绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种作为绵羊标记辅助选择应用的与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法及其应用。所述的分子标记由LHβ基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。在序列表SEQ?ID?NO：1的第713bp处有1个C713-T713的碱基替换，导致BsrB?Ⅰ-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增LHβ基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊产羔数性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
【专利说明】绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及绵羊分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种与绵羊产羔数性状相关的 分子标记及其应用，所述的分子标记从绵羊LHi3基因中克隆得到，它包括绵羊LHi3基因全 基因组序列突变位点的检测方法与应用。
【背景技术】
[0002] 绵羊繁殖性状是重要的经济性状，而产羔数又是主要的繁殖性状之一。研究表明， 绵羊繁殖性状属于低遗传力的阈性状，动物的产仔（羔）数是影响生产效益的一个重要因 素，它受到基因控制，而且为加性-显性基因作用模式（储明星等.主基因及其在动物育种 中的应用[J].农业生物技术学报，1995, 3(4) :23-31.)。本发明所选目标性状为产羔数， 具有较容易度量的特点，为大样本含量的试验群体产羔记录的采集提供了可行性。
[0003] 随着分子生物学技术的发展，越来越多的与绵羊产羔数性状相关的候选基因和分 子标记被发现，为标记辅助选择（marker-assisted selection, MAS)在育种中的应用积累 了丰富的基因素材。目前，标记辅助选择已作为常规选择法的辅助手段而被广泛应用，大大 提高了产羔数性状的改良速度。标记辅助选择包括随机引物扩增多态性（RAPD)标记、微 卫星标记、PCR-RFLP标记、分子标记与QTL位点的连锁分析方法等（赵西彪，AREG，ESR和 FSHi3亚基基因与猪产仔数关系研究.扬州大学；2008.)。其中PCR-RFLP因具有检测不受 发育阶段、性别等外部条件的影响的优点，所标记的变异数目不受限制，实用可靠而得到广 泛的应用。
[0004] 促黄体素是腺垂体嗜碱性颗粒细胞分泌的糖蛋白质激素，通过血液循环到达 性腺等靶器官发挥作用。促黄体生成素（LH)、卵泡刺激素（FSH)、促甲状腺素（TSH)和 促性腺素（CG)4种糖蛋白激素均由α和β2个亚基共轭结合而组成，在同一种内甚至 是所有哺乳动物中，α亚基为它们共有，而β亚基具有物种和激素的特异性（PIERCE J G, PARSONS T F.Glycoprotein hormones: structure and function[J]. Annu. Rev. Biochem. 1981,50:465-495.)，因此，对糖蛋白激素的研究重点在于β亚基。Ι?β可以在 排卵前选择性诱导卵泡生长发育同时诱发排卵；促进黄体形成、分泌孕酮；刺激卵泡膜细 胞分泌雄激素，扩散到卵泡液中被颗粒细胞摄取而芳构化为雌激素（杨利国.动物繁殖学 [M].中国农业出版社.2005:3-7.)。LHi3发挥作用必须依赖其受体，LHi3或LHR基因发 生突变，可能会导致LHi3表达量降低、与受体结合的活性部位发生失活或部分失活，或导 致LHR降低或丧失受体功能，这些均会导致G蛋白偶联及信号传递发生障碍，进而对家畜 的繁殖性能产生影响（张雪琴等.LH/CG受体研究进展[J].草业与畜牧.2008, 4:1-9.)。 师庆伟等（师庆伟等.促黄体素（LH) β亚基基因的单核苷酸多态性及其与猪繁殖性状的 相关性[J].江苏农业科学.2006, 6:302-304.)在检测民猪LHi3基因多态性时，发现第二 外显子SNP位点（T1757C)与母猪的产仔数（P〈0. 01)、初生窝重（P〈0. 01)及初生活仔窝重 显著相关（P〈〇. 05)。刘源（刘源.绵羊高繁殖力候选基因 LHi3和GnRHR的研究[D].南 京：南京农业大学.2009.)在绵羊Ι?β基因上检测到6个多态位点（T286C、A424G、T439C、 G705A、C1042G、C1136T)，其中 T286C、C1042G、C1136T 与绵羊产羔数显著相关（Ρ〈(λ 05)， 并且T286C还与绵羊的初生重相关（Ρ〈0.05)。黄勤华等（黄勤华等.贵州黑山羊促黄 体素 β基因多态性及其与产羔数的关系[J].贵州农业科学.2010, 38 (6) :162-164.)报 道在山羊群体中也存在与产羔数相关的多态位点。Yang等（Yang W C，Tang K Q，Li S J, et al. Polymorphisms of the bovine luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor(LHCGR)gene and its association with superovulation traits[J]. Molecular Biology R 印 orts. 2012, 39 (3) :2481-2487.)在奶牛 LHR 基因上检测到 4 个 SNPs(G51656T、A51703G、A51726G、G51737A)，其中G51656T与经过超数排卵处理后的排卵 数显著相关（(P〈0.05)，A51703G与超数排卵处理后的排卵数显著相关（P〈0.01)，可移植胚 胎数显著相关（P〈〇.〇l)。
[0005] 通过以上资料我们可以得出LHi3基因参与动物繁殖调控过程并发挥着重要的作 用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基 因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此本发明开展了绵羊LHi3基因 全基因组序列的克隆和SNP筛查、检测及与产羔数性状关联分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种与绵羊产羔数性状相关的分子 标记。本发明的任务是从绵羊LHi3基因的全基因组序列克隆得到一种与绵羊产羔数性状 相关的分子标记，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为绵羊产羔数性状检测提供 一种分子标记和检测方法。
[0007] 实现本发明的技术方案如下：
[0008] 申请人:克隆得到一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记，它包含绵羊（品种包含 杜泊和湖羊）LHi3基因1018bp的序列，其核苷酸序列如下所示：
[0009] TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGGCCCCCTGTGACTCCATCCAGGCCACAGCTGGCAGGAAGTGGGAGAGT CCGGGGACCTGGTAAAGGAGGCCTCTTTCTAGAAGAGTGTGGGGAGGGCAGTAGGCCTGACGGTGGGAGGAGGGCAG CAGGTGGGGCCTGAGGTGTTGGGGTGTCTGGGGTCCCTGGGGTCCCTGGGGATGGGAAATCCTTGAATGGAAGGTGG CAGGCACAGGAGCTGGGTCCCTGAACGTGTGCATGCAGGGCTTGGGGGTGGGGTGAGGATCTGGCTGGCCCTGAGGC ACTGGCCTTGTCCCAGGCACTGCTGCTGTGGCTGCTGCTGGGCGTGGCCGGGGTGTGGGCTTCCAGGGGGCCACTGC GGCCGCTGTGCCAGCCCATCAACGCCACCCTGGCGGCTGAGAAGGAGGCCTGCCCTGTCTGTATCACTTTCACCACC AGCATCTGCGCCGGCTACTGCCCCAGCATGGTGAGCTGCGGAGGGCGGGCGGGTGCCACCAACCCAGCTCCAGGCAA TTACTCGGGGCTAGGCCCACAGAAGACCCGCAGTGGCAGTGGGGGTGGAAGGGTGGCCTGCCGCCTGGGGAAGGGGC CGGGCAGGTGGGAAGGAGAGCACAGAGGGTCCCTGGGATCTGTGGGGTGCAGTGGGGGAGCTCGGGGGAGAGCTCAG CCCCATGGAAACACTCAAGCTCCCCGCY(C/T)
[0010] CTCCAGAAGCGGGTGCTGCCTGTCATCCTGCCGCCCATGCCCCAGCGGGTGTGCACCTACCACGAGCT GCGCTTCGCCTCCGTTCGGCTCCCCGGCTGCCCACCTGGCGTGGACCCAATGGTCTCTTTCCCCGTGGCCCTCAGC TGTCACTGTGGGCCCTGCCGCCTCAGCAGCACTGACTGCGGGGGTCCCAGAACCCAACCCTTGGCCTGTGACCAC CCCCCGCTCCCAGACATCCTCTTCCTCTAAGGATGCCCCACTTCAACCTCCCATGCCCACCCTAACTCCCAAAGC CAGCAGACGCT
[0011] 上述序列中的713位的Y为T或C，该突变导致PCR-BsrB I -RFLP多态性。
[0012] 通过上述序列进行SeqMan比对提供了位于该扩增片段内部713bp处的C/T碱基 变异，该突变导致PCR-BsrB I -RFLP多态性（见图3)。
[0013] 申请人:设计了一种扩增上述基因片段和用于检测该基因片段αΗβ基因）的即分 子标记的引物对，其DNA序列如下所示：
[0014] 正向引物：TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGG，
[0015] 反向引物：CCAAAGCCAGCAGACGCT。
[0016] 申请人:设计了一种检测上述分子标记的碱基突变的引物对，其DNA序列如下所 述：
[0017] 正向引物：TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGG，
[0018] 反向引物：CCAAAGCCAGCAGACGCT。
[0019] 申请人:提供了一种绵羊与产羔数性状相关的分子标记的制备方法，其包括以下步 骤：
[0020] 从杜泊羊、湖羊、小尾寒羊全血中提取基因组DNA，在位于绵羊Ι?β基因突变位点 附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如序列表SEQ ID Ν0:2和SEQ ID Ν0:3所示，对绵 羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如图4所示的序列（除该序列的713bp处的碱 基是突变后的碱基外，该序列与序列表SEQ ID N0:1所示的基因片段基本是一致的，显示了 第713位存在一个等位基因突变，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQ ID N0:2和SEQ ID NO: 3所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行BsrB I酶切分型及检测。
[0021] 本发明的分子标记可用于绵羊产羔数性状标记辅助选择中。
[0022] 所述的引物对也可应用于绵羊产羔数性状标记辅助选择中。
[0023] 此外。本发明提供了鉴定上述序列713bp处C/T变异的BsrB I -RFLP (限制性内 切酶酶切片段长度多态性）基因型分型方法。
[0024] 本发明还提供了利用BsrB I -RFLP方法确定的不同基因型个体与产羔数性状间 的关联分析。
[0025] 更详细的发明方案见《【具体实施方式】》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 序列表SEQ ID NO: 1是本发明制备的绵羊产羔数性状相关的分子标记，即扩增得 到的绵羊（品种为杜泊羊和湖羊）LHi3基因的部分核苷酸序列（在该序列表的第713位的 碱基处存在一个等位基因突变，即T/C突变），序列长度为1018bp。
[0027] 序列表SEQ ID NO:2是本发明制备SEQ ID NO: 1特异基因片段所用的正向引物， 也是实施绵羊C/T变异BsrB I -RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性）基因型分型方 法的正向引物。
[0028] 序列表SEQ ID N0:3是制备SEQ ID NO: 1特异基因片段所用的反向引物，也是实 施绵羊C/T变异BsrB I -RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性）基因型分型方法的反 向引物。
[0029] 图1 :为本发明两个绵羊品种LH@基因序列测序结果和SNP位点。需要说明的是： 该突变位点所列的727bp是针对该基因的全序列而言，在本发明克隆的基因片段中该突变 位点位于713bp处。
[0030] 图2 :为本发明绵羊LHi3基因扩增所得目的片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖 凝胶浓度为2%，图中标记说明：泳道Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-8为序列表SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物在不同绵羊品种中的扩增片段，片段大小为1018bp ;
[0031] 图3 :为绵羊LHi3基因 BsrB I -RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为1. 5%，图中 标记说明：泳道Μ为DNA Marker DL2000, CC基因型片段大小分别为713bp、225bp，TT基因 型片段大小分别为938bp，而杂合基因型TC片段大小分别938bp、713bp和225bp。
[0032] 图4:为本发明扩增的湖羊（但不限于湖羊，包括其他中国血缘地方品种绵羊）的 核苷酸序列，在该序列的713bp处存在一个等位基因（C/T)突变（图4所示序列的713位 的Y为C或T)，该突变导致PCR-BsrB I -RFLP多态性。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1 :基因片段的获得及多态性检测方法的建立
[0034] 绵羊LH@基因序列的扩增
[0035] ⑴采集血样
[0036] 选择一个国外绵羊品种（杜泊、南非肉用美利奴羊血样采自民勤中天羊业有限公 司，为常规品种）和两个中国绵羊地方品种（湖羊、小尾寒羊，血样采自金昌中天羊业有限 公司，为常规品种）为试验材料，采取绵羊的全血；
[0037] (2)基因组DNA提取
[0038] 从绵羊的全血中提取基因组DNA，DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司 生产的基因组DNA试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit)，按该试剂盒提供的操作说明书进行 操作和提取。
[0039] ⑶引物设计
[0040] 根据绵羊Ι?β基因 （Gene Bank收录号：NC_019471)突变位点附近序列，设计一 对特异引物。其DNA序列如下所示：
[0041] 正向引物为 LH β -F (5, -TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGG-3'），
[0042] 反向引物为 LH β -R (5, -CCAAAGCCAGCAGACGCT-3'）；
[0043] (4)聚合酶链式反应（PCR)
[0044] 采用PCR法，以抽提的绵羊品种杜泊、湖羊血样基因组DNA为模板，进行PCR扩 增。PCR 反应体系：10XLoading Bufferl.5ul，dNTP(2. 5mM)2. 5ul，上述制备的正向引物 LH3-F(10uM)0.5ul，反向引物 LHP-R(10uM)0.5ul，DNA 模板（50ng/ul)lul，lXTaq DNA 聚合酶 0. 15ul，ddH208. 85ul。PCR 扩增程序：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，65. 7°C退火 30s，72°C延伸lmin30s(步骤2-4循环32次），72°C延伸10min，4°C保存。对长度为1018bp 的PCR产物进行序列测定，得到如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列（或参见图4所示的序 列）。将不同绵羊品种的PCR产物序列混合测序其峰图结果见图1。位于该片段的713bp 处的C/T变异引起了 BsrB I酶切位点（CCG丨CTC)多态性。
[0045] (5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性（RLFP)检测
[0046] 采用BsrB I -RFLP方法对绵羊LH β基因 SNP进行基因分型，酶切反应条件：PCR 产物5111，10\册811打6。111，88沖1(5"111)0.5111，(1(1!1 202.5111，371：酶切30111丨11。取10111 酶切产物在1. 5%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，之后进行基因型分析和鉴定。此扩增片段 大小为1018bp，BsrB I酶切多态性位点位于该片段的713bp处，当该处变异位点为T碱基 时，会产生限制性内切酶BsrB I的酶切位点（CCG丨CTC)，BsrB I消化PCR产物后会产生 2个片段（938bp和225bp)，其基因型为TC ;当该处变异位点为C碱基时，则不存在Bmr I 酶切位点，BsrB I消化PCR产物后会产生2个片段（713bp和225bp)，其基因型为CC ;当该 处变异位点为C/T杂合基因型时，BsrB I消化PCR产物后会产生3个片段（938bp，713bp 和225bp)，其基因型为TC。
[0047] 实施例2 :本发明制备的分子标记在绵羊产羔数相关性状关联分析中的应用
[0048] 试验共检测了 18只杜泊羊，270只湖羊，869只小尾寒羊，5只南非肉用美利奴羊，5 只杜寒F1代（?杜泊羊X小尾寒羊早），106只杜湖羊F1代（?杜泊羊X湖羊早），145 只美湖羊F1代（?南非肉用美利奴羊X湖羊早）的多态性，确定其基因型，并进行基因型 与产羔数的关联分析。
[0049] 建立如下所述的最小二乘模型：
[0050] Yijkl = μ +Genotypei+Breedj+Pk+S1+Combination m+ ε ijklm〇
[0051] 其中,Yijkl是性状观察值，μ为总体均数,Genotypei为基因型效应,Breedj为品种 效应，P k为胎次效应，Si为季节效应，C〇mbinati〇ni为组合的效应，ε ijkl为随机误差，假定 ￡$1相互独立，服从N(0,。2)分布。基因型检测结果表明在1418个个体中CC基因型，有 981个，TC基因型有331个个体，TT基因型有106个个体。基因型与性状关联分析的结果 由表1可知，CC基因型个体的产羔数极显著高于TC基因型个体的对应值，TT基因型个体的 对应值居中，TC基因型个体的对应值最低。结果见表1所示。
[0052] 表1绵羊LHi3基因BsrB I -RFLP酶切位点的多态性对产羔数性状的影响
[0053]
【权利要求】
1. 一种克隆的与绵羊产羔数性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如下所示： TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGGCCCCCTGTGACTCCATCCAGGCCACAGCTGGCAGGAAGTGGGAGAGTCCG GGGACCTGGTAAAGGAGGCCTCTTTCTAGAAGAGTGTGGGGAGGGCAGTAGGCCTGACGGTGGGAGGAGGGCAGCAG GTGGGGCCTGAGGTGTTGGGGTGTCTGGGGTCCCTGGGGTCCCTGGGGATGGGAAATCCTTGAATGGAAGGTGGCAG GCACAGGAGCTGGGTCCCTGAACGTGTGCATGCAGGGCTTGGGGGTGGGGTGAGGATCTGGCTGGCCCTGAGGCACT GGCCTTGTCCCAGGCACTGCTGCTGTGGCTGCTGCTGGGCGTGGCCGGGGTGTGGGCTTCCAGGGGGCCACTGCGGC CGCTGTGCCAGCCCATCAACGCCACCCTGGCGGCTGAGAAGGAGGCCTGCCCTGTCTGTATCACTTTCACCACCAGC ATCTGCGCCGGCTACTGCCCCAGCATGGTGAGCTGCGGAGGGCGGGCGGGTGCCACCAACCCAGCTCCAGGCAATTA CTCGGGGCTAGGCCCACAGAAGACCCGCAGTGGCAGTGGGGGTGGAAGGGTGGCCTGCCGCCTGGGGAAGGGGCCGG GCAGGTGGGAAGGAGAGCACAGAGGGTCCCTGGGATCTGTGGGGTGCAGTGGGGGAGCTCGGGGGAGAGCTCAGCCC CATGGAAACACTCAAGCTCCCCGCYCTCCAGAAGCGGGTGCTGCCTGTCATCCTGCCGCCCATGCCCCAGCGGGTGT GCACCTACCACGAGCTGCGCTTCGCCTCCGTTCGGCTCCCCGGCTGCCCACCTGGCGTGGACCCAATGGTCTCTTTC CCCGTGGCCCTCAGCTGTCACTGTGGGCCCTGCCGCCTCAGCAGCACTGACTGCGGGGGTCCCAGAACCCAACCCTT GGCCTGTGACCACCCCCCGCTCCCAGACATCCTCTTCCTCTAAGGATGCCCCACTTCAACCTCCCATGCCCACCCTA ACTCCCAAAGCCAGCAGACGCT 上述序列第713bp处的Y是C或T，该突变导致PCR-BsrB I -RFLP多态性。
2. -种检测权利要求1所述分子标记的PCR引物对，该引物对的DNA序列如下所示： 正向引物：TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGG， 反向引物：CCAAAGCCAGCAGACGCT。
3. -种检测权利要求1所述分子标记的碱基突变的引物对，其DNA序列如下所述： 正向引物：TGCTCCAGGTAAGTCTGTAGGG， 反向引物：CCAAAGCCAGCAGACGCT。
4. 一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法，其包括以下步骤： 从绵羊杜泊羊、湖羊和小尾寒羊全血中提取基因组DNA，在位于绵羊LHi3基因突变位 点附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如序列表SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示， 对绵羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如图4所示的序列，通过序列比对，筛查 SNP，再利用SEQ ID N0:2和SEQ ID勵:3所示的引物对进行？0?扩增，将？0?扩增获得的 片段进行BsrB I酶切分型及检测。
5. 权利要求1所述的分子标记在绵羊产羔数性状相关检测中的应用。
6. 权利要求2所述的PCR引物对在绵羊产羔数性状相关检测中的应用。
7. 权利要求3所述的碱基突变引物对在绵羊产羔数性状相关检测中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104099330SQ201410327930
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】李发弟, 王维民, 潘香羽, 刘世佳, 翁秀秀, 马友记, 唐德富, 李冲 申请人:兰州大学