本发明涉及一种以啤酒糟为原料二次混菌发酵生产高蛋白饲料的方法，属于饲料加工领域。
背景技术：
近年来，国内外普遍采用烘干的方法来保存啤酒糟，虽然有效解决了啤酒糟容易腐败的问题，减少环境污染，同时便于储运。但由于啤酒糟中的粗纤维含量过高，动物适口性差，使用面不大、市场价格不高，加上设备投入、人工及能耗等因素，出现了卖鲜糟比卖干糟还赚钱的情况，有些啤酒公司出现烘干设备闲置。
啤酒糟直接作为饲料，一直是研究的热点问题。邓启华[1]对啤酒糟生产猪饲料关键技术进行了研究，采用预处理技术、酶解和益生菌发酵技术降解啤酒糟的纤维含量，改善蛋白品质，提高啤酒糟的饲喂价值。以糖糟和啤酒糟为原料，接入酵母菌[2]，多菌株优化组合如枯草芽孢杆菌，热带假丝酵母固态法发酵生产高蛋白饲料[3-6]，且含有多种消化酶。利用响应面分析方法，对优化啤酒糟固态发酵制备蛋白饲料的条件进行了进一步的研究[7]。孙丹凤[8]等对发酵啤酒糟饲料进行猪、鸡等饲喂试验，结果表明效果良好。
目前，未见有啤酒糟二次混菌发酵技术生产高蛋白啤酒糟饲料的相关报道。
参考文献：
[1]邓启华.啤酒糟生产猪饲料关键技术研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2010
[2]郭建华,窦少华,邱然,等.利用糖糟和啤酒糟生产蛋白饲料的研究[J].饲料工业,2005,26(1):4-5
[3]蔡俊.啤酒糟发酵生产蛋白饲料的研究[J].粮食与饲料工业,2001,(3):30-31
[4]陶敏,王维嘉,蔡俊. 啤酒糟发酵产高蛋白饲料菌种的配伍[J].饲料工业.2011,32(11):58-61
[5]王颖,马海乐.混菌固态发酵啤酒糟生产蛋白饲料的研究[J].饲料工业,2010,31(17):26-28
[6]王成涛,朱桂华,马玉君,等.糟渣发酵生产饲料蛋白的发酵条件的优化及效果[J].黑龙江八一农垦大学学报,2002,14(3):72-75
[7]安晓萍,齐景伟,乌兰,等.响应面优化啤酒糟固态发酵制备蛋白饲料的条件研究[J].粮食与饲料工业.2013.(2):40-43
[8]孙丹凤,王友炜,王聪,等.发酵啤酒糟营养价值评定及对肉鸡生长性能的影响[J].饲料工业,2009,30(17):26-28。
技术实现要素：
目前啤酒糟发酵使作固态混菌发酵中，菌种一次添加，对产品发酵势必造成微生物间的相互影响，为提高啤酒糟的使用效率，本发明通过选使用纤维素分解能力强的霉菌分解纤维素，为后续发酵提供糖源，再添加酵母菌和枯草芽孢杆菌，以霉菌分解纤维素产生的糖源进行进一步发酵，达到充分利用纤维素，提高蛋白质产量的目的的一种以啤酒糟为原料二次混菌发酵生产高蛋白饲料的方法。
本发明提供的技术方案是：一种以啤酒糟为原料二次混菌发酵生产高蛋白饲料的方法，包括以下制备步骤：
（1）以重量计，把啤酒糟与麸皮以6-10:2的比例配置，再加入1-3倍的水，混匀后进行灭菌；
（2）灭菌后，进行混菌接种进行第一次发酵，混菌接种量为18-22%，所述混菌为黑曲霉和木霉，在28-32℃下培养2-4天；
（3）第一次发酵结束后，再添加硫酸铵3%-7%，尿素1-3%，混菌接种后进行第二次发酵，所述混菌为啤酒酵母和枯草芽孢杆菌，或饲料酵母和枯草芽孢杆菌，接种量为15%-18%，在温度30-35℃下培养3-5天，即可得到高蛋白饲料。
所述的方法，优选地，步骤（2）中，黑曲霉和木霉的比例为6:4；啤酒酵母与枯草芽孢杆菌的比例或饲料酵母与枯草芽孢杆菌的比例为5:1；步骤（1）中，灭菌条件为115℃，15min。
所述的方法，优选地，步骤（1）中，啤酒糟与麸皮以8:2的比例配置，再加入2倍的水；步骤（2）中，混菌接种量为18-22%，在30℃下培养3天；步骤（3）中，添加硫酸铵3.46%，尿素2%，啤酒酵母和枯草芽孢杆菌的接种量为16.26%，或饲料酵母和枯草芽孢杆菌接种量为16.51%，在温度35℃下培养4天。
本发明具有以下有益效果：
本发明以啤酒糟为原料，利用黑曲霉和康氏木霉进行第一次发酵，在30℃下培养3天时，纤维素酶活为731.603nkat。以第一次发酵的啤酒糟为原料，添啤酒酵母与枯草芽孢杆菌组合进行第二次混菌发酵，添加硫酸铵3.46%，理论粗蛋白质含量38.11%；添加饲料酵母与枯草芽孢杆菌组合进行第二次混菌发酵时，理论粗蛋白质含量43.38%。本发明方法在进行发酵的过程中，分两步进行添加菌种，来分步达到所需目的，首先降低培养基中粗纤维的含量，再提高培养基中蛋白质的含量，可以更好的生产出所需的高蛋白饲料。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例一：
请参见图1，菌体的初筛：确定菌种是否能利用啤酒糟的营养成分生长。
250mL三角瓶中装入经处理的啤酒糟和麸皮共30g（采取啤酒槽与麸皮的比例为8:2），作为发酵培养基。
在250mL的烧杯中加入发酵培养基30g，加入0.5倍蒸馏水，在115℃灭菌15min后，接入20%的种子液（混菌为等比例分配），在32℃培养温度下培养3天。
当所使用的发酵培养条件一致时，所接入的菌种分别为黑曲霉、康氏木霉、曲霉、青霉、康氏木霉、黑曲霉和康氏木霉、黑曲霉和青霉、康氏木霉和曲霉、康氏木霉和青霉、曲霉和青霉、黑曲霉和康氏木霉和曲霉、黑曲霉和康氏木霉和青霉、康氏木霉和曲霉和青霉、黑曲霉和曲霉和青霉，分别计算接入不同菌种，培养基产生的纤维素酶活的量。
选择的合适的菌种，进行进一步配伍实验。
优良啤酒糟发酵菌株配伍与优化：以啤酒糟为主要培养基，以纤维素酶总活力为指标，选择具有良好纤维素酶高产霉菌菌株，并通过配伍成优良菌群；以蛋白质含量为指标，优选优良啤酒糟酵母菌株，并与芽孢杆菌优化配伍成优良菌群。
对两种不同酵母菌分别进行响应面实验，得出最佳发酵菌种。
一次混菌发酵条件选择与优化：以还原糖糖化率为考察指标，通过纤维菌接种量、发酵时间、发酵温度、加水量进行L9(34)正交实验设计，确定最佳工艺条件。
在单一菌发酵中，以发酵时间、含水量、接种量和温度为试验因子，进行四因素三水平的正交优化实验。以酒糟发酵过程中产品粗纤维含量为考察指标。
为考察混菌发酵效果，以发酵时间、含水量、菌种比、接种量和温度为试验因子，进行五因素四水平的正交优化试验。以酒糟发酵过程中产品粗纤维含量为考察指标。
通过SPSS软件（IBM SPSS Statistics 22）对正交试验结果进行分析，得出最佳工艺条件。
二次混菌发酵条件选择与优化：根据啤酒糟的营养成分的确定影响因子，进行Plackett-Burman 试验设计。利用响应面法中的Box-Behnken设计对重要因子进行进一步的优化，并进行培养条件的验证。
Plackett-Burman设计：通过前期试验，选取影响发酵产物粗蛋白质含量的可能因素，包括硫酸铵、尿素、接种量、菌种比、温度、时间。为了对这6个因素进行全面考察，选用了Plackett-Burman设计，每个因素取2个水平，粗蛋白质含量作为响应值Y。考察各因素的主效应和交互作用，确定重要影响因素。
从实验结果中得到，影响粗蛋白质含量的主要因子，再以这3个因素进入下一步的响应面分析试验。响应面分析：根据Box-Behnken的中心组合设计原理，对Plackett-Burman试验设计筛选的3个主要影响因素，进行Box-Behnken试验设计。根据Box-Behnken中心组合设计原理，以粗蛋白质含量为响应值，设计3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验。最后通过 Minitab软件处理，得到最佳工艺。
以啤酒糟（燕京啤酒（衡阳）有限公司提供）和麸皮按重量比8:2混合后为原料（培养基），利用黑曲霉（Aspergillus niger）（湖南农业大学生科院实验室提供）和康氏木霉（T.koningi AS3.2774）（湖南农业大学生科院实验室提供）进行一次发酵，按重量计，发酵时加水量为啤酒糟和麸皮的总重量的2倍，黑曲霉：木霉为6:4的混菌接种量为20%（接种量为培养基体积的20%），在30℃下培养3天时，纤维素酶活为731.603nkat。以第一次发酵的啤酒糟为原料，并添加硫酸铵3.46%（添加量为培养基体积的3.46%），尿素2%（添加量为培养基体积的2%），啤酒酵母（Sac-charomyces cerevisiae）（湖南农业大学生科院实验室提供）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（湖南农业大学生科院实验室提供）组合进行第二次混菌发酵，最佳条件为温度35℃，培养4天，接种量16.26%（接种量为培养基体积的16.26%），啤酒酵母比枯草芽孢杆菌的比例为5:1，理论粗蛋白质含量38.11%（凯氏定氮法）。
实施例二：
以啤酒糟（燕京啤酒（衡阳）有限公司提供）和麸皮按重量比8:2混合后为原料（培养基），利用黑曲霉（Aspergillus niger）和康氏木霉（T.koningi）进行一次发酵，按重量计，发酵时加水量为啤酒糟的2倍，黑曲霉：木霉为6:4的混菌接种20%（接种量为培养基体积的20%），在30℃下培养3天时，纤维素酶活为731.603nkat。以第一次发酵的啤酒糟为原料，添加硫酸铵5.00%，尿素2%，饲料酵母（AS2.1180）（湖南湖南轻工研究院提供）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）组合进行第二次混菌发酵时，最佳条件为温度33.73℃，培养4天，接种量16.51%，饲料酵母比枯草芽孢杆菌的比例为5:1，理论粗蛋白质含量43.38%（凯氏定氮法）。