一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法
【专利摘要】一种茄子品种对黄萎病抗性的苗期快速测定方法。其主要操作是，将保藏登记号为CGMCC?NO.8959的大丽轮枝菌(Verticillium?dahiae)菌株EV8，通过PDA斜面培养基及米饭培养基的两步培养，得接种体；将待测茄子品种的种子通过室内培育成二叶一心的茄苗，再剪掉长度0.7～2.0cm的根尖。随后将接种体调节成孢子浓度(3.0～10.0)×107个/ml的孢子悬浮液，再将茄苗根部用孢子悬浮液浸泡8～15秒，然后将茄苗重新置入营养钵，并向营养钵灌入孢子悬浮液10～15ml；最后茄苗培养15～20天，进行病情指数测定及抗性型确定。该法操作简便、易于掌握、测定快速，结果准确、一致性好。
【专利说明】一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及茄子黄萎病抗性测定方法，尤其涉及茄子黄萎病的苗期快速抗性测定 方法。
【背景技术】
[0002] 茄子是我国乃至世界广泛种植的蔬菜作物。随着种植面积逐年增加，茄子病害也 呈明显上升趋势，病害已成为制约茄子栽培中优质、高产的关键因素。茄子黄萎病是生产上 的主要病害，由大丽轮枝孢（Verticillium dahliae Kleb)引起，为一种世界性土传性维管 束病害。常年造成的产量损失在20%左右，重者可达70%，甚至绝收，严重影响了茄子的产 量和品质。对茄子黄萎病的防治，常用的化学防治方法不但效果不理想，还造成严重的农残 污染。张军民等（2004年）报道了采用嫁接可以在一定程度上减轻茄子黄萎病的发生，但 嫁接费工、费时。生产实践证明，选育和种植抗病品种是防治茄子黄萎病经济、有效、安全的 措施。而茄子品种的抗病性测定是选育抗病品种必不可少的关键技术，准确测定不同茄子 品种的抗病性有助于更好地利用现有茄子品种，对筛选抗源材料、选育抗病品种具有重要 意义。
[0003] 作物病害的抗性测定评价方法有自然感病病圃测定和人工接种病圃测定两种。自 然感病病圃测定不需要人工接菌，具有操作方法简便的优点，但病圃一般发病不均匀、测定 所需时间长；人工接种测定以其具有方法标准、发病快速、测定时间短、测定结果准确等特 点，被育种者和植保工作者广泛采用。茄子黄萎病的侵染源主要有带菌土壤、病残体，病原 菌从茄子的根部伤口、幼根表皮及根毛侵入。根据该特点，近年有人分别采用苗期孢子悬浮 液浸泡幼苗根系接种测定、土壤接菌测定方法进行茄子黄萎病抗性测定，但前者因需将浸 染苗放入装有孢子悬浮液的三角瓶中，造成测定成本高、仅适合少量材料的测定；后者虽然 能大批量筛选测定材料，但由于整个测定过程均在田间进行，茄苗的发病程度易受大田气 候环境的影响，测定结果误差大，重复性、一致性差。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种茄子黄萎病的苗期快速抗性测定方法。该方法操作简 便、易于掌握、测定快速，适宜进行大量茄子材料的黄萎病抗性的测定筛选；且对茄子黄萎 病抗性的测定结果准确、一致性好。
[0005] 本发明实现其发明目的所采用的技术方案是，一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定 方法，其步骤依次为：
[0006] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0007] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养7?10天；再转移到 米饭培养基中，25?28°C恒温振荡培养8?10天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎 病接种体。
[0008] B、茄苗的培育
[0009] B1、种子处理
[0010] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将50?55°C清水倒入容器淹没种子，将种 子浸泡10?20分钟，再用温度为30°C的温水浸泡9?10小时；随后，取出种子，用湿布包 好，放置在25?28°C的培养箱中催芽至种子露白。
[0011] B2、茄苗培育
[0012] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为（7?10) cmX (7?10)cm ;将营养钵置于温度为25?28°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个 营养钵中长出一株二叶一心的茄苗。
[0013] C、病原菌接种
[0014] C1、伤根处理
[0015] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度〇. 7?2. 0cm。
[0016] C2、接种
[0017] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 (3. 0 ?10. 0) X107 个/ml。
[0018] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡8?15 秒，随后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗；并向每一营 养钵的孔内灌入孢子悬浮液10?15ml，即完成病原菌的接种。
[0019] D、病情指数的测定
[0020] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于18?28°C的日光温室内培养15?20天，根 据茄苗的黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0021] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75 %以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死。
[0022] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X4] X 100。
[0023] E、抗性型的确定
[0024] 根据D步得到的病情指数，确定出待试茄子品种的抗性型，即：
[0025] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0026] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0027] 10. 00 <病情指数彡20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0028] 20. 00 <病情指数彡35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0029] 35. 00 <病情指数彡50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0030] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0031] 上述的A步中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯200?210份、琼 脂17?25份、水1000?1300份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水800? 1200 份。
[0032] 其中，PDA斜面培养基制备方法为：将马铃薯去皮切成薄片加入水中煮沸30min， 用双层纱布过滤，向滤液中加入蔗糖和琼脂，倒入试管后加塞，在103. 4kPa(l. 05kg/cm2)蒸 汽压、温度达到121. 3°C，维持25?30分钟，取出放在超净工作台上倒成斜面即得。米饭 培养基的制备方法为：将米和水装于三角瓶中，加塞后在103. 4kPa(l. 05kg/cm2)蒸汽压、 121. 3°C的温度下，蒸煮25?30分钟，即得。
[0033] 上述的B1步的营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石5?6份、沙土 5?4 份。
[0034] 本发明方法中使用的大丽轮枝菌（Verticillium dahiae)菌株EV8,是 申请人:从 四川省成都市郫县采集到的茄子感病植株，利用普通维管束病害的病原菌分离方法分离纯 化而来。即将茄子病株的枝条切段，在超净工作台中先用无菌水清洗2?3次，再用70%酒 精进行表面消毒，用无菌水清洗3次后，用剪刀剪成小块放入PDA培养基中，25°C恒温培养 4d，进行病原菌测定，选取大丽轮枝菌株纯化培养而得。
[0035] 本发明方法中使用的大丽轮枝菌（Verticillium dahiae)菌株EV8,具有以下微 生物学特性：
[0036] 1、培养学特性：菌落在PDA平板上生长较慢，菌丝致密，为绒毛状或棉絮状。菌落 中间白色，周围均为黑色，菌落呈心圆状或辐射状，产生大量黑色微菌核。
[0037] 2、形态学特性：分生抱子梗较细、直立，基部无色，孢子梗上有1?5个轮枝层，每 层3?4枝轮枝。分生抱子较小，通常为3?6X 1. 5 μ m，富含黑色的微菌核。
[0038] 该大丽轮枝菌（verticillium dahiae)菌株EV8已于2014年03月14日，在中国 微生物菌种管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏登记号为CGMCC N0. 8959。
[0039] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0040] 一、侵染效果好、发病充分：由于采用了伤根与土壤接种相互结合的接菌方法，利 于茄子黄萎病的发生，选择的茄子黄萎病菌株在米饭培养基中繁殖迅速、选用了适宜的孢 子浓度；因此不但侵染效果好，而且接种后的茄苗成活率高，发病迅速。
[0041] 二、测定结果准确可靠：试验爺苗选择的是在营养钵内培育到二叶一心的爺苗，爺 苗的大小和长势一致，且伤根采用的是逐株相同的方式伤根、逐株蘸菌进行接种，从而达到 伤根程度和接菌量一致；全部操作均在可控、一致的环境中进行，避免了大田环境变化对茄 苗生长和发病和生长的不确定影响，其茄子黄萎病抗性测定结果准确、误差小，重复性、一 致性好。
[0042] 三、操作简便、易于掌握：茄苗的培育选择在营养钵内进行，茄苗的接菌侵染采用 剪刀进行伤根，接种病原菌后的茄苗放入日光温室培育，整个过程均不需特殊设施设备，也 不需特别工艺，操作简便、易于掌握。
[0043]四、可进行大量材料的测定筛选：由于茄苗的培育选择在营养钵内进行，而接种病 原菌后的茄苗放入日光温室培育，适宜进行大量茄子材料的黄萎病抗性的测定筛选。
[0044] 测定试验也证明本发明方法的测定结果准确、误差小，重复性、一致性好：对已知 黄萎病抗性分别为抗、中抗和感的蛘埠长青茄、蓉杂茄和紫圆茄三个品种，采用本发明方法 进行测定，测出的病情指数分别为14. 56?15. 68、21. 67?22. 50和42. 32?44. 46,确定 出其黄萎病抗性分别为抗、中抗和感。测定结果与三个品种的已知抗性完全一致。
[0045] 下面结合实施例对本发明进一步说明。
【具体实施方式】
[0046] 实施例一
[0047] -种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为：
[0048] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0049] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养10天；再转移到米饭 培养基中，25°C恒温振荡培养10天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体；
[0050] 本例中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯200份、琼脂20份、蔗 糖20份、水1000份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水1000份。
[0051] B、茄苗的培育
[0052] B1、种子处理
[0053] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将50°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡20分钟，再用温度为30°C的温水浸泡10小时；随后，取出种子，用湿布包好，放置在25°C 的培养箱中催芽至种子露白。
[0054] B2、茄苗培育
[0055] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为 7cmX7cm;将营养钵置于温度为25°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个营养钵中长 出一株二叶一心的爺苗。
[0056] 本例中营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石6份，沙土 4份。
[0057] C、病原菌接种
[0058] C1、伤根处理
[0059] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度1. 〇cm ;
[0060] C2、接种
[0061] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 5· 0X107 个/ml。
[0062] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡8秒，随后 将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗，并向每一营养钵的 孔内灌入孢子悬浮液l〇ml ;即完成病原菌的接种。
[0063] D、病情指数的计算
[0064] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于25°C的日光温室内培养20天，根据爺苗的 黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0065] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75 %以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死。
[0066] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X 4] X 100 ;
[0067] E、抗性型的确定
[0068] 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即：
[0069] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0070] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0071] 10. 00 <病情指数彡20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0072] 20. 00 <病情指数彡35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0073] 35. 00 <病情指数彡50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0074] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0075] 采用本例的方法对蓉杂茄品种的黄萎病抗性进行测定，测出其病情指数为21. 67， 确定其黄萎病抗性为中抗；测定结果与该品种已知的黄萎病抗性一致。
[0076] 实施例二
[0077] 一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为：
[0078] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0079] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养7天；再转移到米饭 培养基中，25°C恒温振荡培养8天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体。
[0080] 本例中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯210份、琼脂23份、蔗 糖20份、水1300份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水800份。
[0081] B、茄苗的培育
[0082] B1、种子处理
[0083] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将55°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡15分钟，再用温度为30°C的温水浸泡9小时；随后，取出种子，用湿布包好，放置在25°C 的培养箱中催芽至种子露白。
[0084] B2、茄苗培育
[0085] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为 lOcmXIOcm;将营养钵置于温度为28°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个营养钵中 长出一株二叶一心的爺苗。
[0086] 本例中营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石5份，沙土 5份。
[0087] C、病原菌接种
[0088] C1、伤根处理
[0089] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度2. 0cm。
[0090] C2、接种
[0091] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 10. ΟX107 个/ml。
[0092] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡15秒，随 后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗，并向每一营养钵 的孔内灌入孢子悬浮液15ml ;即完成病原菌的接种。
[0093] D、病情指数的计算
[0094] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于25°C的日光温室内培养15天，根据爺苗的 黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0095] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75 %以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死。
[0096] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X4] X 100。
[0097] E、抗性型的确定
[0098] 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即：
[0099] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0100] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0101] 10. 〇〇 <病情指数< 20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0102] 20. 00 <病情指数< 35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0103] 35. 00 <病情指数< 50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0104] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0105] 采用本例的方法对蓉杂茄品种的黄萎病抗性进行测定，测出其病情指数为22. 50， 确定其黄萎病抗性为中抗。与该品种的黄萎病已知抗性一致。
[0106] 实施例三
[0107] 一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为：
[0108] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0109] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养9天；再转移到米饭 培养基中，25°C恒温振荡培养9天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体。
[0110] 本例中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯205份、琼脂17份、蔗 糖20份、水1000份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水1200份。
[0111] B、茄苗的培育
[0112] B1、种子处理
[0113] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将53°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡15分钟，再用温度为30°C的温水浸泡9. 5小时；随后，取出种子，用湿布包好，放置在 27°C的培养箱中催芽至种子露白。
[0114] B2、茄苗培育
[0115] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为 8cmX8Cm;将营养钵置于温度为27°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个营养钵中长 出一株二叶一心的爺苗。
[0116] 本例中营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石5. 5份，沙土 4. 5份。
[0117] C、病原菌接种
[0118] C1、伤根处理
[0119] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度〇. 7cm ;
[0120] C2、接种
[0121] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 3· 0X107 个/ml。
[0122] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡12秒，随 后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗，并向每一营养钵 的孔内灌入孢子悬浮液12ml ;即完成病原菌的接种。
[0123] D、病情指数的计算
[0124] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于18°C的日光温室内培养19天，根据爺苗的 黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0125] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75 %以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死。
[0126] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X4] X 100。
[0127] E、抗性型的确定
[0128] 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即：
[0129] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0130] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0131] 10. 00 <病情指数< 20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0132] 20. 00 <病情指数彡35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0133] 35. 00 <病情指数< 50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0134] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0135] 采用本例的方法对蛘埠长青茄品种的黄萎病抗性进行测定，测出其病情指数为 14. 56,确定其黄萎病抗性为抗。与该品种的黄萎病已知抗性一致。
[0136] 实施例四
[0137] 一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为：
[0138] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0139] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（verticillium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养8天；再转移到米饭 培养基中，25°C恒温振荡培养8天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体。
[0140] 本例中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯200份、琼脂22份、蔗 糖20份、水1100份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水1000份。
[0141] B、茄苗的培育
[0142] B1、种子处理
[0143] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将50°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡20分钟，再用温度为30°C的温水浸泡10小时；随后，取出种子，用湿布包好，放置在26°C 的培养箱中催芽至种子露白。
[0144] B2、茄苗培育
[0145] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为 9cmX9Cm;将营养钵置于温度为26°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个营养钵中长 出一株二叶一心的爺苗。
[0146] 本例中营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石6份，沙土 4份。
[0147] C、病原菌接种
[0148] C1、伤根处理
[0149] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度1. 8cm ;
[0150] C2、接种
[0151] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 8· 0X107 个/ml。
[0152] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡10秒，随 后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗，并向每一营养钵 的孔内灌入孢子悬浮液l〇ml ;即完成病原菌的接种。
[0153] D、病情指数的计算
[0154] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于25°C的日光温室内培养16天，根据爺苗的 黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0155] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75 %以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死。
[0156] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X4] X 100。
[0157] E、抗性型的确定
[0158] 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即：
[0159] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0160] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0161] 10. 00 <病情指数< 20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0162] 20. 00 <病情指数< 35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0163] 35. 00 <病情指数< 50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0164] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0165] 采用本例的方法对蛘埠长青茄品种的黄萎病抗性进行测定，测出其病情指数为 15. 68,确定其黄萎病抗性为抗。与该品种的黄萎病已知抗性一致。
[0166] 实施例五
[0167] 一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为：
[0168] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0169] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养10天；再转移到米饭 培养基中，25°C恒温振荡培养10天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体。
[0170] 本例中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯210份、琼脂20份、蔗 糖20份、水1000份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水950份。
[0171] B、茄苗的培育
[0172] B1、种子处理
[0173] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将55°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡20分钟，再用温度为30°C的温水浸泡9小时；随后，取出种子，用湿布包好，放置在25°C 的培养箱中催芽至种子露白。
[0174] B2、茄苗培育
[0175] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为 7cmX7cm;将营养钵置于温度为25°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个营养钵中长 出一株二叶一心的爺苗。
[0176] 本例中营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石6份，沙土 4份。
[0177] C、病原菌接种
[0178] C1、伤根处理
[0179] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度1. 2cm ;
[0180] C2、接种
[0181] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 5· 0X107 个/ml。
[0182] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡12秒，随 后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗，并向每一营养钵 的孔内灌入孢子悬浮液l〇ml，即完成病原菌的接种。
[0183] D、病情指数的计算
[0184] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于20°C的日光温室内培养18天，根据爺苗的 黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0185] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50 %?75%以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死。
[0186] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X 4] X 100 ;
[0187] E、抗性型的确定
[0188] 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即：
[0189] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0190] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0191] 10. 00 <病情指数< 20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0192] 20. 00 <病情指数< 35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0193] 35. 00 <病情指数< 50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0194] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0195] 采用本例的方法对紫圆茄品种的黄萎病抗性进行测定，测出其病情指数为42. 32， 确定其黄萎病抗性为感，与该品种的黄萎病已知抗性一致。
[0196] 实施例六
[0197] 一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为：
[0198] A、茄子黄萎病接种体的制备
[0199] 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC N0. 8959的大丽轮枝菌（Vertici 11 ium dahiae)菌株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养7天；再转移到米饭 培养基中，27°C恒温振荡培养9天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体；
[0200] 本例中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯208份、琼脂25份、蔗 糖20份、水1050份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水1000份。
[0201] B、茄苗的培育
[0202] B1、种子处理
[0203] 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将52°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡16分钟，再用温度为30°C的温水浸泡9小时；随后，取出种子，用湿布包好，放置在28°C 的培养箱中催芽至种子露白；
[0204] B2、茄苗培育
[0205] 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为 7cmX7cm;将营养钵置于温度为28°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个营养钵中长 出一株二叶一心的爺苗；
[0206] 本例中营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石5份，沙土 5份。
[0207] C、病原菌接种
[0208] C1、伤根处理
[0209] 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀将剪掉根尖，剪掉 的根尖长度1. 6cm ;
[0210] C2、接种
[0211] 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用 血球计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至 6· 0X107 个/ml ;
[0212] 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡15秒，随 后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗，并向每一营养钵 的孔内灌入孢子悬浮液12ml，即完成病原菌的接种；
[0213] D、病情指数的计算
[0214] 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于20°C的日光温室内培养17天，根据爺苗的 黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级：
[0215] 0级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变 黄或呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄 色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75 %以上表现症状，有少数叶片凋 落；4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株 枯死；
[0216] 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数= [Σ (各级病株数X相应病级数）/总株数X 4] X 100 ;
[0217] E、抗性型的确定
[0218] 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即：
[0219] 病情指数=0,则待测茄子品种的抗性型为免疫；
[0220] 0 <病情指数彡10. 00,则待测茄子品种的抗性型为高抗；
[0221] 10. 00 <病情指数< 20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗；
[0222] 20. 00 <病情指数彡35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗；
[0223] 35. 00 <病情指数< 50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感；
[0224] 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
[0225] 采用本例的方法对紫圆茄品种的黄萎病抗性进行测定，测出其病情指数为44. 46， 确定其黄萎病抗性为感。与该品种的黄萎病已知抗性一致。
【权利要求】
1. 一种茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其步骤依次为： A、 茄子黄萎病接种体的制备 将分离纯化的保藏登记号为CGMCC NO. 8959的大丽轮枝菌（verticillium dahiae)菌 株EV8,转移到PDA斜面培养基上，于25°C的培养箱中培养7?10天；再转移到米饭培养基 中，25?28°C恒温振荡培养8?10天，即得含大丽轮枝菌EV8孢子的茄子黄萎病接种体； B、 茄苗的培育 B1、种子处理 将待测茄子品种的种子放入容器内，再将50?55°C清水倒入容器淹没种子，将种子浸 泡10?20分钟，再用温度为30°C的温水浸泡9?10小时；随后，取出种子，用湿布包好， 放置在25?28°C的培养箱中催芽至种子露白； B2、茄苗培育 将B1步得到的种子播种于基质中含有蛭石的营养钵中，营养钵的规格为（7?10) cmX (7?10) cm ;将营养钵置于温度为25?28°C、自然光照下的温室内进行培养，使一个 营养钵中长出一株二叶一心的爺苗； C、 病原菌接种 C1、伤根处理 将B2步的茄苗从营养钵内连同基质一并取出，用已消毒的剪刀剪掉根尖，剪掉的根尖 长度0· 7?2. 0cm ; C2、接种 将A步得到的接种体用已消毒的双层纱布过滤，得到的孢子悬浮液在显微镜下用血球 计数板统计大丽轮枝菌EV8的孢子数量，并用无菌水将孢子悬浮液的孢子浓度调至（3. 0? 10. 0) X 107 个 /ml ; 再将Cl步伤根处理后的茄苗根部连同基质一并放入孢子悬浮液中浸泡8?15秒，随 后将爺苗连同基质重新置入营养钵中，一个营养钵内置入爺苗一株爺苗；并向每一营养钵 的孔内灌入孢子悬浮液10?15ml，即完成病原菌的接种； D、 病情指数的计算 将接种病原菌后的爺苗及营养钵置于18?28°C的日光温室内培养15?20天，根据爺 苗的黄萎病发生情况，按以下分级标准逐株确定发病等级： 〇级：健株，叶片无症状；1级：有25%及以下的叶片表现症状，即叶片出现叶肉变黄或 呈现不规则形的黄色病斑；2级：病株叶片25%?50%显症状，病斑颜色大部分变成黄色或 黄褐色，叶片边缘略有卷枯；3级：病株叶片50%?75%以上表现症状，有少数叶片凋落； 4级：病株叶片75%以上表现症状，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，以致整株枯 死； 再根据各株茄苗的发病等级计算出待测茄子品种的病情指数，病情指数=[Σ (各级 病株数X相应病级数）/总株数X 4] X 100 ; E、 抗性型的确定 根据D步得到的病情指数，确定出待测茄子品种的抗性型，即： 病情指数=〇,则待测茄子品种的抗性型为免疫； 〇 <病情指数< 10. 〇〇,则待测茄子品种的抗性型为高抗； 10. 00 <病情指数< 20. 00,则待测茄子品种的抗性型为抗； 20. 00 <病情指数< 35. 00,则待测茄子品种的抗性型为中抗； 35. 00 <病情指数< 50. 00,则待测茄子品种的抗性型为感； 50 <病情指数，则待测茄子品种的抗性型为高感。
2. 根据权利要求1所述的茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其特征在于：所述的A 步中的PDA斜面培养基的原料组成及质量配比为马铃薯200?210份、琼脂17?25g、蔗 糖20份、水1000?1300份；米饭培养基的原料组成及质量配比为米50份，水800?1200 份。
3. 根据权利要求1所述的茄子黄萎病苗期快速抗性测定方法，其特征在于：所述的B1 步的营养钵的基质的原料组成及质量配比为蛭石5?6份、沙土 5?4份。
【文档编号】C12Q1/18GK104152534SQ201410387803
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】曾华兰, 叶鹏盛, 何炼, 刘朝辉, 韦树谷, 张骞方, 蒋秋平, 李琼英 申请人:四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所