一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种作为绵羊标记辅助选择应用的与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法及其应用。所述的分子标记由FSHR基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。在序列表SEQIDNO：1的第88bp处有1个T88-C88的碱基替换，导致BsiEⅠ-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增FSHR基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊产羔数性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
【专利说明】一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种作为绵羊标记辅助选择应 用的与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 根据FA0(2012)的统计数据，我国现有绵羊1. 87亿只，占世界饲养量（11. 69亿只） 的16%，居世界首位（http://www. fao. org/home/en/)，是最大的羊肉生产和消费国。绵羊 的群体遗传改良对保障羊肉供给，促进国民经济发展和提高人们生活水平具有重要意义。 绵羊的繁殖性状，尤其产羔数是现代养羊生产中最重要的经济性状之一。随着国家生态保 护战略的实施，放牧养羊的空间越来越小，要满足不断增加的羊肉市场需求，只能增加舍饲 养羊的数量。舍饲养羊的成本中，母羊饲养的成本占饲养成本的60%以上，提高每只母羊的 产羔数能显著增加养羊生产者的经济效益。我国部分地方绵羊品种具有一年四季发情、产 羔率高等优良种质特性，其中湖羊和小尾寒羊尤为突出。由于我国地域辽阔、生态经济条件 多样，养羊生产受自然条件的制约比较明显，羊肉生产的主体仍是适应性强、繁殖力低、产 肉性能低的地方品种及其杂种群体。同时，尽管湖羊和小尾寒羊等品种繁殖性能突出，已经 成为原产区乃至部分引种成功地区规模化舍饲养羊的当家母本，由于其肉用性能与国外引 进的专门化肉用品种相比仍有很大的差距，在繁育体系不健全、杂交无序的杂种优势利用 方式下，相当一部分群体容易在引入地被国外引进的专门化肉用品种改良，其中二代以上 的杂种群体繁殖性能明显下降。显然，我国绵羊群体的繁殖性能总体仍然比较低，在舍饲养 羊比重不断增大的大背景下，繁殖性能和产肉性能的遗传改良是当前乃至今后一段时间内 我国绵羊群体遗传改良的重点，而繁殖性能遗传改良的重点应放在产羔数性状上。
[0003] 繁殖性状属阈性状，是一种低遗传力（平均0. 1)的性状，并且在不同环境和不 同饲养条件下产羔数也受到一定影响，因此常规育种方法遗传改良进展缓慢，亟需人们 加深对繁殖性状遗传机制的了解，以促进绵羊繁殖性状的遗传改良。繁殖性状受微效多 基因控制，而且为加性-显性基因作用模式。随着现代分子生物技术的发展，分子标记 已在绵羊生产中广泛应用，并取得了一定成绩。对于绵羊繁殖性状候选基因的研究，最 早且作用机制相对最清楚的是FecB基因，它是于1980年由Davis在Booroola绵羊的 常染色体上发现的，具有提高排卵率和产盖数等生物学作用（Davis GH等，Segregation of a major gene influencing fecundity in progeny of Booroola sheep. NZJ Agric Res, 1982，25:525-529 ;C. J. H. Souza 等，Secretion of Inhibin A and Follicular Dynamics throughout the Estrous Cycle in the Sheep with and without the Booroola Gene (FecB). Endocrinology，1997，138 (12) : 5333-5340)。之后，Mulsant 等和 Wilson 等几乎同时报道 了将FecB基因定位于绵羊6号染色体6q23-31，并发现该基因是由于BMPR-IB基因高度保 守的胞内激酶信号区域一个突变（Q249R)的结果（Wilson T等，Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular (ALK-6) that is expressed in both oocyte sand granulosa cells. Biol Reprod，2001，1225-1235 ;Mulsant P 等，Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proc Natl Acad Sci USA, 2001，98: 5104-5109)。Souza 等将 Booroola羊与普通绵羊的cDNA进行比对时发现830bp处有一个A>C突变，使BMPR-IB 的胞内信号区第249位氨基酸由Glu变成Arg (Q249R)，从而导致Booroola母羊出现超 多产盖数基因型（Souza C J 等，The Booroola (FecB) Phenotype is assoeiated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type IB (BMPR-IB) gene. J Endoerinol, 2001，169(2) :1-6)。随后FecXI、FecXH、FecX2W、⑶F9等影响绵羊繁殖性状的候选基因相 继被鉴定出来，其中 FecXI、FecXH 被定位于 Χρ11·2_ρ11.4 (Davis GH. Discovery of the inverdale gene (fecXI). Proceeding of the New Zealand Society of Animal Production, 1995(55) :289-290)。储明星等采用PCR-SSCP的方法对BMP4基因进行多态性分析，发 现其也是影响小尾寒羊产盖数的基因 （Chun Μ X等，Polymorphism of BMP4 Gene and Its Relationship with Prolificacy of Small Tail Han Sheep. Journal of Agricultural Biotechnology. 2008, 16(2) :237-241)。董文艳等采用同样的方法发现ESR基因对湖羊产 羔数也有显著的影响(董文艳.湖羊ESR基因的检测及基因型与多态性能的关系.杭州：浙 江大学.2009)。
[0004] FSHR (促卵泡素受体）属G蛋白偶联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员，由胞外 区、跨膜区和C-末端区构成。它包括至少10个亮氨酸丰富的重复单位（LPR)，每个约有24 个氨基酸残基。与FSH产生特异性结合的位点位于LPR5-LPR10之间；7个α螺旋构成的 跨膜结构是G蛋白偶联受体家族的特征性基序。FSHR基因的cDNA于1990年首次被克隆 (Sprengel R等，The testicular receptor for follicle-stimulating hormone: structure and functional expression of cloned cDNA. Mol Endocrinol, 1990, 4(4) :525-530), FSHR 突变对生殖表型具有深刻的影响（Aittomaki K等，Mutation in the folliclestimulating hormone receptor gene causes hereditary hypergonadotropic ovarian failure. Cell，1995,82(6) :959-968)。FSHR在动物繁殖活动中具有传递促卵泡生长发育生物学 信息的作用，其基因突变可能增强或削弱转导FSH信息的功能，对生殖表型具有深刻的影 响。人的FSHR基因位于2号染色体短臂2区1带，包括10个外显子和9个内含子（Gmmoll J 等，Localization of the human FSH receptor to chromosome 2 p21 using a genomic probe comprising exon 10,Mol. EndocrinoL，1994 (12):265-271 ;Rousseau_Merck 等，The chromosomal localization of the human follicle-stimulating hormone receptor gene on 2p21-pl6 is similar to that of the luteinizing hormone receptor gene, Genomics, 1993(15) : 222-224)。Satoko Sudo 等（2002)用 PCR-SSCP 分析 FSHR 基因 多态性，检测其基因型频率，研究表明激素水平及一些妇科病与FSHR基因多态性相关。国 内在二花脸猪上检测到了 FSHR基因座位的多态性，研究结果表明，在FSHR基因座位发现的 这个PCR-SSCP标记与二花脸猪的产活仔数显著相关，基因型的不同可导致猪的产活仔数 有显著差异（陈杰等，二花脸猪足嗍位PCR-SSCP标记与产活仔数的关系.南京农业大学学 报，2002,25(3):53-56)。1^1 &1等报道，牛？5册基因的第10外显子存在多态性（1^1&1? 等，Polymorphisms in the bovine follicle -stimulating hormone receptor gene. Anita Genet, 2000, 31 (4) :280-281)。雷雪芹等以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为 实验材料，以牛的FSHR基因的第10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因，用SNP法进 行了多态检测，得出FSHR基因的第10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因的这一结 论(雷学芹等，牛FSHR基因第10外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系.中国生物 化学与分子生物学报.2004,10(1) :34-37)。
[0005] 通过以上资料我们可以得出FSHR基因参与动物繁殖调控过程并发挥着重要的作 用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基 因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊FHSR基因部分 5' -UTR (Untranslated Regions，非翻译区）序列的克隆和SNP筛查、检测及与产羔数性状 关联分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克隆一种作为绵羊标记辅助选择的与绵羊产羔数性状相关的 分子标记，并建立适用于绵羊产羔数性状的分子标记的方法。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现： 申请人:从绵羊FSHR基因片段中克隆得到一种作为绵羊标记辅助选择的与产羔数性状 相关的分子标记，它位于绵羊FSHR基因5' -UTR，其序列如序列表SEQ ID N0 :1所示。该序 列的第88bp处有一个T88- C88的碱基替换，并导致BsiE I -RFLP酶切多态性。
[0008] 本发明还提供用于检测上述分子标记的引物或探针。所述引物至少能特异性地扩 增SEQ ID N0 :1所示的序列或其特异性片段，该片段至少包括所述序列的第88位碱基。本 领域技术人员只要从样品中特异性地扩增出该片段，通过现有的检测手段即可判断所述序 列的第88bp处是否发生了 T88- C88的碱基替换，从而能够对绵羊进行分子辅助选择。对于 所述的特异性引物，本领域技术人员可以遵照《分子克隆实验指南》第三版的相关内容进行 设计和筛选，或者是按照本领域的公知常识进行设计和筛选。
[0009] 优选地，用于检测所示序列SEQ ID NO : 1的第88bp处有一个T88-C88的碱基替换 的引物对的DNA序列如下所示： 正向引物：5' - CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3'， 反向引物：5 ' - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 '。
[0010] 本发明还提供含有上述引物或探针的检测试剂盒。
[0011] 应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO : 1的第88位碱基突变进行了检 测，同时 申请人:将上述克隆的分子标记成功地应用于与绵羊产羔数性状相关分子标记辅助 选择的关联分析上，表明本发明的分子标记及相关检测手段能够有效地对绵羊进行分子辅 助选择，为绵羊育种提供了良好的技术手段，降低了成本，提高了效率，具有广阔的应用前 旦 -5^ 〇
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1 :绵羊H1SR基因部分5' -UTR片段和PCR-RFLP检测的DNA片段凝胶电泳图。
[0013] 图2 :是本发明中绵羊FSHR基因 BsiE I -RFLP的三种基因型（CC，TC，TT)电泳 结果。图中M :DNA分子量标准（DL2000 ladder)，其中2、3、6、8、9、11、15泳道为TT型，1、4、 5、7、10、13、14泳道为TC型，12和16泳道为CC型。
[0014]
【具体实施方式】： 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0015] 实施例1、FSHR基因部分5' -UTR序列的克隆 (1)引物设计 根据绵羊FSHR基因序列（GenBank收录号：NC_019460. 1)，利用Primer5. 0软件设计上 下游引物M_F和M-R，序列如下 FHSR ： M-F ：5 ; - CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3 ;, M-R :5 7 - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 7。
[0016] (2) PCR产物的克隆和测序 将纯化后的PCR产物与pMD-18 T载体(购自Takara)在4°C水浴连接过夜；无菌状态 下取10(Γ120 μ 1感受态细胞于1. 5 ml Ependorff管中，将5 μ 1的连接产物加入混勻，在 冰上放置30 min，42°C热激90 s，后冰浴3?4 min，加入400 μ 1无抗生素的LB液体培养基， 37°C振荡培养45 min。取100 μ 1涂布于异丙基硫代一 β -D -半乳糖苷（IPTG)X-gal的琼 脂平板上，37°C平放1 h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于疒3ml LB中，37°C 300r/ min培养过夜。用1. 5ml EP管12, 000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证 后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海桑尼 生物技术有限公司完成，得到一条长度为244bp的UTR序列（见SEQ ID N0 :1所示)，该序列 的第88bp处有一个T88- C88的碱基替换。
[0017] DNA序列同源性检索鉴定： 通过美国国家生物技术信息中心（NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi. nlm.nih.gov)网站的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基 因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与 绵羊FSHR基因 DNA(GenBank收录号：NC_019460. 1)的部分序列同源性达96%。
[0018] 实施例2、PCR-RFLP诊断方法的建立 (1)、引物序列 FSHR: M-F ：5 ; - CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3 ;, M-R :5 7 - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 7。
[0019] (2)PCR扩增条件 PCR反应总体积20μ 1，其中绵羊基因组DNA约100ng，含IX的buffer (购自Promega 公司），1. 5 mmol/L MgCl2, dNTP 终浓度为 150 μ mol/L，引物终浓度为 0· 4 μ mol/L，2U Taq DNA 聚合酶（Promega)。PCR 扩增程序是：94°C 3 min，循环 35 次 94°C 30 s，58°C 30 s，然后 72°C 25s，最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示。 扩增获得244bp特异片段，该片段位于5'-UTR。测序的结果发现在该244bp片段中存在一 个BsiE I酶切位点（CGRY丨CG)，其中第90bp处为多态性切点，位于5'-UTR中。
[0020] (3 ) PCR-RFLP 检测条件 PCR产物酶切反应体积是10μ 1，其中lXbuffer 1μ 1，PCR产物：Γ5 μ 1，限制性内切 酶BsiE I 0. 3μ1 (10U)^H20补足10μ1，将样品混匀后离心，37°C水浴4h，用2%琼脂糖 凝胶电泳检测酶切结果，在紫外灯下拍照，并记录基因型。对该位点两个纯合子的测序结果 显示，当第88bp位置是T时，则该BsiE I酶切位点不存在，BsiE I酶切后检测结果只有1 个片段，长度是244bp (定为等位基因 T);但存在T88 - C88的替换时，其结果导致第90bp 处一个BsiE I酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为90bp和154bp (定为等位基因 C)，三种基因型TT，TC，CC如图2所示。
[0021] (4)本发明的分子标记在绵羊产羔数相关性状关联分析中的应用 试验共检测了 18只杜泊羊，761只湖羊，869只小尾寒羊，106只杜湖匕代（?杜泊羊X 湖羊早），144只美湖南非肉用美利奴X湖羊早）的多态性，确定其基因型，并进行 基因型与产羔数的关联分析。
[0022] 建立如下所述的最小二乘模型： Υ?Λ1=μ + Breedi+Pk+SfCombinatiorv1· ε ijklm。
[0023] 其中,Yijkl是性状观察值，μ为总体均数,Genotypei为基因型效应,Breedj为品种 效应，P k为胎次效应，Si为季节效应，C〇mbinati〇ni为组合的效应，ε ijkl为随机误差，假定 ￡$1相互独立，服从N(0, 〇2)分布。基因型检测结果表明在1898个个体中CC基因型， 有55个，TC基因型有1177个个体，TT基因型有666个个体。基因型与性状关联分析的结 果是基因与产羔数呈显著相关。
[0024] 由表1可知，基因 SNP位点对产羔数有极显著影响（P〈0. 01)，其中CC基因型 个体的产羔数极显著，显著高于TC和TT基因型个体的对应值，TC基因型个体的对应值居 中，TT基因型个体的对应值最低。
【权利要求】
1. 一种克隆的与绵羊产盖数性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，所述序列的第88bp处有1个T88- C88的碱基替换。
2. 用于检测权利要求1所述分子标记的PCR引物或探针。
3. 检测权利要求1所述分子标记的碱基突变引物对，所述引物对的正向引物为5' -CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3'，反向引物为 5' - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 '。
4. 含有权利要求2的引物或探针或权利要求3所述的碱基突变引物对的检测试剂盒。
5. 权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的引物或探针、权利要求3所述的碱基 突变引物对或权利要求4所述检测试剂盒在绵羊标记辅助选择中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104046626SQ201410246539
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】李发弟, 王维民, 翁秀秀, 刘世佳, 潘香羽, 马友记, 唐德富, 李冲 申请人:兰州大学