一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法
【专利摘要】一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法，它涉及一种构建鲤鱼家系核心群体的方法。它解决了现有分子辅助抗病育种技术在鱼类中抗病选育过程中工作量大，费时费力难度较大的问题。核心群体的构建方法：一、亲鱼交配；二、感染实验；三、提取基因组DNA；四、PCR扩增；五、PCR数据统计；六、以数据为依据，进行筛选，从而获得获得鲤鱼抗病家系核心群体。本发明利用已知的免疫基因多态性微卫星标记进行筛选和定位，大大提高了工作效率和可靠性，且不受家系限制。本发明选育出的抗病家系，抗病力稳定遗传。本发明方法可用于鲤鱼抗病家系的选育。
【专利说明】一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种构建鲤鱼家系核心群体的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人们对水产品需求的增加，鱼类在养殖中病害问题日益显著，并逐步成为养 殖业中持续、稳定发展的瓶颈，选育和使用抗病品种是防治病害最经济有效地措施。分子辅 助抗病育种技术已经成为抗病选育的主要方法。目前，鱼类中分子辅助抗病选育技术主要 采用QTL定位和候选基因法。但QTL定位法需要先获得抗病/易感家系和具备大量分子标 记，且筛选出来的相关标记多易受家系限制，并与统计方法有关，费时费力且工作量较大， 而且筛选出来的标记大多与应用还存在一定距离。而候选基因法对于鱼类来说，由于缺乏 相关基因组方面信息，研究所需候选基因无法准确确定，且即使具备了相关基因组方面信 息，仍需从大量数据中一一排查筛选，工作量大，因而也是费时费力难度较大。由于鱼类抗 病性状属于低遗传力，因而鱼类抗病性状选育时间比常规育种所需时间长，而且选育的效 果也难以确定。
【发明内容】
[0003] 本发明是为了解决现有分子辅助抗病育种技术在鱼类中抗病选育过程中存在的 问题，如QTL定位法需要先获得抗病/易感家系和具备大量分子标记，且筛选出来的相关标 记多易受家系限制，费时费力且工作量较大，如候选基因法缺乏相关基因组方面信息，研究 所需候选基因无法准确确定，仍需从大量数据中一一排查筛选，工作量大，费时费力难度较 大的问题，而提供一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法。
[0004] 鲤鱼抗病家系核心群体的构建按以下步骤进行：
[0005] 一、鲤鱼亲鱼交配；
[0006] 二、将同一家系的子代分成N组，取其中一组进行感染实验，用病原体感染；取另 一组做空白对照组；
[0007] 三、提取感染实验后存活的子代鲤鱼基因组DNA，以及空白对照组子代鲤鱼基因组 DNA ；
[0008] 四、步骤三提取的基因组DNA用引物进行PCR扩增；
[0009] 五、PCR数据统计，感染实验组与空白对照组比较，确定感染实验组中偏离哈 迪-温伯格平衡位点的染色体及该染色体上高于基因分离定律数值的基因型；
[0010] 六、以步骤五确定的染色体及基因型为依据，对同一家系的其余子代鲤鱼进行筛 选，获得鲤鱼抗病家系核心群体；
[0011] 其中，步骤二中N彡3;
[0012] 步骤四中用50对引物进行PCR扩增，鲤鱼50条染色体每条染色体对应一对引物， 每对引物PCR扩增出的DNA片段在每个家系中至少为两条。
[0013] 本发明方法只要利用鲤鱼每条染色体上的一个多态性微卫星DNA，就可以确定所 对应染色体及其上的基因是否与抗病性有关联；无需事先获得抗病/易感家系，无需确定 抗病基因，不必在大量数据中一一排查筛选，而且不必具备大量分子标记，就能够实现鲤鱼 抗病家系核心群体的构建，并且不受家系限制，省时省力，大大降低了获得鲤鱼抗病家系核 心群体的工作量和工作周期。
[0014] 本发明方法构建的鲤鱼抗病家系核心群体对病原体（步骤二感染实验中所用的 攻毒病原体）具有极强的抗病性。利用本发明方法构建的鲤鱼抗病家系核心群体可以在短 时间内选育出优秀的鲤鱼抗病家系，且选育出的抗病家系抗病性稳定遗传。
【具体实施方式】
[0015] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0016] 一：本实施方式鲤鱼抗病家系核心群体的构建按以下步骤进行：
[0017] 一、鲤鱼亲鱼交配；
[0018] 二、将同一家系的子代分成N组，取其中一组进行感染实验，用病原体感染；取另 一组做空白对照组；
[0019] 三、提取感染实验后存活的子代鲤鱼基因组DNA，以及空白对照组子代鲤鱼基因组 DNA ；
[0020] 四、步骤三提取的基因组DNA用引物进行PCR扩增；
[0021] 五、PCR数据统计，感染实验组与空白对照组比较，确定感染实验组中偏离哈 迪-温伯格平衡位点的染色体及该染色体上高于基因分离定律数值的基因型；
[0022] 六、以步骤五确定的染色体及基因型为依据，对同一家系的其余子代鲤鱼进行筛 选，获得鲤鱼抗病家系核心群体；
[0023] 其中，步骤二中N彡3 ;
[0024] 步骤四中用50对引物进行PCR扩增，鲤鱼50条染色体每条染色体对应一对引物， 每对引物PCR扩增出的DNA片段在每个家系中至少为两条。
[0025] 本实施方式方法适用于多条染色体偏离哈迪-温伯格平衡位点的情况。
[0026] 选择含有多态性微卫星DNA的片段设计引物，并进行PCR可获得两条以上的DNA 片段。
[0027] 如果原子代鲤鱼抗病率较低，则构建的抗病家系核心群体的抗病率提升幅度较 大；如果原子代鲤鱼抗病率较高，虽然构建的抗病家系核心群体的抗病率提升并不明显，但 抗病率值高，均能够获得理想的鲤鱼抗病家系核心群体。
【具体实施方式】 [0028] 二：本实施方式与一的不同点是：步骤一中亲鱼一对 一配对。其它步骤及参数与实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0029] 三：本实施方式与一的不同点是：步骤一中亲鱼自由 交配。其它步骤及参数与实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0030] 四：本实施方式与一、二或三的不同点是：步骤二中 的病原体包含病毒、细菌和/或真菌。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。
【具体实施方式】 [0031] 五：本实施方式与一至四之一的不同点是：步骤二感 染实验中用病原体感染F1子代鲤鱼。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0032] 六：本实施方式与一至五之一的不同点是：步骤二中 每组子代鲤鱼不少于100尾。其它步骤及参数与实施方式一至五之一相同。
【具体实施方式】 [0033] 七：本实施方式与一至六之一的不同点是：步骤三提 取鲤鱼基因组DNA选用"一种提取鱼类基因组DNA的方法"（专利号为201010509719. X，申 请日为2010. 10. 15)。其它步骤及参数与实施方式一至六之一相同。
[0034]
【具体实施方式】八：本实施方式与【具体实施方式】一至七之一的不同点是：步骤四中 用到的引物如表1所示。其它步骤及参数与实施方式一至七之一相同。
[0035] 表 1
[0036]
【权利要求】
1. 一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法，其特征在于鲤鱼抗病家系核心群体的构建 按以下步骤进行： 一、 鲤鱼亲鱼交配； 二、 将同一家系的子代分成N组，取其中一组进行感染实验，用病原体感染；取另一组 做空白对照组； 三、 提取感染实验后存活的子代鲤鱼基因组DNA，以及空白对照组子代鲤鱼基因组 DNA ； 四、 步骤三提取的基因组DNA用引物进行PCR扩增； 五、 PCR数据统计，感染实验组与空白对照组比较，确定感染实验组中偏离哈迪-温伯 格平衡位点的染色体及该染色体上高于基因分离定律数值的基因型； 六、 以步骤五确定的染色体及基因型为依据，对同一家系的其余子代鲤鱼进行筛选，即 获得鲤鱼抗病家系核心群体； 其中，步骤二中N彡3; 步骤四中用50对引物进行PCR扩增，鲤鱼50条染色体每条染色体对应一对引物，每对 引物PCR扩增出的DNA片段在每个家系中至少为两条。
2. 根据权利要求1所述的一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法，其特征在于步骤一 中亲鱼一对一配对，或者自由交配。
3. 根据权利要求1所述的一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法，其特征在于步骤二 中的病原体包含病毒、细菌和/或真菌。
4. 根据权利要求1所述的一种构建鲤鱼抗病家系核心群体的方法，其特征在于步骤二 中每组子代鲤鱼不少于100尾。
【文档编号】C12Q1/68GK104094881SQ201410344425
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】贾智英, 石连玉, 赵新春, 李池陶, 葛彦龙, 胡雪松 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所