粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重pcr检测方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种可同时检测粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法。检测步骤包括：将待检测粮食研磨成粉，用CTAB法提取总DNA；以所提DNA作为模板进行多重PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测粮食中是否被禾谷镰刀菌侵染以及是否含有脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)、雪腐镰刀烯醇(NIV)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。本发明用快速、简便的方法检测到粮食的禾谷镰刀菌，及DON、NIV、ZEN三种毒素。可以同时检测出粮食样品中侵染禾谷镰刀菌以及从分子生物学的水平确定是否有脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)、雪腐镰刀烯醇(NIV)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。
【专利说明】粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，属于生 物技领域。
【背景技术】
[0002] 禾谷镰刀菌广泛分布于世界范围的温暖潮湿地区，它可以引起麦类作物的根腐、 苗腐和穗腐，也能引起玉米的穗腐和茎基腐。禾谷镰刀菌侵染小麦，引起小麦的赤霉病，是 我国东北麦区和长江流域最主要的病害，近年来还有扩大蔓延的趋势。在粮食储藏过程中， 尤其是在夏季高温潮湿的环境中，禾谷镰刀菌生长速度快，毒素会随着菌体的生长不断的 累积。毒素累积量超过国家标准后粮食就不能被人畜食用，失去商品价值，需要另作处理。 因此会造成巨大的经济损失。种子带菌是合谷镰刀菌侵染禾谷类作物的一种重要方式，播 种染菌种子增加了禾谷类作物感染赤霉病的几率，这会对粮食产量产生直接影响。
[0003] 禾谷镰刀菌不同菌株（不同采集地、寄主、感染部位）产生毒素的种类和能力有很 大的差异。但主要有两大类：单端孢霉烯族毒素化合物（Trichothecenes)和玉米赤霉烯酮 (ZEN)。
[0004] 单端孢霉烯族毒素的基本结构为四环的倍半萜，其上的环氧集团是毒性的主要来 源。根据特异功能基团的不同有A、B、C、D四种类型。A型和B型为天然污染的单端孢霉烯 族毒素化合物。B型化合物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON)与雪腐镰刀菌烯醇（NIV)为其主 要两种毒素。单端孢霉烯族毒素化合物的急性中毒症状表现为呕吐、恶心、眩晕、便血、手足 发麻等。慢性中毒有基因毒性、细胞毒性和免疫毒性。
[0005] 玉米赤霉烯酮（ZEN)又称F-2毒素。是一种表现类雌性激素样作用的真菌毒素毒 素，具有强烈的致畸作用，具有生殖发育毒性、免疫毒性和基因毒性，尤其破坏生殖系统及 肝脏器官，对肿瘤的发生也有一定促进作用。
[0006] 目前检测粮食中DON、NIV、ZEN毒素的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法。 酶联免疫法特异性强、灵敏度高，但ELISA试剂盒以及检测设备较昂贵。高效液相色谱法灵 敏度高、可以定量检测样品中的毒素含量，但操作过程较繁琐需要专业人员操作，另外检测 设备价格昂贵无法用于基层粮库中粮食的检测。多重PCR方法检测多种毒素及禾谷镰刀菌 目前国内外还没有相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种有效简便的方法检测粮食中的脱氧雪腐镰刀烯醇 (DON)、雪腐镰刀烯醇（NIV)、玉米赤霉烯酮（ZEN)及禾谷镰刀菌。
[0008] -种粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，检测 步骤包括：将待检测粮食研磨成粉，用CTAB法提取总DNA ;以所提DNA作为模板进行多重 PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测粮食中是否 被禾谷镰刀菌侵染以及是否含有脱氧雪腐镰刀烯醇（DON)、雪腐镰刀烯醇（NIV)、玉米赤霉 烯酮（ZEN)。
[0009] 所述的检测方法，具体步骤如下：
[0010] 1.粮食样品的前处理：粮食样品20000rpm粉碎lmin。
[0011] 2.总DNA的提取：
[0012] a.取样品粉末于1. 5mL离心管中，CTAB提取缓冲液，轻轻摇动使粉末均匀分散于 缓冲液中，65°C水浴20min ;
[0013] b.冷却至室温后，加入苯酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)，轻轻混勻，10, OOOrpm离心 lOmin ；
[0014] c.吸取上层水相。加入1/10体积的10% CTAB-0. 7M NaCl，轻轻混匀，再加入等体 积的氯仿：异戊醇（24:1)，轻轻混勻，10, OOOrpm离心lOmin ;
[0015] d.吸取上层水相，加入等体积的冰冻异丙醇，轻轻摇动，出现白色DNA絮状沉淀， 4, OOOrpm离心lOmin，倒掉上清，加入70 %乙醇浸泡DNA，其间换洗70 %乙醇2-3次；
[0016] e.倒掉70%乙醇.用滤纸吸干多余的水分，风干；
[0017] f.用适量TE缓冲液溶解DNA.加入RNase A至终浓度为20 μ g/mL后，37°C条件下 保温30min，-20°C保存。
[0018] 3.PCR 扩增
[0019] a.扩增体系：10 XPCR Buffer 2. 5 μ L ;Mg2+ (10 μ Μ) 1. 5 μ L ;dNTPs (2mM) 2. 0 μ L ;弓| 物1上下游各1. 5 μ L ;引物2上下游各1. 0 μ L ;引物3上下游各0. 8 μ L ;DNA模板1 μ L ; Taq 酶（5U/ μ L) 0· 25 μ L ;ddH20 12. 15 μ L。
[0020] b. PCR反应条件：
[0021]
【权利要求】
1. 一种粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，检测步 骤包括：将待检测粮食研磨成粉，用CTAB法提取总DNA ;以所提DNA作为模板进行多重PCR 扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测粮食中是否被禾 谷镰刀菌侵染以及是否含有脱氧雪腐镰刀烯醇（DON)、雪腐镰刀烯醇（NIV)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)。
2. 如权利要求1所述的粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特 征在于，所述的检测方法具体步骤如下： 1) 、粮食样品的前处理：粮食样品20000rpm粉碎lmin ; 2) 、总DNA的提取： a. 取样品粉末于离心管中，CTAB提取缓冲液，轻轻摇动使粉末均匀分散于缓冲液中， 65°C 水浴 20min ; b. 冷却至室温后，加入苯酚：氯仿：异戊醇，苯酚：氯仿：异戊醇比例25 :24 :1，混匀， 10, OOOrpm 离心 lOmin ; c. 吸取b步骤上层水相，加入1/10体积的10% CTAB-0. 7M NaCl，混匀，再加入等体积 的氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇比例24:1，混勻，10, OOOrpm离心lOmin ; d. 吸取c步骤上层水相，加入等体积的冰冻异丙醇，轻轻摇动，出现白色DNA絮状沉淀， 4, OOOrpm离心lOmin，倒掉上清，加入70 %乙醇浸泡DNA，其间换洗70 %乙醇2-3次； e. 倒掉70%乙醇.用滤纸吸干多余的水分，风干； f. 用TE缓冲液溶解DNA.加入RNaseA至终浓度为20μ8/ιΛ后，37°C条件下保温 30min，-2(TC 保存； 3) 、PCR扩增 a. 扩增体系：10XPCR Buffer 2· 5μ L ;Mg2+(10yM) 1. 5μ L ;dNTPs(2mM)2. 0μ L ;引物 1 上下游各1. 5 μ L ;引物2上下游各1. 0 μ L ;引物3上下游各0. 8 μ L ;DNA模板1 μ L ;Taq酶 (5U/ μ L) 0· 25 μ L ;ddH20 12. 15 μ L ; b. PCR反应条件：
c. 琼脂糖凝胶电泳： 取PCR产物及核酸分子量参照物（DL 2000)，在1%琼脂糖凝胶上稳压120V，电泳 30min ;若样品中有禾谷镰刀菌则会有400-500 (bp)扩增产物；若样品中有脱氧雪腐镰刀烯 醇（DON)则会有234bp扩增产物；若样品中有雪腐镰刀烯醇（NIV)则会有415bp扩增产物； 若样品中有玉米赤霉烯酮（ZEN)则会有1076bp扩增产物； 所述的提取总DNA方法中，第a步CTAB缓冲液的成分为：lOOmMTris-HCl (pH8. 0)，20mM EDTA-Na，1. 4mM NaCl，2 % CTAB，2 % β -巯基乙醇。
3. 如权利要求1所述的粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特 征在于，所述的提取总DNA方法中，第c步10 % CTAB-0. 7M NaCl的成分为：4. 1 % NaCl，10 % CTAB〇
4. 如权利要求1所述的粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特 征在于，所述的提取总DNA方法中，第f步TE缓冲液成分为：10mMTris-Cl(pH8. 0)，1 mM EDTA (pH8. 0)。
【文档编号】C12Q1/68GK104046690SQ201410275995
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】王海鸥, 曹宇星, 宋歌, 杨帆 申请人:北京科技大学