本发明属于畜牧业动物营养技术研究领域，涉及一种以丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌为饲料添加剂的饲料配方，更具体的说是一种提高断奶仔猪肠道上皮细胞因子表达，促进肠道黏膜发育和调节血清炎症因子含量等方面的应用。
背景技术：
保障仔猪健康、提高其抗病力等方面一直是近年来猪营养与饲料研究领域的热点和难点，饲料添加剂的研究正在向着无残留、无耐药性和对人类健康和环境无危害的方向发展。饲料添加剂丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌因为其特有的多能性、益生作用及不易产生耐药性等优点在动物生产中被广泛应用。
嗜酸乳杆菌主要存在小肠中，释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗生素，抑制肠道不良微生物饲喂增殖，但是益菌作用比较弱。嗜酸乳杆菌和双歧杆菌联用可以迅速使肠道内的菌群恢复平衡，抑制腐败菌繁殖。而丁酸梭菌可以维持或恢复宿主肠道优势菌群，促进肠道乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的生长繁殖，并抑制沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌的生长。
抗生素类生长促进剂是通过干扰细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制细菌的繁殖，但其在饲料工业中的大量使用导致诸多问题出现，如病原菌产生耐药性、动物免疫机能下降、体内菌群失调、畜禽产品中的药物残留等。而丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌作为外源益生菌，在维持肠上皮的完整性、促进动物肠道发育方面发挥着重要作用。丁酸梭菌具有耐热、耐酸和耐多种抗生素等生物学特性，嗜酸乳杆菌适合在动物肠道生存，对肠道致病菌产生拮抗作用，二者可共同调节肠道微生态平衡、产生益生物质、提高机体免疫力及促进动物生长，同时具有无污染、无有害残留等特点，逐渐成为热门的抗生素替代品之一。目前国内外研究结果表明：在动物日粮中单独添加一定量丁酸梭菌或单独添加一定量的嗜酸乳杆菌可以增加胃肠道有益菌数量，改善小肠形态，提高动物免疫力，从而提高动物的抗病力。查阅近年来文献表明：断奶仔猪营养一直是猪营养领域的研究热点和难点，仔猪抗病力这一领域的创新性有待于提高。通过丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌调节机体的肠上皮细胞因子表达、肠道形态发育等功能，我们研究了一种断奶仔猪抗病饲粮组方，以此来改善仔猪肠道发育和抗病力的营养调控，在一定程度上提高养殖业的经济效益。
技术实现要素：
本发明的一个目的是公开了一种断奶仔猪抗病饲粮的组方及应用。
本发明的另一个目的是公开了所配制的饲粮对断奶仔猪肠上皮细胞NLRPs表达、肠道黏膜发育和血清炎症因子含量的应用效果。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容
一种调节断奶仔猪抗病力的饲粮，其特征在于在饲料原料中使用丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌饲料添加剂，进行合理配制日粮，由下述重量份数的原料组成：
玉米58-63豆粕16-24全脂奶粉2-5
鱼粉4-9小麦麸1-5葡萄糖1-3
酸化剂0.1-0.5 磷酸氢钙0.5-1.5石粉0.5-1.1
食盐0.1-0.5 L-赖氨酸盐酸盐0.3-0.7DL-蛋氨酸0.2-0.7
苏氨酸0.2-0.6 仔猪预混料1-4
丁酸梭菌添加剂0.001-0.01（冻干粉中活菌含量为1×109CFU/g，饲粮中浓度为1×104~1×105CFU/g）
嗜酸乳杆菌添加剂0.001-0.01（冻干粉中活菌含量为1×109CFU/g，饲粮中浓度为1×104~1×105CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明所述酸化剂指的是上海美农饲料有限公司产品，主要成分是乳酸、正磷酸、柠檬酸、富马酸、甲酸。
本发明所述的断奶仔猪配合饲料的制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
本发明一个优选的配方（重量份数）：
玉米60豆粕19全脂奶粉4
鱼粉6小麦麸2.5葡萄糖3
酸化剂0.4 磷酸氢钙1.2石粉0.5
食盐0.3 L-赖氨酸盐酸盐0.4 DL-蛋氨酸0.4
苏氨酸0.3 仔猪预混料2
丁酸梭菌添加剂0.001（饲粮中丁酸梭菌浓度为1 × 104 CFU/g）
嗜酸乳杆菌添加剂0.001（饲粮中嗜酸乳杆菌浓度为1 × 104 CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明另一个优选的配方（重量份数）：：
玉米59.5豆粕18.5全脂奶粉3.48
鱼粉6小麦麸5葡萄糖3
酸化剂0.4 磷酸氢钙1.3石粉0.7
食盐0.4L赖氨酸盐酸盐0.3 DL-蛋氨酸0.2
苏氨酸0.2 仔猪预混料1
丁酸梭菌添加剂0.01（饲粮中丁酸梭菌浓度为1 × 105 CFU/g）
嗜酸乳杆菌添加剂0.01（饲粮中嗜酸乳杆菌浓度为1 × 105 CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明在断奶仔猪饲料中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌能显著提高空肠NLRPs的相对表达，显著提高空肠中段和回肠各肠段绒毛高度，显著降低十二指肠、空肠中段和回肠隐窝深度；降低了血清中IL-1β因子含量，提高了血清中IL-10因子含量，从而提高仔猪抗病力。
本发明的断奶仔猪抗病饲粮组方试验结果表明：
（1）日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌，显著提高了空肠中NLRPs的表达，表明该饲料配方能有效增加有益菌的数量，提高肠道黏膜屏障功能；
（2）日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌显著提高了十二指肠、空肠中段和回肠各肠段绒毛高度，显著降低了十二指肠和回肠隐窝深度，并提高了绒毛高度与隐窝深度的比值，表明这种饲料配方能促进断奶仔猪肠道健康发育，利于营养物质的吸收。
（3）日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌降低了血清中促炎因子IL-1β的含量，提高了抗炎因子IL-10的含量。
为了更进一步说明本发明的积极效果，提供如下的试验：
1．试验动物及分组
采用单因子试验设计，选取体重6.97 ± 0.48 kg的健康“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪48头，随机分为2个处理，每个处理分为4个重复，每个重复6头猪。每个处理组分别饲喂不同日粮：饲喂基础日粮(NC)、饲喂基础日粮+0.01%丁酸梭菌（浓度为1 × 105 CFU/g）+0.01%嗜酸乳杆菌（浓度为1 × 105 CFU/g）（试验组）。丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌为市售产品。
2．基础饲粮配方及营养水平
根据NRC（1998）配制猪基础日粮配方及营养水平如表1所示；
表1 基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）
a 每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
b 根据NRC（1998）饲料成分表计算。
3．试验规程
试验在一个商品万头猪场进行，试验期28天。饲喂、管理、免疫按猪场规定程序进行。饲喂4周后，从每个处理的每个重复组中随机选取3头断奶仔猪采血、屠宰，取十二指肠、空肠中段和回肠，进行肠上皮细胞NLRPs表达分析、并制作组织切片分析肠绒毛高度和隐窝深度的生长情况。整个试验过程中观察仔猪的健康状况，记录死、淘仔猪以及腹泻、用药情况。
4．测定指标
空肠上皮细胞NLRPs表达和血清指标测定：试验结束后，从每个重复中随机选3头仔猪，用真空促凝管进行采血，前腔静脉采血后处死，无菌条件下迅速打开腹腔，分离并采集空肠中段5 cm左右肠管，用PBS冲洗后分装于冻存管中于-80 ℃保存，用于NLRP3、NLRP6和NLRP12的测定。采用ELISA试剂盒测定血清中促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-10的含量；
小肠黏膜形态的测定：于十二指肠、空肠中段和回肠切取1cm肠断，用生理盐水冲洗后迅速放入预先配制好的福尔马林溶液中固定。按常规方法制作石蜡切片，苏木精-伊红染色，测量绒毛高度和隐窝深度。
5．统计分析
采用SAS统计软件下的Compare Means模块中的One-Way ANOVA进行方差分析，并采用Duncan’s多重比较进行组间差异显著性检验，P<0.05为差异显著。
本发明公开的断奶仔猪抗病饲粮组方在断奶仔猪饲料中的应用效果，主要包括：
（1）肠道上皮细胞NLRPs的表达：
由表2可知，试验组极显著（P <0.01）提高了空肠上皮细胞NLRP12的相对表达，显著（P<0.05）提高了NLRP3和NLRP6的相对表达；
表2 对空肠上皮细胞中NLRPs表达的影响
注：同行肩注小写字母不同表示差异显著P <0.05，肩注大写字母不同表示差异极显著P <0.01，无肩注字母表示差异不显著P >0.05。**表示P <0.01。下表同。
（2）小肠发育：
由表3可知，绒毛高度：试验组的十二指肠和空肠绒毛高度极显著高于对照组（P ＜0.01），试验组回肠绒毛高度比对照组提高了6.84%；隐窝深度：试验组的十二指肠和空肠隐窝深度均显著低于对照组（P ＜0.05），试验组回肠隐窝深度比对照组降低了16.67%；绒毛高度/隐窝深度：试验组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比极显著（P ＜0.01）高于对照组、试验组空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比显著（P ＜0.05）高于对照组；
表3 对仔猪小肠发育的影响
注：同行肩注小写字母不同表示差异显著P <0.05，肩注大写字母不同表示差异极显著P <0.01，无肩注字母表示差异不显著P >0.05。**表示P <0.01。
（3）血清因子含量：
由表4可知，试验组的促炎因子IL-1β含量降低了5.95%，抗炎因子IL-10含量提高了21.78%；
表4 对仔猪血清细胞因子含量的影响
试验结果表明：
（1）日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌，极显著（P <0.01）提高了空肠上皮细胞NLRP12的相对表达，显著（P <0.05）提高了NLRP3和NLRP6的相对表达，表明该饲粮组方能有效增加肠道黏膜屏障功能。
（2）日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌，极显著提高了十二指肠和空肠中段绒毛高度，显著降低了十二指肠和空肠中段隐窝深度。并且试验组中的绒毛高度与隐窝深度的比值比对照组均显著提高，表明该饲粮组方能促进断奶仔猪肠道健康发育，利于营养物质的吸收。
（3）日粮中添加丁酸梭菌（浓度为1 × 105 CFU/g）和嗜酸乳杆菌（浓度为1 × 105CFU/g）（菌浓度比1:1）降低了血清中促炎因子IL-1β含量，提高了抗炎因子IL-10含量，表明该饲粮组方能有效帮助益生菌顺利定居肠道，增强机体免疫力。
本发明对以丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌为饲料添加剂的饲料配方进行了安全性和生长性能实验，其方法如下：
（1）步骤：
材料和方法：选择6.59±0.61 kg断奶的“杜×长×大”仔猪168头，临床健康、发育正常，按随机区组设计分为7个处理，每个处理4个重复，每个重复6头仔猪，饲养于专用代谢笼中，试验期4周。7个处理组分别饲喂：
1）对照组：基础饲粮（不含菌）；
2）试验2组：基础饲粮＋0.001丁酸梭菌添加剂（浓度为1 × 104 CFU/g）；
3）试验3组：基础饲粮＋0.001嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 104 CFU/g）；
4）试验4组：基础饲粮＋0.0005丁酸梭菌添加剂（浓度为0.5 × 104 CFU/g）＋0.0005嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为0.5 × 104 CFU/g）；
5）试验5组：基础饲粮＋0.001丁酸梭菌添加剂（浓度为1 × 104 CFU/g）＋嗜酸乳杆菌添加剂0.001（浓度为1 × 104 CFU/g）；
6）试验6组：基础饲粮＋0.01丁酸梭菌添加剂（浓度为1 × 105 CFU/g）＋0.01嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 105 CFU/g）；
7）试验7组：基础饲粮＋0.015丁酸梭菌添加剂（浓度为1.5 × 105 CFU/g）＋0.015嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1.5 × 105 CFU/g）。试验期内随时观察中毒表现及死亡情况。
（2）饲喂的仔猪基础饲料原料组成：
包括玉米62.66、豆粕19、全脂奶粉2.7、鱼粉6、小麦麸3、葡萄糖2、酸化剂0.3、磷酸氢钙0.6、石粉0.6、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.3、DL-蛋氨酸0.3、苏氨酸0.2、仔猪预混料2。
结果：给断奶仔猪饲喂上述试验饲粮，连续饲喂28天，未见明显中毒现象，观察期内无死亡，随机尸检第7组中一头仔猪，各主要脏器未见明显异常。生长性能结果见表5；
表5不同剂量的丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响
注：同行之间肩注，无字母或小写字母相同表示差异不显著（P＞0.05），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下表同。
结论：
1)由此可知，与对照组相比，除试验2和试验3组外，试验组均显著提高了仔猪平均日增重（ADG）（P＜0.05），但试验2组和试验3组的ADG和ADFI均比对照组有所提高，F/G均比对照组有所下降，因此，添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌是能促进生长性能的，但是两菌单独在饲粮中为浓度为1 × 104 CFU/g时效果不显著（P＞0.05）；
2)组合总添加量与各菌单独添加量相同，试验4组两菌的组合ADG和ADFI显著（P＜0.05）优于试验2组和试验3组，F/G低于试验2组和试验3组，由此表明，组合效果优于单独添加，但饲粮中浓度分别为0.5 × 104 CFU/g时还不是最优组合；
3)试验5组、试验6组、试验7组的F/G均显著高于试验4组（P＜0.05），试验5组和试验7组生长性能差异不显著（P＞0.05），因此在饲粮中丁酸梭菌浓度为1 × 104 CFU/g~1.5 × 105 CFU/g＋饲粮中嗜酸乳杆菌浓度为1 × 104 CFU/g~1.5 × 105 CFU/g时均可显著提高仔猪生长性能；
4)试验6组：基础饲粮＋0.01丁酸梭菌添加剂（浓度为1 × 105 CFU/g）＋0.01嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 105 CFU/g）的料重比（F/G）显著（P＜0.05）低于其它各组，因此，综合考虑饲喂效果和成本因素，此组为最佳添加量。
⑤因此，此组方给出的丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌添加量范围均为0.001~0.01（饲粮中浓度为1 × 104 CFU/g~1 × 105 CFU/g）。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作一步说明，但不作为本发明的限制。本发明的实施例中所述的重量份数原料指的是克、公斤或吨，可根据生产实际的需要加以调整。本发明所用到的各种原料例如：玉米、豆粕、全脂奶粉、小麦麸、磷酸氢钙、石粉、食盐、L-赖氨酸盐酸盐、DL-蛋氨酸、苏氨酸、酸化剂、预混料、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌等对外均有售；其中下面的产品均有市售：
酸化剂指的是上海美农饲料有限公司产品；
全脂奶粉指的是湖南百宜饲料科技有限公司；
1-4%仔猪预混料和豆粕购买于正大预混料（天津）有限公司；
丁酸梭菌添加剂指的是郑州金百合生物工程有限公司产品；
嗜酸乳杆菌添加剂指的是武汉远城科技发展有限公司产品；
玉米指的是天津玉米世纪科技有限公司产品；
鱼粉指的是进口秘鲁鱼粉；
小麦麸和葡萄糖指的是天津市鼎圣饲料有限公司产品。
实施例1
断奶仔猪的配合饲料原料组成：
包括玉米61.59、豆粕20、全脂奶粉2.5、鱼粉6、小麦麸2、葡萄糖3、酸化剂0.4、磷酸氢钙0.7、石粉0.7、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.4、DL-蛋氨酸0.2、苏氨酸0.2、仔猪预混料2、丁酸梭菌0.01（饲粮中浓度为1 × 105 CFU/g）、嗜酸乳杆菌0.001（饲粮中浓度为1 × 104 CFU/g）。其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例2
断奶仔猪的抗病配合饲料原料组成：
包括玉米60、豆粕19.49、全脂奶粉4、鱼粉6、小麦麸3.9、葡萄糖3、酸化剂0.3、磷酸氢钙0.7、石粉0.6、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.3、DL-蛋氨酸0.2、苏氨酸0.2、仔猪预混料1、丁酸梭菌0.001（饲粮中浓度为1×104CFU/g）、嗜酸乳杆菌0.01（饲粮中浓度为1×105CFU/g）。
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例3
一种断奶仔猪的抗病配合饲料由下述重量份数的原料组成：
包括玉米58、豆粕21、全脂奶粉3.08、鱼粉5、小麦麸4、葡萄糖3、酸化剂0.4、磷酸氢钙0.7、石粉0.7、食盐0.4、L-赖氨酸盐酸盐0.3、DL-蛋氨酸0.2、苏氨酸0.2、仔猪预混料3、丁酸梭菌0.01（饲粮中浓度为1×105CFU/g）、嗜酸乳杆菌0.01（饲粮中浓度为1×105CFU/g）。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例4
采用断奶仔猪的配合饲料饲喂断奶仔猪的方法：
此系列配方适用断奶仔猪，适用期为30~45天，根据情况让仔猪自由采食即可，必须提供充足的饮水，其他按正常的饲养管理进行。
实施例5
比较试验
常规的仔猪饲料：
方法：配制玉米-豆粕型仔猪饲粮，不添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌。选择4头7±0.52 kg仔猪，试验期28天。试验结束后对4头仔猪进行屠宰，取十二指肠、空肠和回肠。
步骤：采用HE染色，测定十二指肠、空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度。
结果：三个肠段绒毛高度分别为314μm、325μm、226μm；隐窝深度分别为399μm、287μm、193μm。
日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌后饲料：
方法：配制玉米-豆粕型仔猪日粮，添加0.01%丁酸梭菌和0.01%嗜酸乳杆菌。选择4头7.02±0.62kg仔猪，试验期28天。试验结束后对4头仔猪进行屠宰，取十二指肠、空肠和回肠。
步骤：采用HE染色，测定十二指肠、空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度。
结果：十二指肠、空肠和回肠绒毛高度分别为384μm、358μm、279μm；隐窝深度分别为286μm、241μm、172μm。
结论：日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌能提高仔猪小肠绒毛长度、降低隐窝深度。通过比较试验说明：日粮中添加丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌能调节仔猪肠道发育，提高仔猪抗病力。