本发明属于生物技术领域，具体涉及一种低温等离子体联合超声处理的非热杀菌方法，有效抑制亚致死金黄色葡萄球菌产生。
背景技术：
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性致病菌，直径为0.8-1.0μm，无芽孢，无荚膜，呈现球状，通常多个细菌细胞排列成单、双、短链葡萄状串。金黄色葡萄球菌广泛地存在于多种食品中，如奶和奶制品、肉和肉制品、蛋和蛋制品、沙拉以及鱼等，能够产生多种不同的肠毒素而引起金黄色葡萄球菌感染。金黄色葡萄球菌肠毒素一般会导致恶心、呕吐，部分还会造成腹泻和腹部绞痛。近年来，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已经引起了民众和政府组织的密切关注，成为了全球性的公共卫生问题。至今为止，至少有30个国家报道过金黄色葡萄球菌中毒事件。在中国，根据2015年国家卫生和计划生育委员会发布的《国家卫生计生委办公厅关于2015年全国食物中毒事件情况的通报》中表明在57起微生物性食物中毒事件中，因金黄色葡萄球菌引起的中毒事件占第四位。
技术实现要素：
本发明提供一种低温等离子体联合超声处理的非热杀菌方法，用于处理金黄色葡萄球菌，能有效抑制亚致死金黄色葡萄球菌产生。
一种低温等离子体联合超声处理的非热杀菌方法，包括如下步骤：
将金黄色葡萄球菌先经介质阻挡放电低温等离子体处理，然后再进行超声处理；介质阻挡放电低温等离子体处理条件为：处理频率为10～12khz,处理气隙间距为5～6mm，处理功率为40～45w，处理时间为5～6min，处理温度为室温；超声处理条件为：处理频率为20～22khz,处理功率为200～220w，处理时间为10～20min，处理温度为室温。
等离子体和超声波作为新型的非热物理杀菌技术，因其在食品保鲜中能够有效地抑制微生物的生长而引起越来越多研究者的注意。等离子体产生的紫外线、带电粒子和活性成分能作用于微生物细胞产生一系列的复杂反应，超声波则主要是通过空化效应起到杀灭微生物的作用，包括产生声流、微射流、局部热点、冲击波等物理作用以及自由基、过氧化氢等化学作用。因金黄色葡萄球菌具有较厚且紧密的肽聚糖层，又为球状，因此对物理杀菌技术具有一定的抗性。通过研究发现等离子体和超声波结合对金黄色葡萄球菌的协同作用效果，且超声空化效应的微射流能够将等离子体产生的活性成分注入细胞内，从而有效抑制亚致死金黄色葡萄球菌，以此为二者结合在食品保鲜除菌上的应用提供一定的理论依据。
优选地，介质阻挡放电低温等离子体处理条件为：处理频率为10khz,处理气隙间距为5mm，处理功率为40w，处理时间为5min，处理温度为25℃。
优选地，超声处理条件为：处理频率为20khz,处理功率为200w，处理时间为10min，处理温度为25℃。
或优选地，超声处理条件为：处理频率为20khz,处理功率为200w，处理时间为20min，处理温度为25℃。
最优选地，介质阻挡放电低温等离子体处理条件为：处理频率为10khz,处理气隙间距为5mm，处理功率为40w，处理时间为5min，处理温度为25℃；超声处理条件为：处理频率为20khz,处理功率为200w，处理时间为20min，处理温度为25℃。
低温等离子体处理为将金黄色葡萄球菌悬浮液用介质阻挡放电低温等离子体(南京苏曼等离子体科技有限公司)进行处理，具体步骤：将细菌悬浮液装入石英培养皿(直径50mm)中，将培养皿放于两电极之间，对菌液进行低温等离子体处理，处理功率为40w,处理气隙间距为5mm，处理时间为5min，处理温度为室温25℃，以空气为放电气体。然后用超声波scientz-iid型杀菌装置对金黄色葡萄球菌悬浮液进行处理，具体步骤：将细菌悬浮液装入玻璃超声管中，直径为10mm的超声探头深入液面2cm，将超声管放入25℃水浴锅中，对菌液进行超声处理，处理频率为20khz,处理功率为200w，处理时间为10-20min，最后得到处理后菌液。
优选地，介质阻挡放电低温等离子体处理前将金黄色葡萄球菌洗涤、悬浮，得到金黄色葡萄球菌菌悬液。
进一步优选地，所述洗涤和所述悬浮均采用无菌生理盐水，所述无菌生理盐水为质量百分含量为0.85％的nacl水溶液。
优选地，所述金黄色葡萄球菌为处于稳定期的目的细菌。
在等离子体和超声波协同处理后，还包括以下步骤：通过在非选择性培养基上的培养得到生长活菌和亚致死菌的总和，然后通过在选择性培养基上的培养得到生长活菌。因此，选择性培养基和非选择性培养基上的菌落差值即为亚致死菌量。
本发明将金黄色葡萄球菌先经介质阻挡放电低温等离子体处理5min，产生带电粒子和活性成分作用于微生物细胞，然后再进行超声处理10-20min，利用超声空化效应的微射流将等离子体产生的活性成分注入细胞内，从而有效抑制亚致死金黄色葡萄球菌的产生。本发明的实验证明，利用等离子体联合超声波技术处理细菌，可有效杀灭金黄色葡萄球菌并抑制亚致死金黄色葡萄球菌。与其他杀菌技术相比，本发明安全高效无残留，对环境友好。本发明的方法大大提高了金黄色葡萄球菌的杀灭效果，并有效抑制了亚致死金黄色葡萄球菌的产生，以此为等离子体和超声波二者结合在食品保鲜除菌上的应用提供一定的理论依据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、细菌悬浮液制备
将金黄色葡萄球菌标准菌株atcc25923接种于普通肉汤培养基中，37℃摇床培养24h至稳定期。采用0.85％(质量百分含量)无菌生理盐水洗涤稳定期的菌体两次，重悬，稀释，使菌体浓度约为106cfu/ml，作为待处理菌液(细菌悬浮液)；
二、低温等离子体处理
用介质阻挡放电低温等离子体(南京苏曼等离子体科技有限公司)进行处理，具体步骤：将细菌悬浮液装入石英培养皿(直径50mm)中，将培养皿放于两电极之间，对菌液进行低温等离子体处理，处理功率为40w,处理气隙间距为5mm，处理时间为5min，处理温度为室温25℃，以空气为放电气体。
三、超声波处理
用超声波scientz-iid型杀菌装置对等离子体处理后的金黄色葡萄球菌悬浮液进行进一步处理，具体步骤：将细菌悬浮液装入玻璃超声管中，直径为10mm的超声探头深入液面2cm，将超声管放入25℃水浴锅中，对菌液进行超声处理，处理频率为20khz,处理功率为200w，处理时间为10min，最后得到处理后菌液。
四、检测
亚致死菌的测定方法
取1ml处理后的菌悬液，用0.85％无菌生理盐水梯度稀释至合适浓度，取0.1ml分别加入到非选择性培养tsa和选择性培养基tsa+7％nacl中，37℃培养48小时，然后记录菌落数。非选择性培养基中可以生长活菌和亚致死菌，而选择性培养基中只能生长活菌。因此选择性培养基和非选择性培养基上的菌落差值即为亚致死菌量。
结果如下：处理前金黄色葡萄球菌的浓度为6.02logcfu/ml，等离子体处理5min后金黄色葡萄球菌非选择性培养基上菌落数为4.74logcfu/ml，选择性培养基上菌落数为4.46logcfu/ml，亚致死损伤菌数量为0.28logcfu/ml。然后超声处理10min后非选择性培养基上菌落数为2.21logcfu/ml，选择性培养基上菌落数为2.13logcfu/ml，亚致死损伤菌数量为0.08logcfu/ml。由此可见，本发明的方法在等离子体先处理5min，然后超声处理10min的条件下有效降低了金黄色葡萄球菌活菌和亚致死菌的数量。
实施例2
一、细菌悬浮液制备
与实施例1中的步骤一方法相同。
二、低温等离子体处理
与实施例1中的步骤二方法相同。
三、超声波处理
与实施例1中的步骤三的方法基本相同，仅将超声处理时间变为20min。
四、检测
与实施例1中的四的方法相同。
结果如下：处理前金黄色葡萄球菌的浓度为6.02logcfu/ml，等离子体处理5min后金黄色葡萄球菌非选择性培养基上菌落数为4.74logcfu/ml，选择性培养基上菌落数为4.46logcfu/ml，亚致死损伤菌数量为0.28logcfu/ml。然后超声处理20min后金黄色葡萄球菌在非选择性培养基和选择性培养基上均不能生长。由此可见，本发明的方法在等离子体先处理5min，然后超声处理20min的条件下金黄色葡萄球菌活菌和亚致死菌被完全杀灭。本实施例同实施例1相比，杀灭金黄色葡萄球菌活菌和亚致死菌的效果更好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。