一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性t淋巴细胞的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者自身的肿瘤浸润性T淋巴细胞，在使用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下激活大量扩增，具有高活性的抗肿瘤细胞毒性应答；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。
【专利说明】一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备方 法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性Τ淋巴细胞的制备方法，其中包 括如下特征：来自于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤组织分离得到的浸润性Τ淋巴细胞，在 自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下激活大量扩增，具有高 活性抗肿瘤细胞毒性应答；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体肿瘤浸润性 Τ淋巴细胞的试剂盒，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的免疫治疗。
【背景技术】
[0002] 肿瘤浸润性Τ淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)在体外加白介素 2 (interleukin-2, IL-2)培养扩增后，其抗肿瘤作用比LAK细胞强50-100倍，而且只需要 小量的IL-2就可以发挥作用，并且因其对自身肿瘤靶细胞具有特异性，成为国内外肿瘤生 物研究的热点，并在临床治疗中得到使用。
[0003] TIL细胞主要含有⑶8+、⑶4+T淋巴细胞和NK细胞等，治疗对黑素瘤、肺癌、肾癌、 结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。TIL细胞数量和杀伤功能与 疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量TIL细胞有限和培养时间过长。TIL细胞 体外扩增至5 X 108平均需59天，扩增至5 X 109则平均需80天，TIL在含IL-2的培养基中 经过一段时间培养后出现选择性扩增T淋巴细胞，⑶3+占80%以上，⑶4+和⑶8+占50%以 上，NK细胞扩增低下，占不到10%左右。因而传统使用的小剂量白介素2激活生长倍数有 限，培养时间过长引起了 TIL细胞杀伤功能低下。
[0004] 本发明提供了以自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞，在小剂量IL-2 作用下大量扩增TIL细胞，培养至20天细胞增殖到5X10 8以上，增殖倍数达到1000倍以 上，TIL细胞杀瘤活性在20天达到最佳，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的 抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术增殖培养TIL细胞的不足，特别是因 TIL细胞扩增到临床治 疗需要的细胞数量而培养时间过长，含IL-2的培养基选择性扩增T淋巴细胞占有比例很 低，因而产生的杀瘤活性低下。本发明通过前期研究实验发现自体肿瘤抗原负载的树突状 细胞作为滋养层细胞，作为滋养层细胞和低剂量IL-2作用下培养TIL细胞，培养至20天细 胞增殖倍数达到1000倍以上，TIL细胞数达到5X10 8以上足以满足临床抗肿瘤的作用，保 证癌症患者临床治疗疗效。
[0006] 自体肿瘤抗原负载的树突状细胞膜上高表达的⑶80、⑶83、⑶86和⑶137L多肽， 及其加工的肿瘤抗原表位，将可以激活T淋巴细胞大量扩增和具有高活性的抗肿瘤细胞毒 性应答。将该树突状细胞作为滋养层细胞，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。
[0007] 本发明涉及一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞增殖的制备方法，其 特征在于，使用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞和白介素2,扩增激活肿瘤浸润性T淋巴细 胞，使肿瘤浸润性Τ淋巴细胞得以大量增殖。
[0008] 本发明所述的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通 过高速离心收集树突状细胞，作为TIL激活扩增的滋养层细胞。
[0009] 本发明所述方法中肿瘤浸润性T淋巴细胞来源于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤 组织。
[0010] 新鲜自体肿瘤组织使用眼科剪剪碎成1mm3的小块，所得剪碎的组织小块用0. 25% (质量体积比）胰酶或100活性单位/mL I型胶原酶溶液以1克：0. 5mL的重量体积比 消化30分钟后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10 μ Μ细胞筛，并用 5mLlXroS(pH= 7.4)洗涤两次，过滤后的溶液以lOOOrpm离心收集细胞沉淀，加入AM-V 培养基重悬至l〇ml，单细胞悬液经连续密度梯度离心分离得到肿瘤浸润性T淋巴细胞和自 体肿瘤细胞。
[0011] 肿瘤细胞用AIM-V培养基液稀释成细胞浓度为2X106/mL的细胞悬液，分装于冻 存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融3-5次，5000rpm离心10分钟后取 上清，加入到1. 5mL离心管中制备成自体肿瘤抗原，于-80°C储存，用于负载树突状细胞。
[0012] 本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞与浸润性T淋巴细胞首先共培养5 天，所述树突状细胞与淋巴细胞的用量比例为树突状细胞数：淋巴细胞数=1-10 : 1，更 优选地，为树突状细胞数：淋巴细胞数=3 : 1-5 : 1。
[0013] 共培养5天后，将浸润性T淋巴细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充 10-20mL新鲜淋巴细胞培养基（含50-500活性单位/mL白介素2)，在37°C、5% C02培养箱 中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基（含50-500活性单位/mL白介素 2)，在37°C、5% C02培养箱中继续培养2-3天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到 18-21天，使得细胞数达到5X108以上。
[0014] 优选地，本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞用淋巴细胞培养基重悬，力口 入到细胞培养板中，使用包括强酸、强碱和/或辐照处理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细 胞作为滋养层细胞。
[0015] 本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入 50-500活性单位/mL白介素2和10% (体积比）自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养 基为淋巴细胞无血清培养基，如AM-V、X-VIV0和GT-T551等，含有500活性单位/mL白介 素2。
[0016] 本发明还提供了一种制备自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包括：
[0017] A液为淋巴细胞培养基；
[0018] B液为GM-CSF和IL-4混合液；
[0019] C液为肿瘤坏死因子α溶液；
[0020] D液为白介素2溶液；
[0021] Ε液为组织消化液；
[0022] F液为淋巴细胞分离液；
[0023] G液为生理盐水；
[0024] 细胞培养板以及使用说明书；
[0025] 其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。
[0026] 试剂盒组分分装：试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为：A液500mL/l瓶，B液 0· 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/Ι 支，F 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的 试剂盒。
[0027] 经培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸、强碱和/或 辐照处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养 板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。
[0028] 本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备TIL细胞，可用于各类癌症包括实体瘤 和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1表示本发明实施例一制备的实施例细胞表型流式细胞仪检测流式图；
[0030] 图2表示发明实施例2制备的肿瘤细胞增殖图；
[0031] 图3表示本发明实施例三制备的TIL细胞表型流式细胞仪检测流式图；
[0032] 图4表示本发明附子多糖诱导培养的NKT细胞酶联免疫斑点试验检测干扰素 γ 分泌结果图。
【具体实施方式】
[0033] 本发明发现通过自体肿瘤抗原负载的树突状细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可 以促进⑶8a+、NK细胞和⑶4+中Thl+细胞大量增殖，抑制TIL细胞中调节性T淋巴细胞的 增殖和产生，延长TIL细胞端粒酶活性，产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。TIL细胞培养至 20天细胞增殖倍数达到1000倍以上，TIL细胞数达到5 X108以上满足临床治疗需要，可用 于多次抗肿瘤临床应用。
[0034] 对本发明涉及的一种自体肿瘤浸润性T淋巴细胞增殖的制备方法进行具体说明。 本发明涉及采用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞和白介素2,扩增激活肿瘤浸润性T淋巴 细胞，使得⑶8a+、NK细胞和⑶4+中Thl+细胞大量扩增，获得具有抗肿瘤作用的TIL细胞。
[0035] 本发明涉及一种自体肿瘤浸润性T淋巴细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用 自体肿瘤抗原负载的树突状细胞和白介素2,扩增激活肿瘤浸润性T淋巴细胞，使肿瘤浸润 性T淋巴细胞得以大量增殖。
[0036] 本发明所述的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞膜上高表达的⑶80、⑶83、⑶86和 CD137L多肽，及其加工的肿瘤抗原表位，将可以激活T淋巴细胞大量扩增和具有高活性的 抗肿瘤细胞毒性应答。通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集树突状细胞进行处 理，作为TIL激活扩增的滋养层细胞。
[0037] 本发明所述方法中肿瘤浸润性T淋巴细胞来源于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤 组织。
[0038] 新鲜自体肿瘤组织使用眼科剪剪碎成1mm3的小块，所得剪碎的组织小块用0. 25% (质量体积比）胰酶或100活性单位/mL I型胶原酶溶液以1克：0. 5mL的重量体积比 消化30分钟后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10 μ Μ细胞筛，并用 5mLlXPBS(pH = 7.4)洗涤两次，过滤后的溶液以lOOOrpm离心收集细胞沉淀，加入AM-V 培养基重悬至16mL，制备成单细胞悬液。
[0039] 用5mL移液管取5mL淋巴细胞分离液加入到15mL离心管中，再向其中缓慢加入 8mL单细胞悬液，1600rpm(转每分钟）离心25分钟，经连续密度梯度离心后，中间白膜层为 肿瘤浸润性T淋巴细胞，下层沉淀的细胞为自体肿瘤细胞。
[0040] 肿瘤细胞用AIM-V培养基液稀释成细胞浓度为2 X 106/mL的细胞悬液，分装于冻 存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融3-5次，5000rpm离心10分钟后取 上清，加入到1. 5mL离心管中制备成自体肿瘤抗原，于-80°C储存，用于负载树突状细胞。
[0041] 来自肿瘤患者100mL外周血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细 胞。外周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，贴壁细胞加入完全培养基诱导培养，含有 1000IU/mL GM-CSF、500IU/mL IL-4,放置37°C、5% 0)2培养箱中，培养五天后收获未成熟树 突状细胞。计数后，3-5 X 106未成熟树突状细胞加入500 μ L制备好的自体肿瘤抗原，负载 树突状细胞，放置37°C、5% C02培养箱中培养2-4小时，加入20ng/mL肿瘤坏死因子α培 养12小时，制备得到成熟树突状细胞。
[0042] 本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞与浸润性Τ淋巴细胞首先共培养5 天，所述树突状细胞与淋巴细胞的用量比例为树突状细胞数：淋巴细胞数=1-10 : 1，更 优选地，为树突状细胞数：淋巴细胞数=3 : 1-5 : 1。
[0043] 优选地，本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞用淋巴细胞培养基重悬，力口 入到细胞培养板中，使用包括强酸、强碱和/或辐照处理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细 胞作为滋养层细胞。
[0044] 共培养5天后，将浸润性Τ淋巴细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充 10-20mL新鲜细胞培养基（含50-500IU/mL白介素2)，在37°C、5% C02培养箱中继续培养 2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基（含50-500活性单位/mL白介素2)，在37°C、 5% C02培养箱中继续培养2-3天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到18-21天， 使得细胞数达到5 X 108以上。
[0045] 本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入 50-500活性单位/mL白介素2和10% (体积比）自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养 基为淋巴细胞无血清培养基，如AM-V、X-VIV0和GT-T551等，含有500活性单位/mL白介 素2。
[0046] 本发明还提供了一种制备自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋 巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0047] A液为淋巴细胞培养基；
[0048] B液为GM-CSF和IL-4混合液；
[0049] C液为肿瘤坏死因子α溶液；
[0050] D液为白介素2溶液；
[0051] Ε液为组织消化液；
[0052] F液为淋巴细胞分离液；
[0053] G液为生理盐水；
[0054] 细胞培养板以及使用说明书；
[0055] 其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。
[0056] 试剂盒组分分装：试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为：A液500mL/l瓶，B液 0· 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/Ι 支，F 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的 试剂盒。
[0057] 经培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸、强碱和/或 辐照处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养 板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。
[0058] 作为本发明TIL细胞扩增培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培 养袋，可例举，为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、250mL细胞培养袋等细胞培养用器 材（容器），均可用于本发明，优选细胞培养袋。
[0059] 本发明的制造方法中对TIL细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为 50%小牛血清、40%细胞培养液和10%二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为TIL细胞培 养液。
[0060] 在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限 制，如大于0容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优 选为5% (体积比）。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血 楽的来源，可以是自己（意味着与所培养的细胞来源相同）或非自己（意味着与所培养的 细胞的来源不同）中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外， 也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
[0061] 本发明的自体TIL细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中 使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在 37°C、5% C02等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来 稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
[0062] 本发明还提供TIL细胞在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥 抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述TIL细胞还具有如下优点，多次TIL细 胞治疗将更好地引发CD8+、Thl细胞免疫应答和NK细胞杀瘤活性，抑制调节性T淋巴细胞 免疫抑制活性，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期 的延长。
[0063] 以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
[0064] 实施例一自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备
[0065] 采集乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和肝癌患者各1名的新鲜自体肿瘤组织（与其签署 了知情同意书），使用眼科剪剪碎成1_3的小块，所得剪碎的组织小块用〇. 25% (质量体 积比）胰酶或100活性单位/mL I型胶原酶溶液以1克：0. 5mL的重量体积比消化30分钟 后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10 μ Μ细胞筛，并用5mLl XPBS (pH =7. 4)洗涤两次，过滤后的溶液以lOOOrpm离心收集细胞沉淀，加入AIM-V培养基（美国 Life公司）重悬至16mL，制备成单细胞悬液。
[0066] 用5mL移液管取5mL淋巴细胞分离液加入到15mL离心管中，再向其中缓慢加入 8mL单细胞悬液，1600rpm(转每分钟）离心25分钟，经连续密度梯度离心后，中间白膜层为 肿瘤浸润性T淋巴细胞，下层沉淀的细胞为自体肿瘤细胞。
[0067] 肿瘤浸润性T淋巴细胞用10mLlXPBS(pH = 7. 4)洗涤1次，1000rpm、4°C下离心 10分钟，细胞用2mL AM-V培养基重悬。取10ul细胞液用lXPBS(pH7.4)稀释10倍，稀释 液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色 染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率均达到98%以上。
[0068] 取苔盼兰染色计数后的0. 6 X 106肿瘤浸润性T淋巴细胞，分三组，第一组分别添 加到有20yL FITC标记鼠抗人⑶3单抗、20yL PE标记鼠抗人⑶56单抗和20yL PerCP 标记鼠抗人⑶8单抗；第二组分别添加20 μ L FITC标记鼠抗人⑶3单抗、20 μ LPE标记鼠 抗人⑶4单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶25单抗；第三组为同型对照，分别添加到有 20 μ LFITC标记鼠 IgGl、20 μ L PE标记鼠 IgGl和20 μ L PerCP标记鼠 IgGl。置于4°C冰箱 染色30分钟，然后用lmL的1 X磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤三次，最后用0. 5mL的1 XPBS重 悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）检测。图 1结果显示，乳腺癌患者来源分离得到的TIL细胞表型为：⑶3+细胞为87. 77%，⑶3+/⑶8+ 细胞为 54. 52%，CD56+细胞为 12. 09%，CD3+/CD4+细胞为 78. 17%和 CD4+/CD25+细胞为 27. 69%，表明TIL细胞中⑶3+/⑶8+细胞和⑶56+NK细胞含量比较低下。
[0069] 实施例二自体肿瘤抗原负载树突状细胞的制备
[0070] 实施例一中获得肿瘤细胞用AIM-V培养基液稀释成细胞浓度为2X 106/mL的细胞 悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融3-5次，5000rpm离 心10分钟后取上清，加入到1. 5mL离心管中制备成自体肿瘤抗原，于-80°C储存，用于负载 树突状细胞。
[0071] 来自肿瘤患者100mL外周血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞。 外周血单个核细胞用AM-V培养基重悬，贴壁细胞加入完全培养基诱导培养，含有1000IU/ mL GM-CSF、500IU/mL IL-4,放置371：、5%0)2培养箱中，培养五天后收获未成熟树突状细 胞。计数后，3-5 X 106未成熟树突状细胞加入500 μ L制备好的自体肿瘤抗原，负载树突状 细胞，放置37°C、5%C02培养箱中培养2-4小时，加入20ng/mL肿瘤坏死因子α培养12小 时，收获成熟树突状细胞，l〇〇〇rpm离心10分钟后弃上清，用制备得到成熟树突状细胞。
[0072] 取苔盼兰染色计数后的0. 6 X 106树突状细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶80单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶86单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人 ⑶11c单抗；第二组分别添加20yL FITC标记鼠抗人⑶137L单抗、20yL PE标记鼠抗人 ⑶83单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶11c单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠 IgGl、20 μ L PE标记鼠 IgGl和20 μ L PerCP标记鼠 IgGl。置于4°C冰箱染色 30分钟，然后用lmL的IX磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤三次，最后用0. 5mL的IXPBS重悬洗 涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur流式细胞仪检测。检测结果显示，树突状细 胞表型为CD80+为96. 1 %、CD86+为98. 8 %、CD83+为86 %和CD 137L+为86 %，表明通过本 发明技术得到细胞为成熟树突状细胞，并高表达各类共刺激分子。
[0073] 实施例三自体肿瘤浸润性T淋巴细胞大量增殖培养
[0074] 取实施例二中制备的6X106成熟树突状细胞用3mLAIM-V培养基重悬，每孔0. 5mL 加入到6孔细胞培养板中，浸润细胞培养板底面，使用100Gy γ射线辐照处理，将自体肿瘤 抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞。向6孔细胞培养板每孔中加入3 X 106肿瘤浸润 性Τ淋巴细胞，每孔为3mL的AM-V培养基（含500活性单位/mL白介素2)。自体肿瘤抗 原负载的树突状细胞与肿瘤浸润性T淋巴细胞首先共培养5天。
[0075] 激活培养5天后，将浸润性T淋巴细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充 10-20mL新鲜AIM-V培养基（含500活性单位/mL白介素2)，在37°C、5% C02培养箱中继 续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜AIM-V培养基（含500活性单位/mL白介素2)，在 37°C、5% C02培养箱中继续培养2-3天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到18-21 天。
[0076] 取10ul细胞液用1 XPBS (pH7. 4)稀释10倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液， 混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活 细胞，细胞活率均达到98%以上。图2结果显示，随着TIL细胞体外培养时间增加，扩增倍 数也不断增加，实施例一中四名肿瘤患者TIL细胞培养到20天，细胞扩增倍数均高于1100 倍，每位患者的TIL细胞数均高于5X 108。
[0077] 取经激活扩增的0. 6 X 106肿瘤浸润性T淋巴细胞，分三组，第一组分别添加到有 20yL FITC标记鼠抗人⑶3单抗、20yL PE标记鼠抗人⑶56单抗和20yL PerCP标记鼠抗 人⑶8单抗；第二组分别添加20 μ L FITC标记鼠抗人⑶3单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶4 单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶25单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC 标记鼠 IgGl、20 μ L PE标记鼠 IgGl和20 μ L PerCP标记鼠 IgGl。置于4°C冰箱染色30分 钟，然后用lmL的1 X磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤三次，最后用0. 5mL的1 XPBS重悬洗涤后 的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）检测。图3结果显 示，其中一名黑色素瘤患者来源培养得到的TIL细胞表型为：⑶3+细胞为93. 68%，⑶3+/ CD8+ 细胞为 82. 10%，CD56+ 细胞为 42. 39%，CD3+/CD4+ 细胞为 70. 91%和 CD4+/CD25+ 细 胞为8. 73%，表明TIL细胞中⑶3+/⑶8+细胞和⑶56+NK细胞含量对比实施例一分离得到 TIL细胞显著提高，⑶4+/⑶25+调节性T淋巴细胞数量得到很大的抑制。
[0078] 实施例四TIL细胞体外杀瘤试验
[0079] 选择相应的肺癌细胞（A549)和肝癌细胞（HepG2)作为靶细胞，用51Cr标记，即靶 细胞（2X10 6/mL)通过与300yCi51Cr在RPMI1640培养基中37°C孵育2小时。标记好的 靶细胞用1 X PBS洗涤三次，并最终用RPMI1640 (含10 %小牛血清）重悬到2 X 105的浓度。 以每孔2 X 104个标记的靶细胞（0. lmL)添加到96孔板的孔中。
[0080] 根据转化医学杂志报道的转移性黑色素瘤中自体肿瘤浸润性T淋巴细胞和低剂 量白介素 2 的适应性细胞治疗（Ellebaek El，Iversen TZ，Junker N，et al. Adoptive cell therapy with autologous tumor infiltrating lymphocytes and low-dose Interleukin-2in metastatic melanoma patients. J Transl Med. 2012Aug21 ；10 ：169.) 中德现有技术，制备TIL细胞作为对比例。
[0081] 将实施例三中制备的TIL细胞和现有技术制备的TIL细胞作为效应细胞，分别以 2. 5 : 1、5 : 1、10 : 1、20 : 1和40 : 1的效靶比加入对应的孔中，在37°C孵育4小时。 孵育后，取上清75yL组分用γ放射计数器计数。特异的51Cr释放的百分比根据下述的公 式进行计算。
[0082] (检测的每分脉冲数自发释放的每分脉冲数） %特异裂解率=- (最大释放的每分脉冲数(自发释放的每分脉冲数）
[0083] 其中，自发释放的每分脉冲数通过单独培养靶细胞（未加效应细胞）获得，最大释 放的每分脉冲数是用终浓度2% ΝΡ-40 (表面活性剂，上海生工）处理的单独培养靶细胞后 获得的。检测的每分脉冲数通过添加效应细胞的靶细胞培养获得的。
[0084] 图4显示了由实施例三获得的TIL细胞，对肺癌细胞（Α549)和肝癌细胞（HepG2) 产生抗肿瘤免疫应答，随着效靶比不断提高，对肿瘤细胞产生的CTL应答也特异升高。并且 由本发明制备的TIL细胞毒性活性明显高于现有技术制备的TIL细胞。
[0085] 实施例五自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒 制备
[0086] 试剂盒由如下成分组成：
[0087] A液为淋巴细胞培养基；
[0088] B液为GM-CSF和IL-4混合液；
[0089] C液为肿瘤坏死因子α溶液；
[0090] D液为白介素2溶液；
[0091] Ε液为组织消化液；
[0092] F液为淋巴细胞分离液；
[0093] G液为生理盐水；
[0094] 细胞培养板以及使用说明书；
[0095] 其中，所述使用说明书包括实施例1-4所述的方法。
[0096] 试剂盒组分分装：试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为：Α液500mL/l瓶，Β液 0· 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/Ι 支，F 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的 试剂盒。
[0097] 培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞在细胞培养板中经Y射线辐照处 理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞，使用的细胞培养板为1块6孔细胞 培养板。
【权利要求】
1. 一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，使用自 体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞和白介素2,激活扩增肿瘤浸润性Τ淋巴细 胞，使肿瘤浸润性Τ淋巴细胞得以大量增殖，培养到20天细胞数达到5 X 108以上，增殖倍 数达到1000倍以上，并具有高活性的抗肿瘤细胞毒性应答。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中以树突状细胞负载了自体肿 瘤抗原，并在树突状细胞膜上高表达的⑶80、⑶83、⑶86和⑶137L多肽，及其加工的肿瘤抗 原表位，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集树突状细胞进行纯化收集。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中肿瘤浸润性Τ淋巴细胞和自体 肿瘤抗原来源于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤组织。 新鲜自体肿瘤组织使用眼科剪剪碎成1_3的小块，所得剪碎的组织小块用〇. 25% (质量体积比）胰酶或100活性单位/mL I型胶原酶溶液以1克：0. 5mL的重量体积比 消化30分钟后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10 μ Μ细胞筛，并用 5mLlXPBS(pH= 7.4)洗涤两次，过滤后的溶液以lOOOrpm离心收集细胞沉淀，加入AM-V 培养基重悬至10mL，单细胞悬液经连续密度梯度离心分离得到肿瘤浸润性T淋巴细胞和肿 瘤细胞。 肿瘤细胞用AIM-V培养基液稀释成细胞浓度为2 X 106/mL的细胞悬液，分装于冻存管， 严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融3-5次，5000rpm离心10分钟后取上清， 加入到1. 5mL离心管中制备成自体肿瘤抗原，于-80°C储存，用于负载树突状细胞。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述自体肿瘤抗原负载的树 突状细胞与肿瘤浸润性T淋巴细胞首先共培养5天，所述树突状细胞与淋巴细胞的用量比 例为树突状细胞数：淋巴细胞数=1-10 : 1，更优选地，为树突状细胞数：淋巴细胞数= 3 : 1-5 : 1。 共培养5天后，将肿瘤浸润性T淋巴细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充 10-20mL新鲜淋巴细胞培养基（含50-500活性单位/mL白介素2)，在37°C、5% C02培养箱 中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基（含50-500活性单位/mL白介素 2)，在37°C、5% C02培养箱中继续培养2-3天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到 18-21天，使得细胞数达到5X10 8以上。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述自体肿瘤抗原负载的树 突状细胞，优选地，加入到细胞培养板中使用包括强酸、强碱和/或辐照处理，将自体肿瘤 抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞。
6. -种制备自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： A液为淋巴细胞培养基； B液为GM-CSF和IL-4混合液； C液为肿瘤坏死因子α溶液； D液为白介素2溶液； Ε液为组织消化液； F液为淋巴细胞分离液； G液为生理盐水； 细胞培养板以及使用说明书； 其中，所述使用说明书包括权利要求3-5所述的方法。 试剂盒组分分装：试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为：A液500mL/l瓶，B液0. 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/1 支，F 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分装 后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒。 经培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照 处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12 孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选 地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞 的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备的肿瘤浸润性T淋巴细胞，可用于治疗 癌症的药物的制备中的应用。
【文档编号】C12N5/0783GK104152411SQ201410387444
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】张增明, 方志明 申请人:烟台博毓生物科技有限公司