稳定共表达人源Siat7e和ST3GalIV的MDCK细胞系及用途
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体涉及工程细胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV及其用途，更具体地涉及一株工程细胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV，它的保藏号是CGMCC?NO：9330。还公开了该细胞系在降低MDCK细胞贴壁性能和提高禽流感病毒分离株的生长滴度中的应用；在抗禽流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定中的应用。
【专利说明】稳定共表达人源s i at7e和ST3Ga I IV的MDCK细胞系及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及工程细胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV及其构建方法，更具体地涉及一株工程细胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV，以及所述细胞系在降低MDCK细胞贴壁性能和提高禽流感病毒分离株的生长滴度，对于抗禽流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定以及用于MDCK的无血清全悬浮培养从而大规模生产细胞培养疫苗。
【背景技术】
[0002]禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属，表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氛酸酶(NA)分别有 16 种和 9 种[Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, ChambersTM,&Kawaoka Y (1992)Evolut1n and ecology of influenza A viruses.Microb1logical reviews56 (I): 152-179.]。其中，高致病禽流感(H5 和 H7 亚型)在世界范围内给养禽业造成了巨大的经济损失，同时给人类健康带来严重的威胁。哺乳动物中所有流感病毒均来源于水禽，但流感病毒很少发生跨种传播，这是由流感病毒和其受体的相互作用决定的。流感病毒通过其表面的血凝素(HA)与细胞表面唾液酸寡糖受体结合侵染宿主细胞。细胞受体和病毒HA受体结合位点的结构是决定流感病毒宿主特异性的主要因素。常见的流感病毒受体有两种，一种为唾液酸α 2，3半乳糖(SA α 2，3-GAL)，另一种为唾液酸α 2，3半乳糖(SAa2，6GAL)半乳糖。虽然所有的流感病毒都识别末端为唾液酸的寡糖，但不同流感病毒HA结合受体特性不同，大多数禽流感病毒优先结合SA α 2，3-GAL受体，人流感病毒则优先结合 SA α 2，6GAL 受:体[Rogers G, et al.(1983) Single amino acidsubstitut1ns in influe nza haemagglutinin change receptor binding specificity.Nature304(5921):76-78.]o
[0003]MDCK细胞是进行流感研究最常用的细胞，也是目前生产流感病毒疫苗的细胞系之一，但其表面SAa2，3Gal受体丰度较低，造成病毒滴度低。因此，提高MDCK细胞表面SAa2，3Gal受体丰度有可能改进禽流感疫苗株的繁殖滴度。α 2，3_唾液酸转移酶能将Neu5Ac转移到糖蛋白和糖脂的末端Gal，Neu5Ac和Gal之间连键是a2,3[ItoT&Kawaoka Y (2000)Host-range barrier of influenza A viruses.Veterinarymicrob1logy74(l):71-75.]。唾液酸通常与糖链N末端倒数第2个糖一主要是半乳糖(galactose, Gal)以α 2，3或α 2，6糖苷键连接。已经从人的细胞或组织中克隆并鉴定出到6个不同的α 2，3-唾液酸转移酶cDNA。遗传进化树分析表明[Tsuji S(1996)Molecular cloning and funct1nal analysis of sialyltransferases.Journal ofB1chemistryl20(l):1-13.]，该家族可以分为两个亚家族，一个亚家族为ST3GalI和ST3GalII，另一亚家族为 ST3GalIII, ST3GalIV, ST3GalV 和 ST3GalVI。
[0004]传统的流感疫苗生产都是采用鸡胚生产的方法，鸡胚来源的灭活疫苗，尽管采取了有效的纯化工艺，但是仍然存在着许多不足。不仅成本昂贵，而且鸡胚的残留物可能引起过敏反应。更主要的问题是鸡胚来源的病毒在鸡胚连续传代后常常引起HA的变异，这种变异也可能发生在病毒其它节段[Rocha EPj et al.(1993)Comparisonof1influenza A(HlNland H3N2)haemagglutinin sequences obtained directly fromclinical specimens to those of MDCK cell-and egg-grown viruses.The Journalof general virology74:2513-2518.]，结果使鸡胚来源的疫苗不能与人群中的流行毒株完全匹配。同时用鸡胚生产的方法须较长的培养周期以及繁琐的操作步骤而且很容易受污染[Tree JAj Richardson C，Fooks AR，Clegg JCj &Looby D (2001) Comparison oflarge-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the product1nof influenza virus A vaccine strains.Vaccinel9 (25): 3444-3450.]。而应用哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型显示出比较好的保护作用[Govorkova Ej Murti Gj MeignierB，De Taisne C，&Webster R(1996)African green monkey kidney (Vero) cells providean alternative host cell system for influenza A and B viruses.Journal ofvirology70(8): 5519-5524.]。MDCK细胞被认为是培养甲型和乙型流感病毒最合适的细胞系[Robertson J(1998)An overview of host cell select1n.Developments inb1logical standardizat1n98:7-11 ;discuss1n73_14.]。此细胞系具有感染后迅速产生流感病毒，在短时间内取得高滴度的特点。MDCK来源的病毒经过连续传代后，保持了抗原的稳定性[Govorkova Ej Kodihalli Sj Alymova I, Fanget B, &Webster R(1998)Growthand immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and inembryonated chicken eggs.Developments in b1logical standardizat1n98:39-51 ；discuss1n73-34.]。
[0005]传统的MDCK细胞培养多数釆用有血清贴壁培养，然而血清成份复杂，且含有对细胞有害的成分，并增加了产物分离纯化的难度；血清来源有限，价格昂贵，生产成本高；血清的质量因动物个体、血清产地、生产批号不同而产生波动，使得实验和生产难以实现标准化。MDCK细胞是贴壁依赖性的细胞，只有贴附到基质表面其才能存活、增殖和表达产物。传统的培养方法采用二维单细胞层培养[Frisch SM&Francis H(1994)Disrupt1nof epithelial cell-matrix interact1ns induces apoptosis.The Journal of cellb1logyl24(4):619-626.]，由于受到基质表面积限制，加之消化工艺复杂、生产时间长和生产成本高等困扰，难以实现MDCK细胞大规模培养和流感疫苗大规模生产。而动物细胞悬浮培养体系除了可以突破细胞生长表面限制之外，细胞培养环境更加均一，利于生产规模的放大和监控。因此，迫切的需要能适应悬浮生长的细胞来满足扩大化的工业生产，MDCK全悬浮细胞系的建立对于疫苗生产的产业化进程有着重大的意义。
[0006]已有文献报道证明人类的Siat7e基因(ST6GalNac V)与细胞的贴壁性能有关，通过比较转染了 Siat7e基因的Hela细胞与未转染的贴壁的Hela细胞，转染的细胞贴壁性能明显得到了降低，而通过SiRNA技术抑制了 Siat7e基因的表达时其贴壁性能又得到了增强[Jaluria P, Betenbaugh M, Konstantopoulos K, Frank B, &Shiloach J (2007)Applicat1n of microarrays to identify and characterize genes involved inattachment dependence in HeLa cells.Metabolic engineering9(3):241-251.]0Siat7e基因又称ST6GalNac V，属于α 2_6唾液酸转移酶家族的成员，它的作用主要在于能将唾液酸从供体CMP_Neu5Ac上传输到神经节苷支上的N-乙酰半乳糖苷上[Tsuchida A, etal.(2003)Synthesis of disialyl Lewis a(Lea)structure in colon cancer cell linesby a sialyltransferase, ST6GalNAc VI, responsible for the synthesis of a -seriesgangl1sides.Journal of B1logical Chemistry278(25):22787-22794.]。
[0007]本发明首次建立了共表达人源Siat7e基因和ST3GalIV的MDCK细胞系MDCK-hSiat7e-ST3GalIV细胞的方法。通过稳定共表达hSiat7e和ST3GalIV，可以使得人源Siat7e基因在MDCK细胞中表达，从而降低MDCK细胞的贴壁性能；同时人源ST3GalIV基因在MDCK细胞中表达，提高MDCK细胞表面SA α 2，3Gal受体丰度，进而提高禽流感疫苗株的繁殖滴度。不仅为研究MDCK的无血清全悬浮培养的应用，用于大规模生产细胞培养疫苗的应用奠定了基础，同时提高禽流感疫苗株的繁殖滴度节约了生产工艺成本。此外，MDCK-hSiat7e-ST3GalIV细胞系在抗禽流感病毒药物、疫苗株筛选以及细胞培养疫苗的生产方面都展示出较好的应用前景。
【发明内容】
[0008]本发明的第一个目的在于提供了构建MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞系的方法，所述方法包括将hSiat7e的开放阅读框cDNA和ST3GalIV的开放阅读框cDNA克隆到MDCK细胞系中，建成稳定共表达hSiat7e和ST3GalIV的MDCK细胞系。
[0009]本发明的一株hSiat7e和ST3GalIV为阳性的Madin-Darby犬肾细胞系MDCK-hSiat7e-ST3GalIV细胞克隆株于2014年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为CGMCC N0.9330。
[0010]本发明中利用人源Siat7e和ST3GalIV基因的高效真核表达质粒，转染MDCK细胞，经G418抗性和R T-PCR筛选鉴定表达阳性的单克隆细胞株，我们对得到的3株单克隆细胞株进行了 qRT-PCR的检测，得到了人源Siat7e和ST3GalIV基因同时表达量最高的单克隆细胞命名为MDCK-G5G4，获得了稳定双表达Siat7e和ST3GAL4基因的MDCK细胞系。经过流式细胞仪检测MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞中α-2，3及α 2，6唾液酸受体的含量显著高于母本MDCK细胞。表明，人源Siat7e和ST3GalV基因在MDCK_hSiat7e_ST3GalIV细胞中得到稳定表达。
[0011]本发明的第二个目的在于MDCK-hSiat7e-ST3GalIV细胞系能降低MDCK细胞贴壁性能同时提高禽流感病毒生长滴度。我们发现转染了 Siat7e基因的细胞会失去与相邻细胞形成紧密连接部的能力，同时伸展性不如母本细胞。因此降低了 MDCK细胞贴壁性能，为研究MDCK的无血清全悬浮培养的应用，用于大规模生产细胞培养疫苗的应用奠定了基础。同时HA和TCID5tl试验的结果均表明，不论是clade2.3.2.1H5N1亚型还是clade7.2H5N1亚型，均对MDCK-hSiat7e-ST3GalIV细胞系更加易感，病毒的滴度也均高于母本MDCK细胞。
[0012]本发明还公开了所述的细胞系在降低MDCK细胞贴壁性能和提高禽流感病毒分离株的生长滴度中的应用。所述的细胞系在抗禽流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定、及在MDCK的无血清全悬浮培养生产细胞培养疫苗中的应用。
[0013]本发明中将人源Siat7e和ST3GalIV基因的真核表达载体转染到MDCK细胞系中，构建成稳定共表达hSiat7e和ST3GalIV的MDCK细胞系。所述细胞中人源Siat7e基因得到了表达，降低MDCK细胞贴壁性能；同时α 2，3-唾液酸受体含量显著高于母本MDCK细胞，禽流感病毒Η5Ν1亚型在MDCK-hSiat7e-ST3GalIV细胞系中测定的滴度高于在母本MDCK细胞上测定的结果。不仅为研究MDCK的无血清全悬浮培养的应用，用于大规模生产细胞培养疫苗的应用奠定了基础，同时提高禽流感疫苗株的繁殖滴度节约了生产工艺成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:不同G418浓度下MDCK细胞生存曲线。横坐标:时间(天数)纵坐标:细胞存活率)
[0015]图2:1?0(和3株改造克隆细胞中人源1^丨&七76和ST3GalIV基因mRNA的表达情况。注:MDCK-G5G4 代表 MDCK_hSiat7e_ST3GalIV 细胞
[0016]图3:MDCK 与 MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 细胞 RT-PCR 鉴定结果
[0017](A)hSiat7e 基因的电泳结果，1:MDCK-hSiat7e_ST3GalIV 细胞，2:母本 MDCK 细胞，M:200bp Marker ; (B) ST3GalIV基因的电泳结果，1:MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞，2 --母本 MDCK 细胞，M:200bp Marker。
[0018]图4:MDCK 与 MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 细胞形态变化
[0019]注:MDCK_G5G4代表 MDCK_hSiat7e_ST3Gal IV 细胞
[0020]图5:流式细胞仪检测MDCK细胞和MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞对不同连接型特异性凝集素的反应性
[0021 ] (A) MDCK 细胞对照；MDCK-hSiat7e_ST3GalIV 细胞对照；MDCK 细胞与 SNA 结合；MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 细胞与 SNA 结合；MDCK 细胞与 MAA 结合；MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞与MAA结合
[0022](B)MDCK细胞和MDCK_hSiat7e_ST3GalIV细胞表面唾液酸受体与SNA和MAA结合的3次检测结果平均值的比较
[0023](*)表示与MDCK-SNA相比具有显著差异(ρ〈0.05)；
[0024](#)表示与MDCK MAA相比具有显著差异(ρ〈0.05)。
[0025]注:MDCK_G5G4代表 MDCK_hSiat7e_ST3Gal IV 细胞系。
[0026]图6:禽流感病毒在MDCK细胞和MDCK_hSiat7e_ST3GalIV细胞上的繁殖曲线
[0027](A)YZC3在两种细胞上的繁殖曲线；(B)rYZC3在两种细胞上的繁殖曲线；
[0028](C)wt-DT在两种细胞上的繁殖曲线；(D)rH5Nl/PR8在两种细胞上的繁殖曲线。
[0029]注:M代表 MDCK 细胞系；G5G4 代表 MDCK_hSiat7e_ST3Gal IV 细胞系。
[0030]图7:禽流感病毒毒株在母本MDCK细胞和MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞上的感染滴度(TCID50)
[0031](*)表示MDCK-hSiat7e_ST3GalIV细胞与母本MDCK细胞测定结果相比具有显著差异(Ρ〈0.05)；
[0032]注:MDCK_G5G4代表 MDCK_hSiat7e_ST3GalIV 细胞。
[0033]本发明中MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 细胞克隆株(MDCK-G5G4)于 2014 年 6 月 26 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为Madin-Darby canine kindey细胞,保藏号为 CGMCC N0.9330。
【具体实施方式】
[0034]!MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 细胞系的构建
[0035]引物
[0036]含人源Siat7e和ST3GalIV开放阅读框的真核表达质粒购自Genecopoeia公司(货号:EX-V1581-M03 和 EX-C0523-M02);人源 Siat7e 和 ST3GalIV 基因的 GenBank 登录号分别为NM_030965.1和ΝΜ_001254757.1。所用引物序列见表1。
[0037]表1.Siat7e 和 ST3GAL4 基因 RT-PCR 和 qRT-PCR 引物 Table 1.Primers fordetecting Siat7e and ST3GAL4genes by RT-PCR and qRT-PCR
[0038]
【权利要求】
1.一株稳定共表达人源Siat7e和β -半乳糖苷α 2，3_唾液酸转移酶IV的MDCK细胞系 MDCK-hSiat7e-ST3GalIV，它的保藏号是 CGMCC NO:9330。
2.权利要求1所述的细胞系在降低MDCK细胞贴壁性能和提高禽流感病毒分离株的生长滴度中的应用。
3.权利要 求1所述的细胞系在抗禽流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定中的应用。
4.以及权利要求1所述的细胞系在MDCK的无血清全悬浮培养生产细胞培养疫苗中的应用。
【文档编号】C12N7/00GK104178457SQ201410411768
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】刘秀梵, 李群辉, 刘晓文, 胡顺林, 王晓泉, 顾敏, 胡娇 申请人:扬州大学