示的亚烷基不具有取代基，或具有1个或1个以上的甲基的形式。)，式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团，式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团，式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式 表示的基团，式-NH-表示的基团，式-O-表示的基团，式-S-表示的基团，二烷基氨基烷基羰基或低级烷氧基羰基。
T表示氮原子或碳原子。
Q表示氮原子、碳原子或式 表示的基团。
K表示氢原子、取代或未取代的苯基、苯基可以被取代的芳基烷基、苯基可以被取代的肉桂基、低级烷基、吡啶基甲基、环烷基烷基、金刚烷甲基、呋喃甲基、环烷基、低级烷氧基羰基或酰基。
q表示1～3的整数。
式中， 表示单键或双键。]化合物(I)中的上述定义中，在J，K，R3，R4中可见的所谓低级烷基表示碳原子数1～6的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、己基、异己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。其中作为优选基团，可以列举甲基、乙基、丙基、异丙基等，最优选甲基。
在J中的所谓‘取代或未取代的如下所示的基团；①苯基、②吡啶基、③吡嗪基(ピラジル基)、④喹啉基、⑤环己烷基、⑥喹喔啉基或⑦呋喃基’的定义中，作为取代基，可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等碳原子数1～6的低级烷基；甲氧基、乙氧基等上述低级烷基对应的低级烷氧基；硝基；氯、溴、氟等卤素；羧基；甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丙氧基羰基、正丁氧基羰基等，与上述低级烷氧基对应的低级烷氧基羰基；氨基；单低级烷基氨基；二低级烷基氨基；氨基甲酰基；乙酰基氨基、丙酰基氨基、丁酰基氨基、异丁酰基氨基、戊酰基氨基、新戊酰氨基等由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰基氨基；环己基氧基羰基等环烷基氧基羰基；甲基氨基羰基、乙基氨基羰基等低级烷基氨基羰基；甲基羰基氧基、乙基羰基氧基、正丙基羰基氧基等上述定义的低级烷基对应的低级烷基羰基氧基；以三氟甲基等为代表的卤代低级烷基；羟基；甲酰基；乙氧基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙基等低级烷氧基低级烷基等。在上述取代基的说明中，所谓“低级烷基”、“低级烷氧基”包含由上述定义派生的全部基团。可以被相同或不同的1～3个取代基取代。
进而，苯基为包含在如下情况下被取代的苯基。即，表示 所示的基团时(式中，G表示 所示的基团、式 所示的基团、式-O-所示的基团、式 所示的基团、式-CH2-O-所示的基团、式-CH2-SO2-所示的基团、式 所示的基团或式 所示的基团。E表示碳原子或氮原子。
其中，作为苯基上优选的取代基，可以列举低级烷基、低级烷氧基、硝基、卤代低级烷基、低级烷氧基羰基、甲酰基、羟基、低级烷氧基低级烷基、卤素、苯甲酰基、苄基磺酰基等，取代基相同或不同可以为2个以上。
作为吡啶基上优选的基团，可以列举低级烷基、氨基、卤原子等。
作为吡嗪基(ピラジル基)上优选的基团，可以列举低级烷氧基羰基、羧基、酰基氨基、氨基甲酰基、环烷基氧基羰基等。
此外，作为J的吡啶基，优选2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，吡嗪基(ピラジル基)优选2-吡嗪基，喹啉基优选2-喹啉基或3-喹啉基，喹喔啉基优选2-喹喔啉基或3-喹喔啉基，呋喃基优选2-呋喃基。
在J的定义中，对于(b)组中所述的①～⑨，其代表例如下所示。
2，3-二氢化茚基 茚满酮基 茚基 二氢化茚酮基 茚满二酮基 四氢萘酮基 苯并环庚酮基 茚满醇基 亚茚满酮基在上述一系列的式中，t表示0或1～4的整数，S表示相同或不同的在上述J(a)的定义中的取代基中的一种或者氢原子，可以优选列举氢原子(未取代)、低级烷基或低级烷氧基。进而，在苯环相邻碳原子间可以被亚甲基二氧基、亚乙基二氧基等亚烷基二氧基取代。
其中最优选的情况为，未取代或取代1～3个甲氧基。
此外，上述的亚茚满酮基为在J(b)的定义中的苯基可以被取代的二价基团的示例。即由J(b)中②的茚满酮基衍生的代表性二价基团。
在J的定义中，所谓由环状胺化合物衍生的一价基团，可以列举例如喹唑啉酮、四氢异喹啉酮、四氢苯并二氮杂酮(テトラハイドロベンゾジアゼピン-オン)、六氢苯并苯偶氮萘乙二胺(ヘキサハイドロベンツアゾシン-オン)，结构式中只要存在环状酰胺即可，并非仅限于此。
可以是由单环或稠合杂环衍生的环状酰胺，作为稠合杂环，优选与苯环的稠合杂环。此时，苯环可以被碳原子数1～6的低级烷基，优选甲基，碳原子数1～6的低级烷氧基，优选甲氧基或卤原子取代。
列举优选例如下所示。

在上述式中，式(i)，(1)中的Y表示氢原子或低级烷基，式(k)中的V表示氢原子或低级烷氧基，式(m)，(n)中的W1、W2表示氢原子、低级烷基、低级烷氧基，W3表示氢原子或低级烷基。
此外，在式(j)，(1)中，右侧的环为7元环，式(k)中右侧的环为8元环。
J在上述定义中最优选的为，由苯环可以被取代的茚满酮衍生的一价基团、由环状酰胺化合物衍生的一价基团。
在B的定义中，式 表示的基团，R2为氢原子时以式-(CH2)n-表示，进而在亚烷基链的任一碳原子上也可以键合一个或一个以上的甲基。此时，n优选1～3。
此外，在B的一系列基团中，在基团内具有酰氨基的情况也为优选基团的一例。
作为更优选的基团，可以列举式＝(CH·CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团、式＝CH·(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团、式＝(CH·CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团、式-NH-表示的基团、式-O-表示的基团或式-S-表示的基团。
环 可以为5～7元环。具体可以列举 等，特别优选的环为式 (T＝C、Q＝N)表示的哌啶。
在K的定义中的‘取代或未取代的苯基’、‘取代或未取代的芳基烷基’中，取代基与上述J的定义中的(a)的①～⑦中被定义的取代基相同。
所谓芳基烷基表示苯环被上述取代基取代，或未取代的苄基、苯乙基等。
所谓吡啶基甲基具体可以列举2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基等。
对于K，最优选苯基可以被取代的芳基烷基、取代或未取代的苯基、苯基可以被取代的肉桂基。
优选的芳基烷基具体可以为例如苄基、苯乙基等，这些苯基也可以被碳原子数1～6的低级烷氧基、碳原子数1～6的低级烷基、羟基等取代。
表示单键或双键。
作为双键时的示例，可以列举由上述苯环可以被取代的茚满酮衍生的二价基团，即为亚茚满酮基。
在本发明中，作为可药用盐，可以列举例如盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲基磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等有机酸盐。
此外依据取代基的选择不同，有时也会形成例如钠盐、钾盐等碱金属盐；如钙盐、镁盐的碱土类金属盐；三甲基胺盐、三乙基胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐、N，N’-二苄基亚乙基二胺盐等有机胺盐；铵盐等。
此外，在本发明中上述化合物依据取代基的种类而具有手性碳，可能存在光学异构体，这些当然也应是属于本发明的范围。
作为具体的一例，当J具有茚满酮骨架时，由于具有手性碳可能存在几何异构体、光学异构体、非对映异构体等，均包含在本发明的范围中。
综合这些定义作为特别优选的化合物组如下所述。
[式中，J1表示选自苯基可以被取代的如下组的一价或二价基团；①二氢化茚基、②茚满酮基、③茚基、④二氢化茚酮基、⑤茚满二酮基、⑥四氢萘酮基、⑦苯并环庚酮基⑧茚满醇基⑨式 表示的基团。
B，T，Q，q，K具有与上述相同的意义。]表示的环状胺或可药用盐。
在上述J1的定义中，作为最优选的基团，可以列举苯基可以被取代的茚满酮基、茚满二酮基、亚茚满酮基。此外，此时，最优选苯基未被取代，或被相同或不同的羟基、卤素、低级烷氧基取代的情况。作为低级烷氧基，可以为碳原子数1～6的例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、正丙氧基、正丁氧基等，可以为1～4取代，但优选2取代的情况。最优选甲氧基2取代的情况。
作为包含在(A)式中的化合物中更优选的化合物，可以列举以下通式表示的化合物(B)。
[式中，J1表示选自苯基可以被取代的以下组的一价或二价基团；①二氢化茚基、②茚满酮基、③茚基、④二氢化茚酮基、⑤茚满二酮基、⑥四氢萘酮基、⑦苯并环庚酮基⑧茚满醇基⑨式 表示的基团。
B1表示式 (式中，n表示0或1～10的整数。R2表示氢原子或甲基即式 表示的亚烷基为不具有取代基，或具有1个或1个以上的甲基的形式。)表示的基团、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团，式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团。
T，Q，q，K具有与上述相同的意义。]作为包含在(B)式中的化合物中更优选的化合物组，可以列举以下通式表示的化合物(C)。
(式中，J1，B1，K具有与上述相同的含义。)即，式 表示的基团为式 表示的基团，即哌啶。作为包含在(C)式中的化合物中更优选的化合物组，可以列举以下通式表示的化合物(D)。
(式中，J2表示选自苯基可以被取代的茚满酮基、茚满二酮基、亚茚满酮基的基团。
K1表示取代或未取代的苯基、可以被取代的芳基烷基、可以被取代的肉桂基。
B1具有与上述相同的意义。)3.神经细胞保护在本发明中，所谓中枢神经系统的神经细胞，表示来源于脑的成熟神经细胞(优选取自神经回路并且机能成熟的来源于人或人以外的哺乳动物的中枢神经系统的神经细胞)，为来源于选自大脑皮质、中隔区域以及海马的任意一种的细胞。
在本发明中，所谓中枢神经系统的神经细胞保护是指对以下负荷的保护作用，由对中枢神经系统的神经细胞的脑缺血等缺血样作用产生的负荷、NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)、由红藻氨酸等兴奋性物质产生的兴奋性毒性引起的负荷、由肽或蛋白质的凝聚体毒性(包括Aβ毒性、朊病毒毒性)产生的负荷、由NO(一氧化氮)或活性氧引起的负荷，以及其他各种负荷。此外，在由脑缺血诱发的神经细胞损伤中，包含如下脑神经的变性疾病等的伤害，例如脑中风、脑梗塞、脑栓塞(最近也被认为是阿耳茨海默病的病因)等。该肽或蛋白质的凝聚体毒性，特别是Aβ毒性包括阿耳茨海默病或唐氏病伴随诱发的毒性。
该神经细胞保护用于包含下述作用的广泛含义中，除了可以切实地防止由对中枢神经系统的神经细胞的负荷(例如，由紧张状态、营养障碍、疾病、外伤、手术等引起的体力下降、衰弱、老化等不利于维持稳态的物理或化学障碍或细胞毒性作用)产生的神经细胞死亡的作用之外，还有防止神经细胞的机能降低的作用。
为了研究神经细胞是否被保护，有必要制备神经细胞。此时，细胞没有特殊限定，也可以是由生物体试样制备的原代培养细胞。作为来源于生物体试样的原代培养细胞的制备方法，例如来源于大脑皮质的原代培养神经细胞可以由大脑皮质得到，来源于中隔区域细胞的原代培养神经细胞可以由中隔部位，即包括中隔区域以及前脑基底核的部位得到。
作为细胞采集源的动物种类，可以为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔等的任意一种，没有特殊限定。细胞可以采集自胎儿到成体的任意生长过程，优选由胎儿(例如胎生18日龄)制备。将采集到的组织，通过胰蛋白酶处理或采用胶原酶等处理，可以得到神经细胞。
细胞培养可以采用通常的动物细胞的培养方法进行，操作者可以设定适当的培养条件。
4.神经细胞保护剂、保护方法上述化合物Q对神经细胞(尤其是中枢神经系统的神经细胞)障碍具有保护作用。此外，乙酰胆碱酯酶基因(AChE基因)的siRNA抑制AChE基因的表达而损害AChE的机能，抑制Aβ的产生。因此，作为上述脑中风、脑梗塞、脑栓塞等脑神经的变性疾病的中枢神经保护剂、神经细胞障碍的预防剂、治疗剂和/或预后改善剂(以下，称为‘本发明的保护剂等’)的有效成分，本发明中化合物Q或下述的AChE基因的siRNA是有效的，本发明提供阿耳茨海默病或唐氏病等的治疗剂、治疗方法、预后改善剂以及预后改善方法。
本发明的保护剂等的有效成分(例如，盐酸多奈哌齐)可以为无水物；也可以形成水合物。此外，例如在上述多奈哌齐中可能存在多晶型但并非仅限与此，任意结晶形可以为单一的，也可以为结晶形混合物。
在本发明中使用的化合物Q(例如盐酸多奈哌齐)，可以采用公知的方法制备。作为代表例，可以按照特开平1-79151号公报、特许2578475号公报、特许2733203号公报、或特许3078244号公报中公开的方法容易地制备。此外，盐酸多奈哌齐也可以作为细粒剂等制剂得到。
在本发明中使用的siRNA为按照下述方法设计，操作者可以使用采用核酸合成装置等的公知方法制备。
在本发明的保护剂等中，化合物Q或AChE基因的siRNA可以直接使用，也可以配合公知的可药用的担体等进行制剂。作为这种可药用的担体，可以列举例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调整剂、防腐剂、抗氧化剂等。作为进行制剂的剂型，可以列举在口服给药方式中使用的片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂等，或在非口服给药方式中使用的栓剂、注射剂、软膏剂、糊剂等。
此外，本发明的保护剂等给药方式没有特殊限定，可以口服或非口服给药。例如，作为口服给药方式，盐酸多奈哌齐的细粒剂可以得到商品名アリセプト细粒(エ一ザイ株式会社)、片剂可以得到商品名アリセプト片(エ一ザイ株式会社)。或者，作为非口服给药的形式，可以列举经皮吸收、静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射或腹腔注射等，优选静脉注射。此外，注射剂可以作为非水性的稀释剂(例如丙二醇、聚乙二醇等乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类等)、悬浊剂或乳浊剂进行配制。注射剂的无菌处理可以通过滤膜进行过滤减菌，或通过配合杀菌剂等进行。此外，注射剂可以以用时制备的形式进行制备。即，可以通过冷冻干燥法等得到无菌的固体组合物，在使用前溶解至无菌的注射用蒸馏水或其他的溶剂中而使用。通过经皮吸收作为贴剂给药时，优选不形成盐的，所谓游离体。
在口服给药中的化合物Q的给药量，举盐酸多奈哌齐为例，优选0.1～100mg/日，进而优选1.0～50mg/日，此外作为AChE基因的siRNA的优选给药量，为0.01～100mg/日，进而优选0.1～50mg/日。
在非口服给药中，对于贴剂，作为优选的给药量为5～50mg/日，进而优选10～20mg/日。此外，对于注射剂可以通过如下方法制备，在生理盐水或市售的注射用蒸馏水等可药用的担体中溶解或悬浊以使成为0.1μg/mL担体～10mg/mL担体的浓度。如此制备的注射剂的给药量，对于需要治疗的患者为0.01～5.0mg/日，进而优选0.1～1.0mg/日，可以每日分1～3次给药。
5.机能评价方法本发明的神经细胞保护剂，对保护缺血性伤害神经细胞的效果，可以通过OGD(Oxygen Glucose Deprivation除去氧、葡萄糖)试验评价。此外，本发明的神经细胞保护剂，对保护兴奋毒性神经细胞的效果，可以通过NMDA或红藻氨酸刺激试验评价。进而，本发明的神经细胞保护剂，对保护Aβ毒性神经细胞的效果，可以通过Aβ毒性试验或Aβ凝聚试验评价。以下对各试验方法进行说明。
(1)OGD试验在OGD试验中，使用所谓对大鼠原代培养大脑皮质神经细胞通过氧·葡萄糖剥夺给予负荷而诱发缺血样细胞损伤的模型。从而，使用该模型，进行盐酸多奈哌齐对上述缺血样伤害是否具有神经细胞保护作用的研究。
在本实施例中，原代培养神经细胞可以由大鼠胎儿(胎生17-19日龄)的大脑皮质得到。细胞在通常的动物细胞培养环境下，例如可以使用在37℃、5％CO2环境下，培养7日以上的细胞。OGD处理如下进行，将培养的大鼠原代培养大脑皮质神经细胞放置到没有加入葡萄糖的缓冲液中，然后转移到密封室中，在进行氮置换的低氧环境下进行。将没加入葡萄糖的缓冲液置换为细胞培养用溶液，OGD处理后的细胞在37℃下，5％CO2环境下培养一晚。
(A)化合物Q，例如在确认多奈哌齐是否具有保护缺血性伤害神经细胞的效果时，首先，可以在OGD处理前后添加该化合物的条件下进行本实施例。例如比较从OGD处理12小时前添加多奈哌齐的Pre-12h，从OGD处理1小时前添加多奈哌齐的Pve-1h，和OGD处理1小时后添加多奈派齐的Post-1h，和没有进行OGD处理的Cont以及在OGD处理前后没有添加多奈哌齐的Vehicle的神经细胞保护作用。作为神经保护作用的指标，可以使用LDH的释放抑制率。LDH乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)为存在于细胞质中的氧化还原酶，将丙酮酸转变为乳酸，与此伴随而使细胞内的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)(nicotinamide adenine dinucleotide)量减少。因此，如果细胞受到由OGD产生的伤害则LDH从细胞内流到细胞外的溶液中，在该溶液中依据细胞的伤害度(细胞死亡)存在LDH。此外，在溶液中存在的LDH量可以通过在该溶液中加入丙酮酸、NADH，使用吸光光度计测定NADH的减少率而知道。由本试验例表明从OGD处理12小时前添加多奈哌齐(Pre-12h)的情况最能起到神经保护效果。
(B)此外，通过对如上OGD处理的大鼠原代培养神经细胞通过显微镜观察形态，可以观察细胞受到的伤害程度，或化合物的神经细胞保护程度。与对照细胞相比较，Vehicle处置细胞不能得到正常的形态。另一方面，在OGD处理前进行多奈哌齐处置的情况，没有发现如Vehicle处置细胞那样的细胞损伤，显示与OGD处理前的神经细胞相近的形态。因此，从细胞形态的角度也表明通过在OGD处理前添加多奈哌齐，神经细胞受到了保护。
(C)进而，通过与上述的试验同样的操作，将大鼠原代培养神经细胞进行OGD处理，这时可以使用各种乙酰胆碱酯酶抑制剂(雪花胺(galantamine)、他克林、雷司替明(Revastigmine))以及多奈哌齐并变化各自的浓度添加至细胞中，对此时的LDH释放所产生的影响进行试验。在该试验中，多奈哌齐的乙酰胆碱酯酶50％抑制浓度与雷司替明基本相等，但雷司替明或其他乙酰胆碱酯酶抑制剂没有显示神经细胞保护作用。因此，提示了由多奈哌齐引起的对OGD处置神经的神经保护作用是基于与乙酰胆碱酯酶抑制作用不同的作用机制的。
(D)然后，为了研究上述多奈哌齐的神经细胞保护作用是否介入了乙酰胆碱受体，研究了将作为乙酰胆碱受体拮抗剂的莨菪胺(蕈毒碱受体拮抗剂)以及异莰胺(烟碱受体拮抗剂)添加至细胞中时多奈哌齐的保护作用如何受到影响。通过本试验表明多奈哌齐的神经细胞保护作用没有因为添加莨菪胺以及异莰胺而受到影响，因此，表明多奈哌齐的神经细胞保护作用并没有介入乙酰胆碱受体。
(2)兴奋性毒性试验(A)NMDA毒性在兴奋性毒性试验中，研究对在原代培养神经细胞中的NMDA(N-methyl-D-aspartate)毒性的化合物(例如多奈哌齐)的细胞保护作用。使用通过给予大鼠原代培养大脑皮质神经细胞NMDA刺激而诱发细胞损伤的模型。方法可以如下进行，在如上得到的大鼠原代培养神经细胞中添加NMDA(例如9小时添加100μM)，然后测定在培养液中存在的LDH量即可。在施加NMDA刺激前例如12小时前添加多奈哌齐至细胞中。然后，在添加NMDA后，例如在9小时后，测定在培养液中存在的LDH量，可以以此作为神经保护作用的指标。
通过本实验证明多奈哌齐对NMDA兴奋性毒性显示浓度依存性神经细胞保护效果。
(B)红藻氨酸毒性红藻氨酸被称为增强神经细胞死亡，该神经细胞死亡是由作为阿耳茨海默病的病因因子之一的β-淀粉状蛋白诱发的。在本试验中，研究在大鼠原代培养大脑皮质神经细胞中，化合物(例如多奈哌齐)对红藻氨酸诱发的细胞损伤的细胞保护作用。
红藻氨酸处置如下，例如在培养7日以上的细胞培养基中添加红藻氨酸，在37℃、5％CO2环境下培养一晚。化合物Q(例如多奈哌齐)在施加红藻氨酸刺激之前添加，例如从24小时前添加。然后添加红藻氨酸后测定在培养液中存在的LDH量，例如24小时后测定，可以将其作为神经保护作用的指标。在本试验中，由于多奈哌齐用量依存性地抑制神经细胞的LHD释放，证明多奈哌齐对红藻氨酸兴奋性毒性显示浓度依存性保护效果。
(3)Aβ毒性试验或Aβ凝聚试验(A)培养中隔区域神经细胞Aβ被认为是阿耳茨海默病的病因，此外，阿耳茨海默病中，涉及记忆或学习中枢的胆碱能神经脱落。
而且，胆碱能神经从中隔区域投射到海马等阿耳茨海默病中易于受到损伤的区域中。考虑到以上认知和由给予盐酸多奈哌齐抑制阿耳茨海默病引起的海马体积减少，优选解释为在胆碱能神经中，化合物(例如多奈哌齐)对Aβ毒性的保护效果以及Aβ凝聚抑制效果。
由于具有作为乙酰胆碱合成酶的胆碱乙酰转移酶(ChAT)，多数中隔区域神经细胞被认为是胆碱能神经。在本发明中，作为胆碱能神经的上述中隔区域神经细胞中，首次发现由多奈哌齐引起的对Aβ凝聚作用引起的胆碱能神经细胞毒性的细胞保护效果。
中隔区域神经细胞采集自生物体，可以通过培养而得到，其来源可以是小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔等，对种类没有限定。细胞可以采集自从胎儿到成体的任一成长过程，但优选由胎儿(例如胎生18日龄)制备。切取脑的中隔部位，即含有中隔区域以及前脑基底核的部位，可以通过进行胰蛋白酶处理得到细胞。
中隔区域神经细胞可以如下培养，将如上得到的细胞在培养板上以适当的浓度播种进行培养。培养板优选涂覆聚D-赖氨酸的板，浓度优选例如在96孔聚D-赖氨酸涂覆板上以每孔1.2×105细胞进行播种。培养基可以使用含有5％胎牛血清的DMEM，DMEM更优选含有5μg/mL胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、100μmol/L腐胺、20nmol/L黄体酮、15nmol/L生物素、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mmol/L丙酮酸钠等。
确认培养中隔区域神经细胞为胆碱能神经可如上使用ChAT的表达作为指标。有无ChAT表达可将培养的中隔区域神经细胞用抗ChAT抗体进行免疫染色而确认。
(B)Aβ凝聚检测在本发明中，可使用Aβ的β-片状结构形成而引起的在215～260nm的CD(圆二色性)色谱变化作为指标研究Aβ凝聚。如果Aβ形成α-螺旋结构或β-片状结构，则在215～260nm下的CD(圆二色性)色谱减少。特别是，已知形成β-片状结构则使215nm附近的CD光谱减少。
此外，为了简便地研究培养液中的Aβ凝聚，作为其他方式，可以使用硫代黄素T测定Aβ的荧光。在细胞中添加Aβ(1-42)48小时后，采取培养基并加入10μmol/L的硫代黄素T，立即在激发波长450nm、发射波长490nm下进行荧光测定(Wall J.，Schell M.，MurphyC.，Hrncic R.，Stevens F.J.，Solomon A.(1999)Thermodynamicinstability of human lambda 6 light chainscorrelation withfibrillogenicity.Biochemistry.38(42)，14101-14108.)。
(C)Aβ毒性检测已知如果Aβ形成β-片状结构则变得易于形成Aβ纤维固化，形成毒性。在本发明中Aβ毒性的检测可以在中隔区域神经细胞中添加Aβ后，使用测定细胞障碍的公知方法进行，以下记述优选的代表例，但并非仅限于此。例如，与上述(1)同样地使用培养基中的LDH量作为指标进行研究。或者，在本发明中，Aβ毒性在中隔区域神经细胞中添加Aβ后，通过MTT(二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)测定进行研究。MMT测定的方法可以如下进行，例如，在培养基中添加MTT(シグマ社制)以使终浓度为1mg/mL，在37℃下培育1小时后，去除培养基，将细胞用DMSO溶解，测定其吸光度(550nm)。或通过alamar blue细胞障碍测定方法进行研究。通过alamar blue的该方法为添加10分之1培养基量的alamar blue(和光纯药社制)，使其在5％CO2环境下反应。4小时后，在激发波长530nm，荧光波长590nm，增益35下进行测定。以只含培养基作为0％，对照作为100％进行换算。
在细胞中添加的Aβ，可以使用全长Aβ，也可以使用从N末端开始只具有40个残基的Aβ(1-40)，只要是具有β片状结构的构型，可以使用任一长度的Aβ。
此外，Aβ毒性引起的细胞死亡程度也可以通过由抗MAP2抗体的免疫染色进行研究。上述MAP2为神经细胞标记，因此由表达MAP2的细胞量，可以确认Aβ毒性引起的神经细胞的脱落程度。或者，通过使用锥虫蓝的细胞障碍测定方法进行研究。加入锥虫蓝(和光纯药公司制)，以没有被染色为深蓝色的细胞作为活细胞进行计数。
(D)对中隔区域神经细胞的Aβ毒性的神经保护剂以及Aβ凝聚抑制剂如果将乙酰胆碱酯酶(AChE)基因的siRNA添加到中隔区域神经细胞中，则细胞内的AChE活性降低。siRNA处置缓和Aβ毒性引起的中隔区域细胞障碍这一点，可以通过测定上述(C)的LDH表明。
此外，在添加该siRNA的中隔区域神经细胞中，siRNA处置抑制Aβ凝聚作用的情况，可以通过测定上述(B)的CD光谱表明。
由上可知，在中隔区域神经细胞的Aβ毒性以及Aβ凝聚中，涉及AChE。因此本发明含有Aβ凝聚抑制剂，该Aβ凝聚抑制剂为具有抑制乙酰胆碱酯酶机能作用的化合物，并含有同时具有实际上抑制乙酰胆碱酯酶与Aβ间的相互作用的化合物。
所谓‘相互作用’表示乙酰胆碱酯酶与Aβ结合。所谓‘实际上抑制乙酰胆碱酯酶与Aβ间的相互作用’表示在乙酰胆碱酯酶存在下抑制Aβ的凝聚被促进。并且，只要Aβ毒性被抑制，则可以称为‘实际上’相互作用被抑制。
乙酰胆碱的机能降低作用，可以是乙酰胆碱酯酶的活性抑制引起的，也可以是乙酰胆碱酯酶基因表达抑制引起的。
AChE的活性抑制，只要抑制乙酰胆碱与Aβ间的相互作用，只要抑制AChE的酶活性，则可以为任意化合物(例如下式的盐酸多奈哌齐)，此外，也可以是抗AChE抗体。

AChE基因的表达抑制，抑制只要是乙酰胆碱与Aβ间的相互作用，并且，抑制AChE基因的表达，可以为生成RNAi的任意核酸(siRNA或shRNA)。通过RNAi抑制AChE基因的表达，例如设计和合成AChE基因对应的siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpinRNA)，使其作用生成RNAi即可。siRNA为在细胞内通过Dicer处理产生的短链RNA。而shRNA为折叠为发夹结构的小RNA分子，具有有意义链和反义链以环连接的茎环结构。
siRNA的设计基准如下。
(a)选择编码AChE的基因的起始密码子的下游区域。只要是起始密码子下游的序列即没有特殊限定，任意的区域都可能成为候选。
(b)在选择区域方面，选择以aa开始的连续11～30碱基，优选21～25的序列。
具体地可将以下碱基序列作为靶序列，使用含有该靶序列，并且30碱基以下，例如11～30碱基长度(优选21～25碱基长度)的序列作为siRNA((i-1)和(i-2)，以及(ii-1)和(ii-2))。
(i-1)5′-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3′(序列编号1)(i-2)5′-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3′(序列编号2)(ii-1)5′-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3′(序列编号3)(ii-2)5′-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3′(序列编号4)本发明的AChE基因的siRNA，优选使用(i-1)与(i-2)组合，以及(ii-1)与(ii-2)组合而形成的双链RNA的形式。
此外，shRNA的设计基准如下。
(a)在RNAi中使用的AChE对应的shRNA序列，从基因上特异性的5’末端区域开始至300碱基的范围进行设计(Elbashir，S.M.et.al.Genes Dev.15，188-200(2001))。
(b)从各自基因转录产物的5’末端附近的区域开始，选择和设计以aa或a开始的mRNA序列作为靶序列。目标区域的长度没有被特殊限制，优选30bp以下，更优选21～25bp左右。
将siRNA以及shRNA导入培养的中隔区域神经细胞中时，可以采用将体外合成的siRNA以及shRNA连接至质粒DNA上而将其导入到细胞中的方法，将双链RNA复性的方法等。
此外，由显示Aβ凝聚抑制效果的siRNA或shRNA的结构解析而预见的化合物，并且具有Aβ凝聚抑制效果的化合物也被包含在本发明中。
(E)由胆碱酯酶抑制剂或胆碱酯酶基因的siRNA产生的Aβ凝聚抑制作用以及对Aβ毒性的保护作用的检测本发明提供具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可药用盐的筛选方法。即通过测定在中枢神经系统的神经细胞中，在Aβ存在下添加被检化合物(候选化合物)时在215～260nm，特别是215nm处的CD光谱的减少，可以进行抑制Aβ凝聚的化合物的筛选。判断被检化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用，可以通过比较由被检化合物引起的Aβ凝聚量，与在不存在候选化合物的条件下的Aβ凝聚量而进行。本发明还提供用于在上述方法中使用的具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可药用盐的筛选试剂盒。
在本发明的试剂盒中，包含通过上述(B)的CD光谱法测定Aβ凝聚抑制的必要试剂。在Aβ凝聚中所必要的Aβ、CD光谱测定时使用的试剂种类优选使用下述实施例6以及实施例7中使用的试剂。
此外，本发明提供如下筛选方法，该方法筛选由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或治疗上有效的化合物或其可药用盐。即，通过检测在培养的中隔区域神经细胞中添加被检化合物以及Aβ时的细胞损伤或细胞死亡，可以进行由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或治疗上有效的化合物的筛选。上述细胞障碍或细胞死亡，可以通过测定上述(C)中所述的LDH量，或通过MTT测定等检测。本发明还提供用于在上述方法中使用的由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或治疗上有效的化合物或其可药用盐的筛选试剂盒。
此外，在本发明的试剂盒中，包含在以上述(C)的细胞外以LDH量为指标测定由Aβ毒性诱发的神经细胞障碍时的必要试剂，或用于实施MTT测定等的必要试剂。用于以LDH测定由Aβ毒性诱发的细胞障碍程度的必要试剂可以优选在下述实施例1，2，3，5以及7中使用的试剂，可以列举例如NADH、丙酮酸。此外，用于通过MTT测定由Aβ毒性诱发的细胞障碍程度的必要试剂种类，可以列举例如MTT。
构成这些试剂盒的各成分可以分别准备，或在不发生问题的限度下共存。试剂盒可以包含溶液，或者可以是用于配制这种溶液的成分的浓缩形态。
进而根据需要，该试剂盒还可以包含辅助剂、专用容器、其他必要的附件、说明书等。
在本发明中，如多奈哌齐这样的乙酰胆碱酯酶抑制剂或乙酰胆碱酯酶基因的siRNA引起的Aβ凝聚抑制作用可以通过如下测定进行确认，在添加Aβ前(例如24小时)添加乙酰胆碱酯酶抑制剂，在添加Aβ后(例如48小时后)，测定上述的CD光谱。
此外，在同样处置的细胞中，通过测定培养基中的LDH量，可以确认如多奈哌齐这样的乙酰胆碱酯酶抑制剂或乙酰胆碱酯酶基因的siRNA引起的对Aβ毒性的保护作用。
以下，通过实施例具体说明本发明，本发明并非仅限于本实施例。
实施例1OGD试验在本实施例中，使用通过对大鼠原代培养大脑皮质神经细胞通过氧·葡萄糖剥离施予负荷而诱发缺血样细胞损伤的模型。对盐酸多奈哌齐对上述缺血样伤害是否具有神经细胞保护作用进行研究。
在本实施例中，原代培养神经细胞由大鼠胎儿(胎生17-19日龄)的大脑皮质得到。培养液使用在DMEM(Gibco BRL)中含有10％胎牛血清(Gibco BRL)、10％马血清(Gibco BRL)、5μg/mL胰岛素(Sigma)、30nM亚硒酸钠(Sigma)、100μM腐胺(Sigma)、20nM黄体酮(Sigma)、15nM生物素(Sigma)、100单位/mL青霉素(GibcoBRL)、100μg/mL链霉素(Gibco BRL)、8mM葡萄糖和1mM丙酮酸(Sigma)(参照文献Scholtz et al.，1988)，细胞在37℃、5％CO2环境下培养。培养7日以上后，实施OGD处理。OGD处理如下进行，将大鼠原代培养大脑皮质神经细胞放置到没有加入葡萄糖的缓冲液中，然后转移到密封室中，氮置换，在低氧环境下进行处理，上述缓冲液组成如下Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(5.36mM KCl，1.26mMCaCl2，0.44mM KH2PO4，0.49mM MgCl2，0.41mM MgSO4，137mMNaCl，4.17mM NaHCO3，0.34mM Na2HPO4，10mM HEPES(pH7.4))。将没加入葡萄糖的缓冲液置换为细胞培养用溶液，将OGD处理后的细胞在37℃下，5％CO2环境下培养一晚。首先，通过在OGD处理前后添加多奈哌齐研究是否有神经细胞保护效果，或是否变化。比较OGD处理12小时前添加多奈哌齐的Pre-12h，OGD处理1小时前添加多奈哌齐的Pre-1h以及OGD处理1小时后添加多奈哌齐的Post-1h，和没有进行OGD处理的Cont以及在OGD处理前后没有添加多奈哌齐的Vehicle的神经细胞保护作用。作为神经保护作用的指标，可以使用LDH的释放抑制率。LDH(乳酸脱氢酶)为存在于细胞质中的氧化还原酶，将丙酮酸转变为乳酸，使与此相伴存在的NADH(烟碱胺腺嘌呤二核苷酸)(nicotinamide adenine dinucleotide)量减少。因此，如果细胞受到由OGD产生的伤害则LDH从细胞内流到细胞外的溶液中，在该溶液中依据细胞的伤害度(细胞死亡)而存在LDH。此外，在溶液中存在的LDH量可以通过在该溶液中加入丙酮酸、和NADH，使用吸光光度计测定NADH的减少率而知道。结果如图1所示。由图1清楚地表明Pre-12h显示最大的LDH释放抑制作用，以下依次为Pre-1h、Post-1h。由该结果可知，在OGD处理12小时前添加多奈哌齐的情况下，有效地保护神经细胞。在以后的OGD试验中多奈哌齐的添加时间均固定在Pre-12h。
然后，通过与上述试验相同的操作将OGD处理大鼠原代培养细胞时的神经细胞通过显微镜进行观察。结果如图2所示。由图2清楚地表明与对照(A)相比较V’ehicle(B)中细胞不能维持正常的形态，显然因OGD受到了伤害。另一方面，在OGD处理前添加多奈哌齐的情况，未见如(B)中见到的那样的神经细胞损伤，明显为与OGD处理前的神经细胞的状态相近的状态(C)。因此，表明通过在OGD处理前添加多奈哌齐，神经细胞被保护。
然后，通过与上述的试验同样的操作，将大鼠原代培养神经细胞进行OGD处理，这时可以使用各种乙酰胆碱酯酶抑制剂(雪花胺、他克林、雷司替明)以及多奈哌齐并变化各自的浓度添加至细胞中，对此时的LDH释放所产生的影响进行试验。添加的浓度定为，多奈哌齐、他克林以及雷司替明0.1，1.0，10μM，雪花胺1.0，10，100μM。结果如图3所示。如图3A所示可知仅多奈哌齐用量依存性地抑制神经细胞的LHD释放，该抑制是在统计学上显著地抑制。此处，在各自的大鼠脑破碎悬浊液中的乙酰胆碱酯酶抑制剂的50％抑制浓度(IC50)如表1所示。
表1

Ogura et al.2000.Comparison of inhibitory activities of Donepeziland other cholinesterase inhibitors on acetylcholinesterase andbutyrylcholinesterase in vitro.Methods Find Exp Clin Pharmacol.22，609-613如表1所示可知多奈哌齐的乙酰胆碱酯酶50％抑制浓度与雷司替明基本相等。但雷司替明或其他乙酰胆碱酯酶抑制剂没有显示神经细胞保护作用。该结果提示神经保护作用是基于与乙酰胆碱酯酶抑制作用不同的作用机制的。
然后，通过以下试验研究了在将作为乙酰胆碱受体拮抗物的莨菪胺(蕈毒碱受体拮抗物)以及异莰胺(烟碱受体拮抗物)添加至细胞中时，多奈哌齐的神经细胞保护作用如何受到影响。
与上述试验同样地，OGD处理的12小时前在神经细胞培养液中添加多奈哌齐、莨菪胺、异莰胺、多奈哌齐和莨菪胺、或多奈哌齐和异莰胺，对由OGD处理引起的LDH释放的影响进行试验。添加的浓度设为，多奈哌齐、莨菪胺、异莰胺均为10μM。
结果如图4所示。如图4清楚表明多奈哌齐的神经细胞保护作用，在Cont(没有OGD处理)、Vehi(没有添加多奈哌齐)以及添加多奈哌齐的任意的试样中并没有因为是否添加作为乙酰胆碱受体拮抗物的莨菪胺(图4A)或异莰胺(图4B)而受到影响。这表明多奈哌齐显示保护神经细胞的作用与是否抑制乙酰胆碱受体无关。因此，通过本试验认为多奈哌齐通过抑制乙酰胆碱酯酶作用以外的作用机制发挥保护神经细胞作用。
实施例2兴奋性毒性试验在本实施例中，研究多奈哌齐对NMDA毒性的细胞保护作用。使用通过对大鼠原代培养大脑皮质神经细胞通过施予NMDA刺激而诱发细胞损伤的模型。对如实施例1操作而得到的大鼠原代培养神经细胞添加100μM NMDA，在9小时后测定培养液中存在的LDH量。
在本实施例中，原代培养神经细胞由大鼠胎儿(胎生17-19日龄)的大脑皮质得到。培养液使用在MEM(invitrogen公司制)中添加葡萄糖(1g/L)、青霉素/链霉素(100单位/mL)、10％FCS的培养液。每2，3天进行培养基交换。表达KA毒性时，培养基使用添加B-27和0.25mM谷氨酰胺的神经基础培养基(invitrogen公司制)。细胞在37℃下，5％CO2环境下培养。培养7天以上后，在培养基中添加100μMNMDA，在37℃下，5％CO2环境下培养一晚。施加NMDA刺激12小时前在细胞中添加多奈哌齐。然后，在添加NMDA 9小时后测定在培养液中存在的LDH量，作为神经细胞保护作用的指标。
本实施例的结果如图5所示。由图5可知，从0.1μM到10μM的范围内多奈哌齐用量依存性地抑制神经细胞的LDH释放。通过本实验可知多奈哌齐对NMDA兴奋性毒性显示浓度依存性神经细胞保护效果。
实施例3兴奋性毒性试验红藻氨酸被称为增强神经细胞死亡，该神经细胞死亡是由作为阿耳茨海默病的病因因子之一的β-淀粉状蛋白(Aβ)诱发的。在实施例中，使用通过对大鼠原代培养大脑皮质神经细胞施予红藻氨酸而诱发细胞损伤的模型。
在本实施例中，原代培养神经细胞由大鼠胎儿(胎生17-19日龄)的大脑皮质得到。细胞在37℃、5％CO2环境下培养。培养7日以上后，在培养基中加入NMDA或红藻氨酸，在37℃、5％CO2环境下培养一晚。施加红藻氨酸刺激24小时前在细胞中添加多奈哌齐。然后，在添加红藻氨酸24小时后测定在培养液中存在的LDH量，作为神经保护作用的指标。
本实施例的结果如图6所示。由图6可知，从0.1μM到1μM的范围内多奈哌齐用量依存性地抑制神经细胞的LDH释放。通过本实验可知多奈哌齐对红藻氨酸兴奋性毒性显示浓度依存性保护效果。
在以下的实施例4～7中使用的试剂以及统计分析方法如下。
Aβ(人，1-40)由ペプチド研(Osaka，Japan)购入。胰蛋白酶溶液、青霉素、链霉素、Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)、HEPES由Life Technologies Inc.(Grand Island，NY)购入。胰岛素、亚硒酸钠、腐胺、DNase I、异莰胺、莨菪胺由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)购入。胎牛血清和热灭活马血清由Nichirei Co.(Tokyo，Japan)购入。ChAT、微管相关蛋白-2(MAP2)由Chemicon InternationalInc.(Temecula，CA)购入。Alexa Fluor 546由Molecular Probes(Eugene，OR)购入。Vecstain Elite ABC试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒由Vector Laboratories，Inc.(Burlingame，CA)购入。脂质体转染试剂(Lipofectamine 2000)由Invitrogen Co.(Carlsbad，CA)购入。SiRNA委托日本バイオサ一ビス(Saitama，Japan)合成。
统计分析数据以平均值±标准偏差表示。比较检验使用Welch’st-test。P＜0.05为具有显著性差异。统计分析软件使用SAS 8.1(SASInstitute Japan Ltd.，Tokyo，Japan)。
实施例4中隔区域神经细胞的培养以及胆碱能神经的确认中隔区域神经细胞由Wister大鼠(日本チヤ一ルズリバ一)的胎儿(胎生18日龄)制备。由胎儿脑切取中隔部位(包括中隔区域和前脑基底核)，在含有0.25％胰蛋白酶和0.2mg/mL DNase I的Ca2+/Mg2+freeHank’s balanced salt solution中，在37℃下培育15分钟。在得到的细胞中，加入已加入10％胎牛血清、10％马血清的DMEM(含有5μg/mL胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、100μmol/L腐胺、20nmol/L黄体酮、15nmol/L生物素、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mmol/L丙酮酸钠)而使胰蛋白酶失活，洗涤细胞2次。在96-孔的涂覆聚-D-赖氨酸培养板上，以1.2×105细胞/孔的浓度播种细胞。播种的细胞在CO2培养箱(5％CO2，37℃)中培养。一天后，用含有5％胎牛血清的上述DMEM交换3分之2培养基。3天后，再用含有5％胎牛血清的上述DMEM交换3分之2培养基。6天后，用不含血清的上述DMEM(但不含谷氨酰胺)全量交换培养基。
将用以上方法培养的中隔区域神经细胞，用抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体进行免疫染色。首先，将培养的中隔区域神经细胞用中性福尔马林溶液固定60分钟。用5％山羊血清培育30分钟后，在1％山羊血清存在下用稀释500倍的ChAT抗体培育1天。然后，将细胞用稀释500倍的山羊抗-兔IgG以及HRP标记的亲合素-生物素复合物培育1小时后，使用DAB作为过氧化物酶的基质进行细胞染色。
用抗ChAT抗体免疫染色培养大鼠中隔区域神经细胞的结果如图7所示。图7的标尺表示0.1mm。通过免疫染色表明大多的培养大鼠中隔区域神经细胞具有作为乙酰胆碱合成酶的胆碱乙酰转移酶(ChAT)。这意味着培养大鼠中隔区域神经细胞为胆碱能神经。即，可以确认该细胞为胆碱能神经。
以往，报道了在阿耳茨海默病患者脑中的胆碱乙酰转移酶的减少与识别障碍的严重程度有关(Perry E.K.，Tomlinson B.E.，Blessed G.，Bergman K.，Gibson P.H.and Perry R.H.(1978)Correlation ofcholinergic abnormalities with senile senile plaques and mental testscores in senile dementia.Br.Med.J.2，1457-1459.)。因此，可以说中隔区域神经细胞损伤的抑制程度与抑制阿耳茨海默病患者的识别机能降低相关。
实施例5多奈哌齐对Aβ(1-40)毒性的保护效果以及细胞死亡试验作为细胞障碍指标，测定LDH(乳酸脱氢酶)。细胞使用按照如实施例4的培养方法培养7天的中隔区域神经细胞。在中隔区域神经细胞的培养基中添加15μmol/L的Aβ(1-40)，在CO2培养箱(5％CO2，37℃)中培养。在添加Aβ(1-40)24小时前加入多奈哌齐(0.01，0.1，1，10μmol/L)、异莰胺(10μmol/L)、莨菪胺(10μmol/L)。在添加Aβ(1-40)48小时后，测定培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。同时，将细胞用含有0.5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶解，并测定细胞中的LDH。计算在全部LDH(细胞内以及培养基中)中，在培养基中漏出的LDH量，以％表示(Koh J.Y.and Choi D.W.(1987)Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronalinjury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J.Neurosci.Meth.20，83-90.)。数据用ANOVA以及Welch’s t-test分析方法进行分析。
结果如图8所示。在图8中，白色直方表示没有加Aβ的细胞，灰色直方表示加Aβ的细胞。求出各值以平均值±S.E.M.(n＝23-25)表示并将其图形化。图8的[*]表示P＜0.05，[**]表示P＜0.01，以及[***]表示P＜0.001(以‘Control cells’作为对照)。
培养的中隔区域神经细胞易于受到由Aβ(1-40)引起的障碍(图8[control细胞])。与添加Aβ(1-40)48小时时的毒性相比，多奈哌齐从0.1μmol/L开始显示显著地保护效果(图8)。由多奈哌齐产生的Aβ(1-40)毒性的抑制效果没有被作为乙酰胆碱受体拮抗剂的异莰胺以及莨菪胺抑制(图8)。
然后，将如上用Aβ(1-40)处置的培养小鼠中隔区域神经细胞用抗MAP2抗体免疫染色。MAP2被用作神经细胞标记(Herzog W.andWeber K.(1978)Fractionation of brain microtubule-associated proteins.Isolation of two different proteins which stimulate tubulinpolymerization in vitro.Eur J Biochem.92(1).1-8)。MAP2染色按照上述实施例4的免疫染色方法进行，在中隔区域神经细胞中添加15μmol/L的Aβ(1-40)48小时后，固定细胞并进行免疫染色。添加Aβ(1-40)24小时前加入多奈哌齐。固定细胞后，用稀释至300倍的抗MAP2抗体培育一天，用Alexa Fluor546作为荧光基质检测。
结果如图9所示。标尺表示0.1mm。A表示没有加入Aβ(1-40)的对照细胞。B表示加入Aβ(1-40)的细胞。C、D、E分别表示加入Aβ(1-40)和多奈哌齐(0.1，1，10μmol/L)的细胞。左侧的照片为Hoffman modulation的明视野照片。右侧的照片为荧光照片。如果48小时加入Aβ(1-40)，则被MAP2染色的神经细胞减少(图9B)。确认了多奈哌齐抑制由Aβ(1-40)引起的MAP2染色细胞的障碍(图9)。
实施例6多奈哌齐对Aβ(1-40)凝聚的效果为了研究在培养液中的Aβ(1-40)结构状态而测定CD光谱。已知如果Aβ形成β-片状结构则变得易于形成Aβ纤维固化，显示毒性(Howlett D.R.，Jennings K.H.，Lee D.C.，Clark M.S.，Brown F.，Wetzel R.，Wood S.J.，Camilleri P.and Roberts G.W.(1995)Aggregation state and neurotoxic properties of Alzheimer beta-amyloidpeptide.Neurodegeneration.4，23-32.)。此外，已知如果Aβ(1-40)形成α-螺旋结构或β-片状结构，则从205到225nm下的CD(圆二色性)色谱减少(Sreerama N.，Venyaminov S.Y.and Woody R.W.(2000)Estimation of peptide secondary structure from circular dichroismspectrainclusion of denatured peptides with native peptides in theanalysis.Anal.Biochem.287，243-251；Bokvist M.，Lindstrom F.，WattsA.and Grobner G.(2004)Two types of Alzheimer’s beta-amyloid(1-40)peptide membrance interactionsaggregation preventingtransmembrance anchoring versus accelerated surface fibril formation.J.Mol.Biol.335，1039-49.)。特别是，已知形成β-片状结构使215nm附近的CD光谱减少。因此测定CD作为Aβ凝聚指标。
在培养的中隔区域神经细胞中添加15μmol/L Aβ(1-40)，在添加48小时后采取培养基，测定215～260nm的CD光谱。在CD光谱测定时使用JASCO(日本分光，J-720WI)。
结果如图10所示。A表示没有加入多奈哌齐的细胞。B表示添加多奈哌齐(10μM)的细胞。实线表示没加入Aβ的细胞，虚线表示加入Aβ的细胞。此外，A2以及B2分别表示由A以及B图的虚线值减去实线值。通过添加10μmol/L多奈哌齐，从215nm到225nm的CD光谱的减少被抑制。因此，通过本实施例，表明多奈哌齐抑制了Aβ形成α-螺旋结构或β-片状结构。
实施例7siRNA对细胞内乙酰胆碱活性的效果以及对Aβ(1-40)毒性的保护效果(1)siRNA处理作为乙酰胆碱酯酶的双链siRNA使用下述2组低聚核苷酸((i)以及(ii))。
(i)；5′-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3′(序列编号1)、5′-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3′(序列编号2)以及(ii)；5′-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3′(序列编号3)、5′-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3′(序列编号4)。
在中隔区域神经细胞培养第6日和第7日，在培养基中加入1μmol/L的上述(i)以及(ii)的siRNA和lipofectamine 2000(0.4μL/mL)。在培养第9日，溶解细胞，测定细胞内的乙酰胆碱酯酶活性(AChE活性)。
(2)乙酰胆碱酯酶活性的测定乙酰胆碱酯酶活性的测定按照Ellman等的方法进行(EllmanG.L.，Courtney K.D.，Anders V.J.，Feather-Stone R.M.(1961)A newand rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.Biochem.Pharmacol.7，88-95)。将细胞用含有0.5％Triton X-100的磷酸缓冲液(pH 8.0)溶解。离心分离得到的细胞溶液，上清液用磷酸缓冲液(pH 8.0)稀释3倍。在稀释的上清液中，添加5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(0.33mmol/L)和碘化乙酰硫代胆碱(AthCh)(0.5mmol/L)，搅拌后，测定在412nm下的吸光度的增加(MolecularDevices，SpectraMax 190EXT)。数据用ANOVA和Welch’s t-test分析。
结果如图11所示。各值以平均值±S.E.M.(n＝11)的形式图形化(n＝11)。在图11中，相对没有添加siRNA的细胞，[**]表示P＜0.01，[***]表示P＜0.001。
确认了研究2种siRNA、(i)以及(ii)的，结果都有AChE活性抑制效果(图11)。
(3)siRNA对Aβ(1-40)毒性的保护效果测定LDH(乳酸脱氢酶)作为细胞障碍的指标。在培养第7日在中隔区域神经细胞中添加15μmol/L的Aβ(1-40)，培育48小时。在添加Aβ(1-40)的24小时前和添加之前立即加入1μmol/L siRNA。白色直方表示没有加入Aβ(1-40)的细胞。灰色直方表示加入Aβ(1-40)的细胞。采用ANOVA和Welch’s t-test分析数据。
结果如图12所示。各值以平均值±S.E.M.的形式图形化(n＝7)。在图12中，相对没有添加siRNA的细胞，[***]表示P＜0.001。
研究了上述2种siRNA((i)以及(ii))的效果，结果都抑制Aβ毒性(图12)。
在LDH测定同时，用在215nm～260nm下的CD光谱变化分析Aβ的凝聚。
结果如图13所示。A表示加入RNAi的细胞。实线表示没加入Aβ的细胞，虚线表示加入Aβ的细胞。B表示由A的虚线值减去实线值的数值。通过添加siRNA从215nm到225nm的CD光谱减少被抑制(图13)。
产业实用性本发明中的神经细胞保护剂，对由缺血样细胞损伤和兴奋性毒性引起的伤害发挥神经细胞保护作用。因此，通过本发明的神经细胞保护剂可以防止、抑制由脑梗塞或脑血栓等诱发的缺血性神经细胞死亡以及由兴奋性毒性诱发的神经细胞死亡。
序列表フリ一テキスト序列编号1siRNA序列编号2siRNA序列编号3siRNA序列编号4siRNA
序列表<110>Eisai Co.，Ltd.
<120>神经细胞保护剂<130>G05-0066CN<150>JP 2003-167744<151>2003-06-12<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>1aaugucagug acucuguuut t21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>2aaacagaguc acugacauut t21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>3gcugccucaa gaaaguauct t21
<210>4<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>4gauacuuucu ugaggcagct t211权利要求
1.含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中枢神经系统的神经细胞保护剂，(i)以下述化学式表示的1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚满酮)-2-基]甲基哌啶或其可药用盐， (ii)以下的通式(I)表示的环状胺衍生物或其可药用盐， [式中，J表示选自以下式 茚满酮基 茚基 茚满二酮基 亚茚满酮基 (式中，S表示碳原子数1～6的低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基、卤原子或羟基；t表示0或1～4的整数；并且，进而(S)t也可以在结合的苯环的相邻碳原子间也可以形成亚甲二氧基或亚乙二氧基；式(1)中的Y表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基，式(k)中V表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷氧基，式(n)中W1及W2相互独立，相同或不同，表示氢原子、碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基，W3表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基；式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯环A可以被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基取代；)表示的基团中的一价或二价基团；B为式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整数，R2分别独立地表示氢原子或甲基)表示的基团、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团；K表示具有可以被卤代的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、硝基、卤原子、羧基、苄氧基、碳原子数1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子数1～6的单烷基氨基、碳原子数1～6的二烷基氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6酰氨基、环己基氧基羰基、碳原子数1～6的烷基氨基羰基、碳原子数1～6的烷基羰基氧基、羟基、甲酰基或烷氧基(碳原子数1～6)烷基(碳原子数1～6)作为取代基的苯基烷基； 表示单键或双键，(iii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐， (iv)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐， (v)以下通式(I-1)表示的环状胺衍生物或其可药用盐， [式中，J1-1表示碳原子数1～6的低级烷基(以下简称为低级烷基)；环己基；可以具有低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基(以下简称为低级烷氧基)、硝基、卤原子、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基；式 (式中，G表示式 表示的基团、式 表示的基团、式-O-表示的基团、式 表示的基团、式-CH2-O-表示的基团、式-CH2-SO2-表示的基团、式 表示的基团或式 表示的基团；E表示碳原子或氮原子；)表示的基团；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氢原子或低级烷氧基羰基)表示的基团；B表示式-(CH2)n-表示的基团、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氢原子、低级烷基、苯基或低级烷基磺酰基)表示的基团、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氢原子、低级烷基、可以具有低级烷基、低级烷氧基、卤素或羟基作为取代基的苯基、苄基或吡啶基)表示的基团、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基团、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基团、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基团、式-CO-(CH2)n-表示的基团、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基团或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基团(以上式中，n表示0或1～10的整数)；T1表示碳原子；K表示苯基可以具有低级烷基、低级烷氧基、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、也可具有甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基烷基(烷基的碳原子数1～2)；肉桂基；低级烷基；吡啶基甲基；环烷基(环烷基的碳原子数3～6)烷基；金刚烷甲基、糠基；碳原子数3～6的环烷基或酰基，q表示1或2，(vi)以下通式(I-2)表示的环状胺衍生物或其可药用盐， [式中，J1-2表示可具有碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基作为取代基的茚满酮基；T2表示氮原子；B、K以及q含义如上所述；](vii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐；
2.权利要求1所述的保护剂，其中盐为盐酸盐。
3.含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防剂和/或治疗剂，(i)下述化学式表示的1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚满酮基)-2-基]甲基哌啶或其可药用盐， (ii)以下通式(I)表示的环状胺衍生物或其可药用盐， [式中，J表示选自下式 茚满酮基 茚基 茚满二酮基 亚茚满酮基 (式中，S表示碳原子数1～6的低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基、卤原子或羟基；t表示0或1～4的整数；并且，(S)t也可以在结合的苯环的相邻碳原子间形成亚甲二氧基或亚乙二氧基；式(1)中的Y表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基，式(k)中V表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷氧基，式(n)中W1及W2相互独立，相同或不同，表示氢原子、碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基，W3表示氢原子或碳原子数1～6的低级烷基，式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯环A可以被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基取代；)表示的基团中的一价或二价基团；B为式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整数，R2分别独立地表示氢原子或甲基)表示的基团、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整数)表示的基团、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整数)表示的基团、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整数)表示的基团；K表示可以具有可以被卤代的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、硝基、卤原子、羧基、苄氧基、碳原子数1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子数1～6的单烷基氨基、碳原子数1～6的二烷基氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6酰氨基、环己基氧基羰基、碳原子数1～6的烷基氨基羰基、碳原子数1～6的烷基羰基氧基、羟基、甲酰基或烷氧基(碳原子数1～6)烷基(碳原子数1～6)作为取代基的苯基烷基； 表示单键或双键，(iii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐， (iv)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐， (v)以下通式(I-1)表示的环状胺衍生物或其可药用盐， [式中，J1-1表示碳原子数1～6的低级烷基(以下简称为低级烷基)；环己基；可以具有低级烷基、碳原子数1～6的低级烷氧基(以下简称为低级烷氧基)、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基；式 (式中，G表示式 表示的基团、式 表示的基团、式-O-表示的基团、式 表示的基团、式-CH2-O-表示的基团、式-CH2-SO2-表示的基团、式 表示的基团或式 表示的基团；E表示碳原子或氮原子；)表示的基团；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氢原子或低级烷氧基羰基)表示的基团；B表示式-(CH2)n-表示的基团、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氢原子、低级烷基、苯基或低级烷基磺酰基)表示的基团、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氢原子、低级烷基、也可以具有低级烷基、低级烷氧基、卤素或羟基作为取代基的苯基、苄基或吡啶基)表示的基团、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基团、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基团、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基团、式-CO-(CH2)n-表示的基团、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基团或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基团(以上式中，n表示0或1～10的整数)；T1表示碳原子；K表示苯基可以具有低级烷基、低级烷氧基、硝基、卤素、羧基、低级烷氧基羰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子数1～6的脂肪族饱和单羧酸衍生的酰氨基、环己基氧基羰基、低级烷基氨基羰基、低级烷基羰基氧基、卤代低级烷基、羟基、甲酰基或低级烷氧基低级烷基作为取代基的苯基烷基(烷基的碳原子数1～2)；肉桂基；低级烷基；吡啶基甲基；环烷基(环烷基的碳原子数3～6)烷基；金刚烷甲基、糠基；碳原子数3～6的环烷基或酰基，q表示1或2，(vi)以下通式(I-2)表示的环状胺衍生物或其可药用盐， [式中，J1-2表示可以具有碳原子数1～6的低级烷基或碳原子数1～6的低级烷氧基作为取代基的茚满酮基；T2表示氮原子；B、K以及q含义如上所述；](vii)选自下式表示的化合物组的环状胺衍生物或其可药用盐；
4.权利要求3所述的预防剂和/或治疗剂，其中，盐为盐酸盐。
5.权利要求3或4所述的预防剂和/或治疗剂，其中，神经细胞障碍是由脑缺血、兴奋性毒性或Aβ毒性诱发的。
6.权利要求3或4所述的预防剂和/或治疗剂，其中，神经细胞障碍是由伴随脑中风、脑梗塞或脑栓塞中任意一种的脑缺血、兴奋性毒性诱发的。
7.权利要求6所述的预防剂和/或治疗剂，其中，兴奋性毒性是由NMDA或红藻氨酸引起的。
8.权利要求3或4所述的预防剂和/或治疗剂，其中，神经细胞障碍是由伴随阿耳茨海默病或唐氏病的Aβ毒性诱发的。
9.权利要求1～8任意一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中，细胞来源于脑的成熟神经细胞。
10.权利要求9所述的预防剂和/或治疗剂，其中，神经细胞来源于选自大脑皮质、中隔区域以及海马的任意一种。
11.权利要求9或10所述的预防剂和/或治疗剂，其中，神经细胞是原代培养细胞。
12.脑中风、脑梗塞或脑栓塞中任一疾病的预后改善剂，其包含权利要求1或2所述的保护剂或权利要求3或4所述的预防剂和/或治疗剂。
13.一种中枢神经系统的神经细胞保护方法，其特征在于，给患者施用有效剂量的权利要求1或2所述的保护剂。
14.一种中枢神经系统的神经细胞障碍的预防方法和/或治疗方法，其特征在于，给患者施用有效剂量的权利要求3或4所述的预防剂和/或治疗剂。
15.权利要求14所述的方法，其中，神经细胞障碍是由脑缺血、兴奋性毒性或Aβ毒性诱发的。
16.权利要求15所述的方法，其中，兴奋性毒性是由NMDA或红藻氨酸引起的。
17.权利要求14所述的方法，其中，神经细胞障碍是由伴随脑中风、脑梗塞或脑栓塞中任意一种的脑缺血或兴奋性毒性诱发的。
18.权利要求14所述的方法，其中，神经细胞障碍是由伴随阿耳茨海默病或唐氏病的Aβ毒性诱发的。
19.脑中风、脑梗塞或脑栓塞中任一疾病的预后改善方法，其特征在于，给患者施用有效剂量的权利要求12所述的预后改善剂。
20.权利要求1或2中所示化合物的用途，其用于制备选自权利要求1或2所述的保护剂、权利要求3～8中任意一项所述的预防剂和/或治疗剂、以及权利要求12所述的预后改善剂中的任意一种药物。
21.具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可药用盐的筛选方法，其特征在于，在Aβ存在下使候选化合物作用于中枢神经系统的胆碱能神经细胞，并检测或测定Aβ凝聚量。
22.权利要求21所述的方法，其特征在于，使用Aβ凝聚量的检测或测定结果，通过与不存在候选化合物的情况下的Aβ凝聚量相比较，判定候选化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用。
23.具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可药用盐的筛选试剂盒，其用于权利要求21或22所述的方法中。
24.一种在由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或治疗中有效的化合物或其可药用盐的筛选方法，其特征在于，在Aβ存在下使候选化合物作用于中枢神经系统的胆碱能神经细胞，并检测细胞损伤或细胞死亡。
25.权利要求24所述的方法，其特征在于，使用细胞损伤或细胞死亡的检测结果，通过与不存在候选化合物的情况下的细胞损伤或细胞死亡程度相比较，判定候选化合物是否具有对Aβ毒性的细胞保护作用。
26.权利要求24或25所述的方法，其中，细胞损伤或细胞死亡的检测是通过测定乳酸脱氢酶的浓度或MTT测定实现的。
27.在由Aβ毒性诱发的中枢神经系统的神经细胞障碍的预防和/或治疗中有效的化合物或其可药用盐的筛选试剂盒，其用于权利要求24或25所述的方法中。
全文摘要
本发明涉及中枢神经的神经细胞保护剂，以及中枢神经系统的神经细胞障碍的预防剂和/或治疗剂，其含有以盐酸多奈哌齐为代表的化合物。
文档编号G01N33/50GK1802155SQ200480016009
公开日2006年7月12日 申请日期2004年6月14日 优先权日2003年6月12日
发明者赤祖父盛, 木村真奈美 申请人:卫材株式会社