本发明提供了用于制备包含双歧杆菌属(bifidobacterium)种类的发酵食物产品的方法。本发明进一步提供了通过这些方法制备的产品以及在这些方法中使用的接种物。
背景技术：
根据2001年联合国粮食及农业联合组织/世界卫生组织(fao/who)关于具有活乳酸细菌的奶粉的健康和营养特性的专家评议会批准的定义，益生菌是“当以足够的量施用时，为宿主带来健康益处的活微生物”。益生菌以食物产品和补充剂(包括发酵乳制品)的形式广泛使用。尽管已经鉴定出埃希氏菌属(escherichia)、肠球菌属(enterococcus)、芽孢杆菌属(bacillus)、丙酸杆菌属(propionibacterium)和酵母菌属(saccharomyces)的益生菌，但最常见的乳品益生菌为乳杆菌属(lactobacillus)或双歧杆菌属。
双歧杆菌天然存在于肠道微生物群中，并且属于最受欢迎且被充分表征的益生菌种类。在人结肠中存在的主要种类是青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、双歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsspinfantis)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)。双歧杆菌属的细菌广泛用于市售益生菌食物产品，如发酵乳制品，包括奶酪、酸奶、冷冻酸奶和发酵乳。
如上述fao/who指南中所定义的，益生菌是活细菌。此外，已经推荐每日摄入至少108至109个活细胞作为提供有益效果的最小剂量(silvaetal,j.appl.microbiol.97(2004)29-37)。因此，不仅需要确保在制备产品期间建立足够的益生菌计数，还必须在产品的保质期内保持这些计数。这些要求对双歧杆菌益生菌乳制品的生产提出了挑战，因为双歧杆菌具有差的蛋白水解活性并且在乳中生长缓慢。此外，发酵乳制品中的双歧杆菌的生存力受其对酸性ph的敏感性的限制。这与酸奶类产品特别相关，因为这种产品在储存期间的酸度可能增加，这种现象被称为“后酸化”，这可能因此影响双歧杆菌的生存力。储存期间双歧杆菌的存活还受其他因素如温度和氧气水平以及乳酸和乙酸含量的影响。最后，已显示通过与在制备发酵乳制品如酸奶中使用的典型起子培养物共培养，双歧杆菌的生长受到抑制。
在接种物中使用相对高量的双歧杆菌以及生长促进剂可以用于帮助益生菌种群的扩大和维持。本领域已知的生长促进剂包括酵母提取物、酪蛋白水解产物、氨基酸以及其他微量营养素和微量元素的使用。在专利申请pct/fr2006/001688中已经公开了半胱氨酸作为双歧杆菌种群的生长和维持促进剂，而在专利申请ep2380446中锰已经被提出作为动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)菌株chcc5445的生长刺激剂。在该ep申请中，显示锰增加了动物双歧杆菌乳酸亚种菌株chcc5445在乳中的酸化/生长，但仅仅是在乳被补充适当量的肽时。
技术实现要素：
本发明提供了一种制备发酵乳产品的方法，该方法包括发酵包含乳、动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)和/或短双歧杆菌和锰化合物的混合物。令人惊讶的是，本文公开了在不需要肽补充物的情况下添加锰化合物能够增强所述双歧杆菌亚种在乳中的生长。
本发明进一步提供了通过这些方法可获得的产品以及锰化合物在动物双歧杆菌动物亚种和/或短双歧杆菌的培养中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供用于制备发酵乳产品的接种物，所述接种物包含锰化合物和选自动物双歧杆菌动物亚种和/或短双歧杆菌的双歧杆菌。
发明详述
如本文所用，后跟4位数字的术语“cncmi-”应当被认为是指根据布达佩斯条约在国家微生物保藏中心(collectionnationaledeculturedemicroorganismes，cncm，巴黎，法国)保藏的菌株，该菌株具有对应于所述4位数字的登记编号，例如cncmi-4602或cncmi-4321，两者分别于2012年3月6日和2010年5月19日保藏在cncm。
如本文所用，术语“稳定的组合物”应被认为是指不存在沉降和/或血清分离的组合物。
如本文所用，术语“x％(w/w)”相当于“xg/100g”。
如本文所用，术语“发酵乳”应被认为是指通过至少一种乳酸细菌的酸化作用由乳得到的产品或组合物。
如本文所用，术语“可勺取”应被认为是指可以通过勺子或其他器具使用的固体或半固体。
如本文所用，术语“发酵”应被认为是指细菌、酵母或其他微生物对物质的代谢。
如本文所用，术语“cfu”或“cfu”应被认为是术语“菌落形成单位”的缩写。
如本文所用，术语“以游离形式”应被认为是指在肽、多肽或蛋白质内不通过肽键与其他氨基酸结合的形式。
如本文所用，提及细菌菌株或种类时应认为包括由其衍生的功能等同的细菌，例如但不限于突变体、变体或遗传转化的细菌。这些突变体或遗传转化的菌株可以是其中亲本菌株的一种或多种内源基因已经发生突变以例如改变它们的一些代谢特性(例如，它们发酵糖的能力、它们对酸度的抗性、它们在胃肠道中运输的存活率、它们的后酸化特性或它们的代谢产物生产)的菌株。它们也可以是由亲本菌株的遗传转化以添加一种或多种感兴趣的基因而产生的菌株，例如为了赋予所述遗传转化的菌株额外的生理学特征或允许它们表达具有人们希望通过所述菌株管理的治疗性或者预防性兴趣的蛋白质。这些突变体或遗传转化的菌株可通过用于细菌的随机或定点诱变和遗传转化的常规技术或通过被称为“基因组改组”的技术由亲本菌株获得。在本文中，提及亲本种类或菌株时，认为包含了衍生自该亲本种类或菌株的菌株、突变体和变体，例如，短语“动物双歧杆菌动物亚种”和“菌株cncmi-4602”应被理解为包括由其衍生的菌株、突变体和变体。
如本文所用，术语“酵母提取物”应被认为是指酵母细胞的可溶性化合物的浓缩物。就此而言，可以特别参考rolfsommer的文章“yeastextracts:production,propertiesandcomponents”(第9届国际酵母研讨会)，从中摘录了以下信息。
酵母提取物主要通过自溶产生，即在不添加其他酶的情况下进行细胞水解。酵母提取物或酵母自溶产物主要用于发酵工业和农业食品工业。为了生产酵母提取物而使用的主要原料由在基于糖蜜的培养基上培养的具有高浓度蛋白质的酵母(酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌株)构成，或者由来自脱苦啤酒的酵母(酿酒酵母或葡萄汁酵母(saccharomycesuvarum)菌株)构成。使用的其他原材料是酵母，如脆壁克鲁维酵母(kluyveromycesfragilis)(在乳清上发酵的)或产朊假丝酵母(candidautilis)(在来源于木材工业的富含碳水化合物的废物上或在乙醇上培养的)或特殊的面包酵母菌株，以产生含有5'-核苷酸的酵母提取物。
用于制备酵母提取物的方法是本领域已知的，自溶是最常用于生产过程的解离。在这个过程期间，酵母被它们的内源酶降解。自溶过程可通过渗透压冲击或受控温度启动，导致细胞死亡而不使内源酶(特别是蛋白酶)失活。自溶的温度、受控ph和持续时间是标准化自溶过程的决定性因素。通过相对于“标准”自溶加入盐或酶(例如蛋白酶或蛋白酶和肽酶的混合物)，可控制酵母细胞的蛋白质降解。
作为自溶的替代方法，酵母提取物可通过热解(例如通过在100℃水中煮沸酵母)、质壁分离(在低于100℃的温度下用强盐溶液处理)和机械降解(高压均质化或研磨)来生产。可溶性化合物与不溶性细胞壁分离，并用具备搅拌的蒸发器或降膜蒸发器浓缩，然后是任选的过滤、在部分真空下浓缩并快速灭菌的阶段。
本发明的方法
本发明提供了用于制备发酵乳产品的方法，其包括以下步骤：
i)提供一种混合物，其包含：
a)乳，
b)至少一种细菌种类，其包括选自由动物双歧杆菌动物亚种和短双歧杆菌组成的组的至少一种双歧杆菌，
c)锰化合物；
ii)发酵所述混合物以提供发酵乳产品。
应该理解的是，ii)的锰化合物是指存在于双歧杆菌细胞之外即不包括在双歧杆菌细胞内的锰。
优选地，混合物包含至少约30％(w/w)的乳，更优选至少约50％(w/w)的乳，甚至更优选至少约70％(w/w)的乳。优选地，所述乳是植物乳和/或动物乳，更优选大豆乳(soyamilk)、杏仁乳(almondmilk)、燕麦乳(oatmilk)、大麻乳(hempmilk)、椰子乳(coconutmilk)、稻米乳(ricemilk)、山羊乳(goatmilk)、母绵羊乳(ewe)、骆驼乳(camelmilk)、母马乳(maremilk)或牛乳(cowmilk)，并且最优选牛乳。优选地，对所述一种或多种乳进行热处理(通常为巴氏灭菌)以确保无菌性。优选地，所述热处理在制备发酵乳产品之前进行。
优选地，所述混合物包含一种或多种脱脂、部分脱脂或非脱脂乳。优选地，所述一种或多种乳可以是液体、粉末和/或浓缩的形式。在一个实施方案中，所述混合物还包含奶油(cream)。在一个实施方案中，所述混合物还包含植物和/或水果汁。在一个实施方案中，所述一种或多种乳可以用另外的乳成分或其他营养素(例如但不限于维生素、矿物质、微量元素或其它微量营养素)来富集或强化。
锰化合物可以是适用于动物或人消费并可被双歧杆菌利用的任何化合物。通常，锰化合物可以是锰盐或溶液。特别优选锰化合物为锰盐，如乙酸盐、碳酸盐、氯化物、可溶性柠檬酸盐、葡糖酸盐、正磷酸盐、二碱式磷酸盐、硫酸盐或氧化物。特别优选锰化合物是mncl2和/或mnso4。
优选地，所述混合物i)中的锰化合物的量在约1-100mg/l之间，更优选在约5-65mg/l之间。优选地，所述混合物中锰化合物的量优选为至少约1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l、55mg/l、60mg/l、65mg/l或更多。
优选地，所述混合物i)中双歧杆菌的量为106-108cfu/g，更优选106-107cfu/g。在一个实施方案中，双歧杆菌是动物双歧杆菌动物亚种，优选菌株cncmi-4602。在一个可选实施方案中，双歧杆菌是短双歧杆菌，优选菌株cncm1-4321。
特别优选，根据本发明的发酵乳是通过至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸细菌菌株的酸化作用获得的。因此，在一个实施方案中，i)的混合物还包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸细菌菌株。
适合的乳酸细菌菌株的选择在技术人员的技能范围内，并且通常是嗜热乳酸细菌。可使用的乳酸细菌的实例包括但不限于乳杆菌(lactobacilli)(例如，嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbruckei)，特别是德氏乳杆菌保加利亚亚种(l.delbruckeisupsb.bulgaricus)或乳酸亚种(lactis)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)、约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus))；链球菌(streptococci)(例如嗜热链球菌(streptococcusthermophilus))；乳球菌(lactococci)(例如乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，通常为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)或乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcuslactissubsp.cremoris))。通常可以使用多种乳酸细菌种类的混合物或联合，通常是乳杆菌属和链球菌属的混合物或联合。为了制备酸奶，这通常包括保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)(也被称为德氏乳杆菌保加利亚亚种)和嗜热链球菌，任选地具有额外的微生物，例如但不限于可以为组合物提供期望的感官品质或其他品质的益生菌种类或其他种类，例如乳酸乳球菌。
在另一个实施方案中，乳酸细菌可以进一步包含益生菌。益生菌是本领域技术人员已知的。益生菌的实例包括一些双歧杆菌和乳杆菌，如短双歧杆菌、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)、动物双歧杆菌乳酸亚种、婴儿双歧杆菌(bifidobacteriuminfantis)、长双歧杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌(lactobacilluseaselparacasei)、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsplactis)、德氏乳杆菌德氏亚种(lactobacillusdelbrueckiisubspdelbrueckii)、短乳杆菌和发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)。
因此在一个实施方案中，i)的混合物进一步包含多种乳酸细菌种类，其包括嗜热链球菌和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种的任一种或者更优选两种。在另一个实施方案中，i)的混合物进一步包含多种乳酸细菌种类，其包括嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸乳球菌。
优选地，所述混合物i)中乳酸细菌的总量为约106-108cfu/g，更优选为约106-107cfu/g。优选地，所述混合物i)中的保加利亚乳杆菌的量为约106-108cfu/g，更优选为约106-107cfu/g。优选地，所述混合物i)中的嗜热链球菌的量为约106-108cfu/g，更优选为约106-107cfu/g。
用于制备发酵乳产品如酸奶或其等同物的方法是本领域中公知的。通常，通过在适合的温度下用适合的微生物培养乳以产生ph降低，优选降低至等于或低于5、优选在约3至4.5之间、更优选在约3.5至约4.5之间的ph，来制备发酵乳产品。可通过控制微生物的发酵并在适当时使其停止(例如通过冷却)来调节ph。
乳发酵的适合温度通常为约36℃至约44℃，并且使该温度保持足够的孵育时间以产生期望的ph降低。
为了制备发酵乳产品，发酵开始时的温度通常为约36℃至约43℃，特别是约37℃至约40℃，发酵结束时的温度通常为约37℃至约44℃，特别是约38℃至约41℃。发酵时间通常为约6至约11小时。
继发酵之后，冷却发酵乳。任选地，可以进行发酵乳的中间冷却阶段以产生温度在约22℃至约4℃之间的预冷发酵乳。通常，中间冷却时间为约1小时至约4小时，特别是约1小时30分钟至约2小时。预冷发酵乳通常储存长达40小时或更少。
优选地，进行发酵乳的最终冷却阶段，以使最终冷却开始时的温度低于约22℃，并且最终冷却结束时的温度为约4℃至约10℃。然后可将冷却的产品在约1℃至约10℃的温度下储存、运输和/或分销至少约30天、至少约60天或至少约90天。
根据另一个实施方案，制备如上定义的发酵乳产品的方法任选地包括在至少20巴的压力下搅拌或进行动态平滑(dynamicsmoothing))的阶段，以获得具有期望粘度(通常为至多20mpa.s的粘度)的组合物。搅拌或动态平滑操作对组合物提供一定的通常允许粘度下降的剪切力。这样的操作是本领域技术人员已知的，并且可用适当的常规设备来操作。该阶段通常在低温下进行，例如在1℃至20℃的温度下进行。
期望不受任何理论的束缚，据信在低温下施加一定剪切力，通常通过在高压下搅拌或通过进行动态平滑，可导致组合物内形成流体凝胶，其甚至在至多20mpa.s的低粘度下提供改善的稳定性。
根据另一个实施方案，制备如上定义的发酵乳产品的方法任选地包括在发酵步骤ii)之前或之后添加中间制剂的阶段，所述中间制剂包含水果和/或谷物和/或添加剂如调味剂和/或着色剂的制剂。所述中间制剂可特别含有增稠剂(可溶性和不溶性纤维、藻酸盐、角叉菜胶、黄原胶、果胶、淀粉(特别是糊化淀粉)、结冷胶(gelangum)、纤维素及其衍生物、瓜尔胶和角豆胶、菊粉)或甜味剂(阿斯巴甜、安赛蜜、糖精、三氯蔗糖、甜蜜素)或防腐剂。调味剂的实例包括但不限于苹果、橙子、草莓、猕猴桃、可可调味剂等。着色剂的实例包括但不限于β-胡萝卜素、胭脂红、胭脂虫红(cochinealred)。而且，上述水果的制剂可包括完整的或以碎片或果冻或果酱形式的水果，使得例如可以获得水果酸奶。中间制剂还可含有植物提取物(大豆、稻米等)。
优选地，根据本发明的发酵乳产品包含多达约30％(w/w)的所述中间制剂，例如，多达约10％、15％、20％、25％(w/w)。
将产品任选地包装在含有按重量计约50g、60g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、200g、300g、320g或500g或约1oz、2oz、3oz、4oz、5oz、6oz或12oz产品的密封或可密封容器中。密封可例如用帽或盖进行。产品可以在发酵步骤ii)之前或之后包装。因此，在一个实施方案中，本发明提供了本发明的方法，其中在步骤ii)的发酵之前对混合物i进行包装)。在一个替代实施方案中，对步骤ii)的发酵乳进行包装。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的方法，其中混合物i)进一步包含含硫氨基酸和/或酵母提取物。
含硫氨基酸优选为半胱氨酸(l-半胱氨酸)或甲硫氨酸以及它们的衍生物，任选地以盐的形式。通常，含硫氨基酸可以是单水合l-半胱氨酸盐酸盐(单水合(r)-2-氨基-巯基丙酸单盐酸盐)或l-甲硫氨酸((s)-2-氨基-4-甲硫基-丁酸)。优选地，根据本发明的含硫氨基酸以还原形式使用，即还原硫氢基--sh。因此，这种含硫氨基酸的优选形式特别排除胱氨酸(涉及两个半胱氨酸经由二硫桥组合的半胱氨酸的氧化形式)。
酵母提取物可以是以下形式：液体酵母提取物(干物质：50至65％)；粘稠糊状酵母提取物(干物质：70至80％)；干酵母提取物粉末。通常适合用于发酵过程的酵母提取物可以具有75％-75％的蛋白质含量、小于0.5％的钠含量、小于5％的多糖含量、小于1％的寡糖含量和小于0.5％的脂质含量。通常，适合用于发酵的酵母提取物的蛋白质含量可以为约35-40％的游离氨基酸；10-15％的二肽、三肽和四肽(mw<600da)、40-45％的寡肽(mw为2000-3000da)；2-5％的寡肽(mw为3000-100000da)。
优选地，所述混合物i)中半胱氨酸的量为约1-100mg/l之间，更优选为5-75mg/l之间。优选地，所述混合物i)中的酵母提取物的量为高达约0.5％。
在另一个实施方案中，本发明提供了锰化合物在至少一种双歧杆菌种类的培养中的用途，所述双歧杆菌种类包括选自由动物双歧杆菌动物亚种和短双歧杆菌组成的组的至少一种双歧杆菌。通常，所用的锰化合物的量为约1-100mg/l培养基之间，更优选为约5-65mg/l之间，因此所用的锰化合物的量优选为至少约1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l、55mg/l、60mg/l、65mg/l或更多。
特别优选，锰化合物为锰盐，通常为mncl2和/或mnso4。优选地，所用的双歧杆菌的量为约106-108cfu/g培养基，更优选为106-107cfu/g。在一个实施方案中，双歧杆菌是动物双歧杆菌动物亚种，优选菌株cncmi-4602。在一个替代实施方案中，双歧杆菌是短双歧杆菌，优选菌株cncmi-4321。
本发明的接种物
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备发酵乳产品的接种物，其包含：
i)至少一种细菌物种，其包括选自由动物双歧杆菌动物亚种和短双歧杆菌组成的组的至少一种双歧杆菌，和
ii)锰化合物。
应当理解的是，ii)的锰化合物是指存在于双歧杆菌细胞外即不包括在双歧杆菌细胞内的锰。
本发明的接种物适合用于将至少一种双歧杆菌菌株直接接种乳中以产生本发明的发酵乳产品。
在一个实施方案中，i)和ii)可以作为混合物提供。在一个替代实施方案中，i)和ii)作为试剂盒提供。
接种物或其细菌优选是新鲜的、冷冻的或冻干的。接种物可以为液体、干、喷雾干燥或固体形式。特别优选，接种物为液体形式。通常将接种物以高达约500mg/l的量提供到乳品混合物。
锰化合物可以是此类适合用于动物或人消费并可被双歧杆菌利用的任何化合物。通常，锰化合物可以是锰盐或溶液。特别优选锰化合物是锰盐，如乙酸盐、碳酸盐、氯化物、可溶性柠檬酸盐、葡糖酸盐、正磷酸盐、二碱式磷酸盐、硫酸盐或氧化物。特别优选，锰化合物是mncl2和/或mnso4。
优选地，所述接种物i)中的锰化合物的量优选为至少约0.1％、1％、5％、10％或更多(w/w)。通常为约0.1至20％(w/w)之间，更优选为约1至13％(w/w)之间。
优选地，当以液体形式提供接种物时，所述接种物i)中双歧杆菌的量为约1010-1011cfu/g或约1010-1011cfu/ml。在一个实施方案中，双歧杆菌是动物双歧杆菌动物亚种，优选菌株cncmi-4602。在一个替代实施方案中，双歧杆菌是短双歧杆菌，优选菌株cncmi-4321。
在另一个实施方案中，接种物还包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸细菌菌株。适合的乳酸细菌菌株的选择在技术人员的技能范围内，并且通常是嗜热乳酸菌。可使用的乳酸细菌的实例包括但不限于乳杆菌(例如嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌、德氏乳杆菌，特别是德氏乳杆菌保加利亚亚种或乳酸亚种、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)；链球菌(例如嗜热链球菌)；乳球菌(例如乳酸乳球菌，通常为乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球菌乳脂亚种)。通常可以使用多种乳酸细菌种类的混合物或联合，通常是乳杆菌属和链球菌属的混合物或联合。为了制备酸奶，这通常包括保加利亚乳杆菌(也被称为德氏乳杆菌保加利亚亚种)和嗜热链球菌，任选地具有额外的微生物，例如但不限于可以为组合物提供期望的感官品质或其他品质的益生菌种类或其他种类，例如乳酸乳球菌。
在一个优选的实施方案中，接种物进一步包含多种乳酸细菌种类，其包括嗜热链球菌和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种的任一种或者更优选两种。在一个替代实施方案中，接种物进一步包含多种乳酸细菌种类，其包括嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸乳球菌。
在另一个实施方案中，本发明提供了进一步包含iii)含硫氨基酸和/或酵母提取物的接种物。
含硫氨基酸优选为半胱氨酸(l-半胱氨酸)或甲硫氨酸以及它们的衍生物，任选地以盐的形式。通常，含硫氨基酸可以是单水合l-半胱氨酸盐酸盐(单水合(r)-2-氨基-巯基丙酸单盐酸盐)或l-甲硫氨酸((s)-2-氨基-4-甲硫基-丁酸)。优选地，根据本发明的含硫氨基酸以还原形式使用，即还原硫氢基--sh。因此，这种含硫氨基酸的优选形式特别排除胱氨酸(涉及两个半胱氨酸经由二硫桥的组合的半胱氨酸的氧化形式)。
酵母提取物可以是以下形式：液体酵母提取物(干物质：50至65％)；粘稠糊状酵母提取物(干物质：70至80％)；干酵母提取物粉末。通常适合用于发酵过程的酵母提取物可以具有75％-75％的蛋白质含量、小于0.5％的钠含量、小于5％的多糖含量、小于1％的寡糖含量和小于0.5％的脂质含量。通常，适合用于发酵的酵母提取物的蛋白质含量可以为约35-40％的游离氨基酸；10-15％的二肽、三肽和四肽(mw<600da)、40-45％的寡肽(mw为2000-3000da)；2-5％的寡肽(mw为3000-100000da)。
试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备发酵乳产品的试剂盒(即制品)，其包括：
i)含有至少一种细菌种类的容器，所述至少一种细菌种类包括选自由动物双歧杆菌动物亚种和短双歧杆菌组成的组的至少一种双歧杆菌，和
ii)含有锰化合物的容器。
试剂盒任选地进一步包括半胱氨酸、酵母提取物和/或乳酸细菌。
因此，试剂盒任选地进一步包括iiia)含有含硫氨基酸的容器。试剂盒任选地包括iiib)含有酵母提取物的容器。
含硫氨基酸优选为半胱氨酸(l-半胱氨酸)或甲硫氨酸以及它们的衍生物，任选地以盐的形式。通常，含硫氨基酸可以是单水合l-半胱氨酸盐酸盐(单水合(r)-2-氨基-巯基丙酸单盐酸盐)或l-甲硫氨酸((s)-2-氨基-4-甲硫基-丁酸)。优选地，根据本发明的含硫氨基酸以还原形式使用，即还原硫氢基--sh。因此，这种含硫氨基酸的优选形式特别排除胱氨酸(涉及两个半胱氨酸经由二硫桥组合的半胱氨酸的氧化形式)。
酵母提取物可以是以下形式：液体酵母提取物(干物质：50至65％)；粘稠糊状酵母提取物(干物质：70至80％)；干酵母提取物粉末。通常适合用于发酵过程的酵母提取物可以具有75％-75％的蛋白质含量、小于0.5％的钠含量、小于5％的多糖含量、小于1％的寡糖含量和小于0.5％的脂质含量。通常，适合用于发酵的酵母提取物的蛋白质含量可以为约35-40％的游离氨基酸；10-15％的二肽、三肽和四肽(mw<600da)、40-45％的寡肽(mw为2000-3000da)；2-5％的寡肽(mw为3000-100000da)。
试剂盒任选地进一步包括iiic)含有至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸细菌菌株的容器。适合的乳酸细菌菌株的选择在技术人员的技能范围内，并且通常是嗜热乳酸菌。可使用的乳酸细菌的实例包括但不限于乳杆菌(例如嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌、德氏乳杆菌，特别是德氏乳杆菌保加利亚亚种或乳酸亚种、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)；链球菌(例如嗜热链球菌)；乳球菌(例如乳酸乳球菌，通常为乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球菌乳脂亚种)。通常可以使用多种乳酸细菌种类的混合物或联合，通常是乳杆菌属和链球菌属的混合物或联合。为了制备酸奶，这通常包括保加利亚乳杆菌(也被称为德氏乳杆菌保加利亚亚种)和嗜热链球菌，任选地具有额外的微生物，例如但不限于可以为组合物提供期望的感官品质或其他品质的益生菌种类或其他种类，例如乳酸乳球菌。
在一个优选的实施方案中，所述乳酸细菌包括嗜热链球菌和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种的任一种或者更优选两种。在一个替代实施方案中，所述乳酸细菌包括多种乳酸细菌种类，其包括嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳球菌。
任选地，试剂盒可以进一步包括用于制备发酵乳产品的i)和ii)的使用说明。
本发明的发酵乳产品
在另一个实施方案中，本发明提供通过本发明的方法可获得的或通过本发明的接种物制备的发酵乳产品。根据本发明的产品适合于消耗或摄取，优选通过经口方式。因此，该产品包含可食用物质或由可食用物质组成。特别优选，本发明的产品基本上不含致病或产毒物质。本发明的产品可以是药物产品、营养食物产品和/或食物产品。
优选地，发酵乳产品包含、基本包含已经经过至少相当于巴氏灭菌的热处理的乳，或由其组成，优选地，在制备发酵乳产品之前进行所述热处理。
典型地，通过以下连续步骤对乳进行巴氏灭菌：
1)使原料中的脂肪物质标准化以获得经标准化的物质的阶段，
2)富集前一阶段获得的经标准化的物质的干物质的阶段，以获得富集物质，
3)对前一阶段获得的富集物质进行预热的阶段，以获得起始物质，
4)对前一阶段获得的起始物质进行巴氏灭菌和保持的阶段，以获得经巴氏灭菌和保持的物质，
5)对前一阶段获得的经巴氏灭菌和保持的物质进行均质化的任选阶段，以获得经巴氏灭菌、保持并任选均质化的物质，
6)对前一阶段获得的经巴氏灭菌、保持并任选均质化的物质进行初始冷却的阶段，以获得已经被保持、任选均质化并冷却的经巴氏灭菌的起始物质。
如本文所用，“使脂肪物质标准化”被认为是指使起始物质中存在的脂肪的量达到预定水平的阶段。富集干物质涉及添加蛋白质和脂肪物质以改变凝乳硬度。
如本文所用，“保持”被认为是指乳的快速热杀菌(thermization)，并使其可以破坏植物微生物菌群(包括致病形式)。其通常的持续时间为4至10分钟，特别是5至8分钟，特别是大约6分钟。
如本文所用，“均质化”被认为是指乳类物质中的脂肪物质分散成小脂肪球。均质化例如在100至280巴、特别是100至250巴、特别是100至200巴、特别是大约200巴的压力下进行。这个均质化阶段是纯粹任选的。其特别是在具有0％脂肪物质的产品的生产过程中是不存在的。
优选地，发酵乳产品包含按重量计大于约0.3g/100g的游离乳酸，更优选按重量计大于约0.7g或0.6g/100g的游离乳酸。优选地，发酵乳产品包含的蛋白质含量至少等于其来源的一种或多种乳的蛋白质含量，优选为至少约2.5％，更优选为至少约3％或3.5％(w/w)。优选地，发酵乳产品具有的ph等于或低于5，优选为约3至约4.5之间，更优选为约3.5至约4.5之间。
优选地，发酵乳产品在10℃、64s-1的剪切速率下的粘度为低于200mpa.s，更优选低于100mpa.s，并且最优选低于60mpa.s。本发明的发酵乳产品优选为选自由以下组成的组的产品：酸奶、固型酸奶、搅拌型酸奶、可倾倒酸奶、酸奶饮料、冷冻酸奶、开菲尔(kefir)、酪乳(buttermilk)、奶渣(quark)、酸奶油(sourcream)、新鲜奶酪和奶酪。在一个实施方案中，本发明的发酵乳产品是可饮用发酵乳产品，更优选是发酵乳饮料，例如但不限于酸奶饮料、开菲尔等。在一个替代实施方案中，本发明的乳产品是可勺取的发酵乳产品，如固型或搅拌型酸奶或其等同物。
优选地，本发明的发酵乳产品自包装起可以在1℃至10℃的温度下储存、运输和/或分销至少约30天、至少约60天或至少约90天，并保持适合于消费。
优选地，发酵乳产品包含至少106、更优选至少107、最优选至少108菌落形成单位(cfu)的本发明的双歧杆菌细菌/克(g)本发明的产品。还优选，本发明的产品包含至少约1011、更优选至少1010并最优选至少109菌落形成单位(cfu)的本发明的双歧杆菌细菌/克(g)本发明的产品。在一个实施方案中，双歧杆菌是动物双歧杆菌动物亚种，优选菌株cncmi-4602。在一个替代实施方案中，双歧杆菌是短双歧杆菌，优选菌株cncmi-4321。
优选地，发酵乳产品是包装产品，其包含至少106、更优选至少107、最优选至少108菌落形成单位(cfu)的本发明的双歧杆菌细菌/克(g)本发明的产品，之后自包装起在从1℃至10℃的温度下储存、运输和/或分销至少约30天、至少约60天或至少约90天。
根据另一个实施方案，发酵乳产品进一步包含中间制剂，所述中间制剂包含水果和/或谷物和/或添加剂如调味剂和/或着色剂的制剂。所述中间制剂可特别含有增稠剂(可溶性和不溶性纤维、藻酸盐、角叉菜胶、黄原胶、果胶、淀粉(特别是糊化淀粉)、结冷胶、纤维素及其衍生物、瓜尔胶和角豆胶、菊粉)或甜味剂(阿斯巴甜、安赛蜜、糖精、三氯蔗糖、甜蜜素)或防腐剂。调味剂的实例是：苹果、橙子、草莓、猕猴桃、可可调味剂等。着色剂的实例是：β-胡萝卜素、胭脂红、胭脂虫红。而且，上述水果的制剂可包括完整的或以碎片或果冻或果酱形式的水果，使得例如可以获得水果酸奶。优选地，本发明的发酵乳产品包含高达约30％(w/w)的所述中间制剂，例如，多达约10％、15％、20％、25％(w/w)。
优选地，在包含按重量计约50g、60g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、200g、300g、320g或500g或约1oz、2oz、3oz、4oz、5oz、6oz或12oz产品的密封或可密封容器中提供本发明的发酵乳产品。
实施例
本实验的目的是确定锰补充物对双歧杆菌进行的乳发酵的影响。
材料和方法
通过混合112g脱脂奶粉(arlafoods)/升软化水来制备复原乳。硫酸锰(ii)一水合物(mnso4)和l-半胱氨酸盐酸盐一水合物由sigma-aldrich供应。酵母提取物由aeslaboratoire供应。在接种之前将乳培养基在115℃下高压灭菌15分钟。
提供冷冻的双歧杆菌菌株。动物双歧杆菌动物亚种cncmi-4602和短双歧杆菌cncmi-4321由danone提供。动物双歧杆菌乳酸亚种“bb12”由chr.hansen供应。在解冻后将菌株以0.01％v/v(约5x106cfu/ml)接种在复原乳培养基中。对于动物双歧杆菌动物亚种培养物，对复原乳培养基补充2g/l葡萄糖，以确保与短双歧杆菌和bb12相当的酸化时间。
发酵在37℃下进行并使用ph探针监测。
实施例1：复原乳培养基的锰补充
使用上文提供的动物双歧杆菌、短双歧杆菌或bb12制备和发酵复原乳。据观察，对于动物双歧杆菌动物亚种和短双歧杆菌，向复原乳添加mnso4减少了达到ph5.5的时间，但是对于bb12则没有减少。在5mg/l和65mg/l的水平下，对于动物双歧杆菌动物亚种，观察到达到ph5.5的时间减少了7％，相反，对于bb12，在锰补充的两个水平上均观察到达到ph5.5的时间增加了超过10％。对于短双歧杆菌，仅在65mg/l的水平下测试锰补充，达到ph5.5的时间略微减少。
表1：对于所选择的双歧杆菌添加mnso4减少达到ph5.5的时间
实施例2：用mnso4和半胱氨酸一起补充复原乳培养基。
使用上文提供的动物双歧杆菌动物亚种、短双歧杆菌或bb12制备和发酵复原乳。如同在实施例1中，对于动物双歧杆菌动物亚种和短双歧杆菌，观察到向复原乳添加mnso4和半胱氨酸减少了达到ph5.5的时间，但是对于bb12则没有减少。
表2：对于所选择的双歧杆菌一起添加mnso4和半胱氨酸减少达到ph5.5的时间
实施例3：用酵母补充复原乳培养基。
对于动物双歧杆菌动物亚种，添加酵母提取物不仅在mnso4和半胱氨酸一起存在的情况下使用时而且在作为唯一的补充剂添加到复原乳时均进一步减少了达到ph5.5的时间。