降解麦醇溶蛋白以得到无麸质面粉的方法与流程

本发明涉及一种生产无麸质面粉的方法，更具体地，本发明涉及一种降解麦醇溶蛋白以得到无麸质面粉的方法。

背景技术：

乳糜泻(celiacdisease)是由麸质的摄入所诱发的一种免疫系统的遗传疾病，其中麸质是一种在小麦、黑麦和大麦中发现的蛋白。麸质难以在人体消化道中消化。麸质由两种组分组成：麦醇溶蛋白和谷蛋白。麦醇溶蛋白是可醇溶的，并且含有最多的对于患有乳糜泻的人有毒的组分(green,p-h-r-andcellier,c.2007.celiacdisease.n.engl.j.med.；357:1731-1743)。

当患有乳糜泻的患者食用一些含麸质的食物时，他们的免疫系统以破坏或损害肠绒毛的方式作出响应，导致无法吸收食物中的营养物质，从而引起营养不良。乳糜泻的症状因患者的年龄而异，其中腹泻、腹胀、呕吐和体重减轻是儿童中最常见的症状，而在成年人中，主要症状是缺铁性贫血、疲劳、骨痛、关节炎、骨质疏松等。

直到最近，乳糜泻仍被认为是一种罕见的疾病，但也是目前最常见的不耐受症之一，其中在全世界范围内每150个新生儿中便有1个患病，并且估计仅诊断出其中的9％。根据墨西哥国家医学科学与营养研究所salvadorzubirán的统计，在墨西哥，大约有260万人患有乳糜泻。

如今，针对乳糜泻的唯一可接受的治疗是终生遵循无麸质饮食。根据食品法典(codexalimentarius)，当食品中的麸质浓度低于20ppm时，则认为该食品是无麸质的。但是，这代表了对营养的不利影响，例如较低的多糖摄入以及降低的能量摄入，减少的对人体健康有益的肠道菌群以及机会病原体存在的增加。由无麸质饮食导致减少的有益肠道菌群会对免疫刺激活性产生不利影响，并且减少抗炎化合物的产生。

为此原因，需要适合于乳糜泻患者的无麸质产品，并且因此使上述患者能够通过进食更多种类的食品来改善饮食。

在人类日常饮食中，最重要的产品之一是主要由小麦粉制成的面包。小麦面团的特性主要取决于麸质蛋白。近年来，已经采用了多种处理来改善这些蛋白的品质或使它们降解，从而获得可被乳糜泻患者食用的烘焙产品。

最近开发的用于改善面包品质的处理是生产酸面团(sourdough)。所述面团通常由属于乳杆菌的酵母和乳酸菌(lab)来发酵面粉和水的混合物而获得。已经发现，在用于获得酸面团的发酵中使用的lab能够在面包制作过程中改变麸质，从而消除对乳糜泻患者有毒的蛋白组分。对于患有这种疾病的人来说，最有害的蛋白组分之一是麦醇溶蛋白组分，其也可以通过使用lab来消除。

在发酵过程中，lab的蛋白水解系统会释放促进微生物代谢活性的低分子量的肽和氨基酸，从而有助于改进味道构成并降低过敏原肽的含量，这为主要对麦醇溶蛋白组分敏感的乳糜泻患者提供了巨大的希望。对酸面团面包生产进行的研究表明，lab在特定加工条件(长期且半液体发酵)下具有水解小麦麦醇溶蛋白组分的能力(dicagno,r.,deangelis,m.,auricchio,s.,greco,l.,clarke,c.,devincenzi,m.,&minervini,f.(2004).sourdoughbreadmadefromwheatandnontoxicfloursandstartedwithselectedlactobacilliistoleratedinceliacspruepatients.appliedandenvironmentalmicrobioiogy,70(2),1088-1096；gobbetti,m.,deangelis,m.,corsetti,a.,&dicagno,r.(2005).biochemistryandphysiologyofsourdoughlacticacidbacteria.trendsinfoodscience&technology,16(1),57-69.；gobbetti,m.,rizzello,c.g.,dicagno,r.,&deangelis,m.(2007).sourdoughlactobacilliandceliacdisease,foodmicrobiology,24(2),187-196,)。

但是，并不是所有的乳酸菌都能将残留的麸质浓度降低到能够被不耐受麸质的人(乳糜泻患者)耐受的剂量，因此需要选择lab的类型并且寻找它们之间的合适组合。

蛋白酶也具有降解麸质组分的能力。这就是为什么使用蛋白酶来辅助麸质水解的原因。

在rizzello,c.g.,deangelis,m.,dicagno,r.,camarca,a.,silano,m.,losito,i.,...&gianfrani,c.(2007).highlyefficientglutendegradationbylactobacilliandfungalproteasesduringfoodprocessing:newperspectivesforceliacdisease,appliedandenvironmentalmicrobiology,73(14),4499-450的文章中，在酸面团中使用非商购的乳杆菌(lactobacilli)菌株(预先根据菌株水解麦醇溶蛋白的能力来选择)和真菌蛋白酶以不同组合的混合物来在相对较长的发酵过程中去除小麦粉的毒性。据观察，乳杆菌的水解动力学在水解白蛋白、球蛋白和麦醇溶蛋白方面非常有效，但酸面团中仍残留了20％的谷蛋白。

同样地，美国专利申请us2008/0131556公开了至少六种市售lab和/或双歧杆菌(bifidobacteria)的混合物。该混合物可用于制作酸面团。当将足够量的烘焙中常用的微生物蛋白酶添加到这些配方中时，麸质会降解，但由于经发酵的酸面团中麸质浓度为约200ppm而不能充分降解，这可能不适合乳糜泄患者食用。此外，由于当使用更多种lab时能够观察到麦醇溶蛋白的更优的降解，因此实现这种降解的混合物必须使用多种物质，从而该混合物是复杂的。

国际公开wo2010/073283公开了包含两种类型的lab与一种或多种真菌蛋白酶的混合物。所使用的lab是专门开发以具有更高麸质降解程度的菌株。通过lab和蛋白酶的以特定的量的组合以及在某些反应条件下，痕量的麦醇溶蛋白和谷蛋白被减少到不能检测到的程度，并且实现了低于20ppm的残留的麸质浓度。在麸质降解过程结束时，获得了用于烘焙食品的无麸质面粉。然而，这种情况下的问题是所使用的微生物不是可商购的。

同样，国际公开wo2014/072758表明了用于将麸质降解成酸面团的微囊化的细菌菌群。所述发明的优点是降低了在需要时制备接种物的困难，降低了污染的风险和乳酸培养物的生存力，提高了降解小麦面团的加工效率，但是与以前的情况一样，它需要使用适应发酵过程的特定微生物。

可以看出，现有技术中已知的用于麸质降解的细菌培养物具有某些缺点，例如在可商购的菌株情况下使用复杂的lab混合物(至少六种)，或者使用特定选择和设计的菌株，这意味着需要将悬浮液(接种物)中的培养物活化、繁殖、洗涤并将其添加到面团中，需要进行日常制备和高度专业化的处理以避免污染，使其保持在相同的生长期和以及保持lab之间的适当比例以及足够的量，这表示了存在潜在的污染风险，并且最后，通过微囊接种物处理面团，这意味着烘焙过程中需要额外的步骤。

另外，在将烘焙面粉作为最终产品的方法中，需要使用非常特殊的细菌菌群，如前所述，其涉及培养物的活化、繁殖和洗涤。这些类型培养物的另一缺点是，它们涉及非常复杂的研发过程，这意味着面粉生产成本的显著增加，从而使得该方法不可行。

因此，在现有技术中，目前需要开发一种有效的、使用可商购的微生物的使麦醇溶蛋白降解的方法，并且通过该方法，能够得到麦醇溶蛋白含量极低且因此麸质含量极低的面粉。

本发明的目的

考虑到上述现有技术的问题和缺点，本发明的目的是提供一种通过酶促水解和微生物发酵来使得用于制作面包的面粉中的麦醇溶蛋白降解的方法。

技术实现要素：

本发明的使用于制作面包的面粉中的麦醇溶蛋白降解的方法解决了现有技术中提到的问题和缺点。

本发明涉及一种使用于制作面包的面粉中的麦醇溶蛋白降解的方法，包括：将面粉与水混合的步骤；至少一个酶促水解步骤，以使在混合步骤中得到的混合物中的麦醇溶蛋白水解；至少一个在受控ph条件下通过使用至少一种微生物来发酵从酶促水解步骤得到的混合物的步骤；以及，进行干燥以获得不含麦醇溶蛋白的面粉的步骤。

附图说明

图1示出了经5小时蛋白水解和乳杆菌(lactobacillus)发酵处理的面粉的色谱图；

图2示出了经10小时蛋白水解和乳杆菌发酵处理的面粉的色谱图；

图3示出了经约氏乳杆菌(l.johnsonii)发酵处理24小时的面粉的色谱图；

图4示出了利用htproteolytic进行10小时蛋白水解处理的面粉的色谱图；

图5示出了利用harizyme进行10小时蛋白水解处理的面粉的色谱图；

图6示出了经5小时蛋白水解、乳杆菌(lactobacillus)发酵并且利用蛋白酶htproteolitic进行5小时蛋白水解处理的面粉的色谱图；

图7示出了通过旧金山乳杆菌(l.sanfranciscensis)发酵的面粉中麦醇溶蛋白的浓度；

图8示出了通过短乳杆菌(l.brevis)发酵的面粉中麦醇溶蛋白的浓度；

图9示出了通过解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens.)发酵的面粉中麦醇溶蛋白的浓度；

图10示出了利用蛋白酶n-的酶促蛋白水解过程中l-酪氨酸的浓度；

图11示出了利用蛋白酶htproteolitic的酶促蛋白水解过程中l-酪氨酸的浓度；

图12示出了通过包括两个酶促水解步骤和两个发酵步骤的方法处理的面粉的液相色谱图。

具体实施方式

如背景技术中所提及的，麸质组分，尤其是麦醇溶蛋白的降解对于制作适合于乳糜泻患者的产品是非常重要。为了解决该问题，已经发现，通过由至少一个酶促水解和利用乳杆菌(lactobacilli)的至少一个酶发酵步骤组成的方法，实现了烘焙面粉中所含的麦醇溶蛋白的完全降解。

已经观察到，介质在通过发酵和酶促水解处理面粉时发生的酸化过程因为抑制了微生物和酶的作用而对面粉中麦醇溶蛋白的降解程度产生不利的影响。这就是为什么要获得具有最佳降解的麦醇溶蛋白的面粉的原因，不仅必须谨慎地选择细菌菌群和反应条件，而且还必须按照特定顺序来进行这些过程中的每个过程，以优化微生物的活性并且避免酶促抑制作用。

因此，本发明的使用于制作面包的面粉中的麦醇溶蛋白的降解的方法解决了现有技术中提到的问题和缺点。

根据前述，本发明涉及一种使用于制作面包的面粉中的麦醇溶蛋白降解的方法，该方法包括：使面粉与水混合的步骤；至少一个酶促水解步骤，以使在混合步骤中得到的混合物中的麦醇溶蛋白水解；至少一个在受控ph条件下通过使用至少一种微生物来发酵从酶促水解步骤得到的混合物的步骤；以及，进行干燥以得到不含麦醇溶蛋白的面粉的步骤。

用于制作面包的面粉是具有适用于制作烘焙产品的合适性质的那些。它们的特征在于具有高的麸质含量，这使得所述面粉具有良好的吸水能力、内聚性、粘度和弹性。用于制作面包的面粉的一些实例是源自小麦、黑麦、大麦、燕麦和黑小麦的面粉。

所述方法的第一步包括使用于制作面包的面粉与水混合。

在本发明的优选实施方式中，在酶促水解步骤中，优选使用真菌的酶。更优选地，使用来自黑曲霉(aspergillusniger)和/或米曲霉(aspergillusoryzae)的酶。所述酶优选以1:1的比例存在，并且以相对于悬浮液0.01wt％至0.1wt％的比例加入到混合物中。该酶促水解步骤优选在连续搅拌下于35℃至37℃之间的温度下进行。水解时间优选为4小时至8小时。在该第一步骤中，实现了约88％存在于初始面粉中的麦醇溶蛋白的降解。

如前所述，介质倾向于被酶促水解酸化，并且已知的是在酸性ph下酶活性倾向于降低。这就是为什么在本发明的任选的实施方式中，在水解步骤完成后，对ph进行调节的原因。优选地，需要在6.5至8之间的ph。为了对所述ph进行调节，加入足以达到所需ph的量的碱，优选加入k2co3。

在所描述的水解步骤中，实现了麦醇溶蛋白的水解和麸质分子中存在的目标肽的裂解。由酶促水解过程产生的肽和氨基酸可以被某些lab有效地降解。这就是为什么使麦醇溶蛋白降解的方法的后续步骤是在受控ph条件下通过使用至少一种lab来发酵在酶促水解步骤中获得的混合物的步骤。

关于发酵步骤，在本发明的优选实施方式中，其通过使用解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuterii)，瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)或其混合作为微生物来进行。所使用的微生物优选以每克面粉10³cfu至10⁹cfu的量加入到混合物中。优选地，发酵步骤在36℃至38℃的温度下进行并且进行4小时至8小时的时段。在上述发酵步骤中，最多可降解额外10％的初始麦醇溶蛋白，而其余的面粉中约含2％的麦醇溶蛋白。

如在水解步骤中一样，在发酵步骤中，观察到ph的显著降低，因此在本发明的任选实施方式中，对ph进行第二次调节。优选地，需要在6.5至8之间的ph。为了对所述ph进行调节，加入足以达到所需ph的量的碱，优选加入k2co3。

为了降解剩余的2％的麦醇溶蛋白，可进行第二水解步骤。因此，在本发明的另一优选的实施方式中，第二酶促水解步骤优选使用真菌的酶来进行。更优选地，使用来自黑曲霉(aspergillusniger)和/或米曲霉(aspergillusoryzae)的酶。上述酶优选以1:1的比例存在，并且以相对于悬浮液0.02wt％至0.08wt％的比例加入到混合物中。第二酶促水解步骤优选在连续搅拌下于35℃至37℃之间的温度下进行。水解时间优选为2小时至4小时。

另外，在第二水解步骤之后，可进行第二发酵步骤以实现麦醇溶蛋白的最大可能的降解。因此，在本发明的优选实施方式中，对在第二酶促水解步骤中获得的混合物进行的第二发酵步骤是在受控ph条件下通过使用至少一种微生物来进行。优选地，第二发酵步骤通过使用解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuterii)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)或它们的混合来作为微生物来进行。优选地，使用解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)和选自短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuterii)和瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)的至少两种乳杆菌的混合。优选地，微生物以1:1:1的比例存在。优选地，将微生物以每克面粉10³cfu至10⁹cfu的量加入到混合物中。优选地，第二发酵步骤在连续搅拌下于35℃至37℃之间的温度下进行，并且进行4小时至12小时的时段。

最后，为了获得可用于生产烘焙产品的最终产品，该方法包括进行干燥以获得不含麦醇溶蛋白的面粉的额外步骤。

在优选的实施方式中，干燥步骤是喷雾干燥过程。优选地，在喷雾干燥中，入口空气的温度为150℃至180℃，出口空气的温度为70℃至90℃。

从以下实施例中将更好地理解本发明，所示出的实施例仅出于说明目的，以能够充分理解本发明的优选实施方式，而不意味着基于上述详细描述没有可以投入实践的其它未示出的实施方式。

实施例1

进行了数项研究以观察通过各种方法降解麦醇溶蛋白。

在第一项研究中，进行由蛋白水解步骤和发酵步骤组成的方法。对于该研究，制备水包面粉悬浮液，并将所述悬浮液在37℃的温度下连续搅拌。对于蛋白水解步骤，每千克面粉加入1g酶ht并使其水解5小时。随后，加入10⁹cfu的乳杆菌短乳杆菌(lactobacillilactobacillusbrevis)和旧金山乳杆菌(lactobacillussanfranciscensis)以进行发酵步骤，持续9小时。

在第二项研究中，重复了先前的试验，但是酶促蛋白水解的时间从5小时更改为10小时。

在第三项研究中，进行发酵过程，对于该发酵过程，制备水包面粉悬浮液，并将10⁹cfu的约氏乳杆菌(l.johnsonii)加入到该悬浮液中。将悬浮液在37℃的温度下连续搅拌24小时。

第四项研究由蛋白水解过程组成，对于该蛋白水解过程，制备了33.3g面粉和130ml水的悬浮液，并将酶以每千克面粉1g酶htproteolitic的量加入到该悬浮液中。将所述悬浮液在37℃下连续搅拌10小时。

在第五项研究中，进行蛋白水解过程，对于该蛋白水解过程，制备了33.3g面粉和130ml水的悬浮液，将酶以每千克面粉1.2g酶harizyme的量加入到该悬浮液中。将悬浮液在37℃下连续搅拌10小时。

在每个实验结束时，通过液相色谱法对面粉进行分析。结果可见于表1。在图1至图5的每幅图中，面粉hojade的液相色谱图以字母“a”表示，并且经过该研究的各种方法处理的面粉的色谱图以字母“b”表示。另外，在每幅图中，用圆圈示出了表示所分析的麦醇溶蛋白含量在色谱图中的位置。

表1

根据表1及其各图中所示的结果，可以得出这样的结论：最有效的麸质降解方法是其中进行蛋白水解然后进行乳杆菌发酵的那些过程。

实施例2

进行试验以观察通过包括使用酶的5小时蛋白水解步骤，使用乳杆菌的发酵步骤以及使用htproteolitic的额外蛋白水解步骤的方法进行的麦醇溶蛋白降解。

对于该试验，进行第一实验，在该第一实验中，制备水包面粉悬浮液，并且将酶以每千克面粉0.4g酶n-的量加入至所述悬浮液中。将悬浮液在37℃的温度下连续搅拌5小时。随后，加入10⁹cfu的短乳杆菌(lactobacillusbrevis)和旧金山乳杆菌(lactobacillussanfranciscensis)，并在37℃的温度下连续搅拌9小时。最后，每千克面粉加入1g酶htproteolitic并将悬浮液在37℃的温度下连续搅拌5小时。

重复该实验，其中仅将第二次蛋白水解时间更改为10小时。

从所述实验中获得图6的色谱图，其中不同浓度的面粉hojade的色谱图以字母“a”表示，而经过本方法处理的面粉的色谱图以字母“b”表示。在同一幅图中，用圆圈示出了表示所分析的面粉中麦醇溶蛋白含量在色谱图中的位置。

从图6中可以看出，在完成所有过程步骤之后，能够将麦醇溶蛋白降解至约75ppm。图6还表明了第一实验的结果与第二实验的结果非常相似。

实施例3

进行三次发酵过程。在各过程中，制备水包面粉悬浮液，并将10⁹cfu的微生物加入到所述悬浮液中。在第一实验中，微生物是短乳杆菌(l.brevis)；在第二实验中，选择的微生物是旧金山乳杆菌(l.sanfranciscensis)；在第三实验中，微生物是是解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)。每次发酵在连续搅拌下于37℃下持续24小时。随后，通过液相色谱法定量降解的麦醇溶蛋白。对于旧金山乳杆菌(l.sanfranciscensis)的结果，可参见图7；对于短乳杆菌(l.brevis)的结果可参见图8；对于解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)的结果，可参见图9。其中“a”线表示麦醇溶蛋白标准品，“b”线表示由每种微生物发酵的面粉中的麦醇溶蛋白的浓度。

可以看出，降解麦醇溶蛋白的最佳微生物是解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)。

实施例4

进行研究以确定进行酶促水解所需的操作时间。对于本研究，在两个小麦麸质水解过程(每个过程使用不同的蛋白酶)中量化酪氨酸的释放。该实验的目的是确定酪氨酸达到稳定状态(即停止生成酪氨酸)所需的水解时间。

对于这些实验，在水解过程中每15至30分钟，对面粉悬浮液中的酪氨酸含量进行量化。对于第一实验，使用4.3g面粉在130ml水中的悬浮液，并将0.4g蛋白酶n-加入到该悬浮液中。对于第二实验，使用4.3g麸质在130ml水中的悬浮液，并将1g蛋白酶proteoliticht加入到该悬浮液中。

对于蛋白酶n-的结果，可参见图10，对于蛋白酶proteoliticht的结果，可参见图11。在这些图中，示出了酪氨酸浓度随时间的变化，并且可以清楚地看到，悬浮液中的酪氨酸浓度平均在水解4小时至8小时后达到稳态。

实施例5

在与前述实施例中提到的条件相同的条件下进行试验，以确定在通过本发明的麦醇溶蛋白降解方法处理后的面粉中存在的麦醇溶蛋白浓度。

在本研究中，制备水包面粉悬浮液，该水包面粉悬浮液首先使用酶proteasefnp和fungalprotease来通过酶促水解步骤处理，随后使用解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)来通过发酵步骤处理，然后再使用蛋白酶proteasefnp和fungalprotease通过另一酶促水解步骤处理，最后使用解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)与短乳杆菌(l.brevis)和德氏乳杆菌(l.delbrueckii.)通过第二发酵来处理。所有步骤均在37℃下连续搅拌下进行。

通过四等分法获得经水解的面粉样品。对于每个样品，取200mg样本，并放入带有玻璃珠的falcon管中以改进提取。

通过用70％乙醇溶液洗涤3次来进行蛋白提取。通过向样本和含玻璃珠的管中加入3ml乙醇溶液来进行每次洗涤，并将它们在70-rpm旋转培养箱中搅拌一小时。离心样品后，使用涡旋使其重新悬浮于溶剂中。在以2500rpm离心试管10分钟后，倾析出溶剂中的可溶部分，并且最后将萃取液置于在其中合并三次洗涤液的另一falcon管中。

将来自每个样本的3ml提取物通过0.22-μm膜进行过滤，以通过hplc分析麦醇溶蛋白的浓度。

使样品提取物在50℃的温度下通过hplc设备，其中使用两种流动相，第一种命名为溶液a，由99％的水和含0.001％三氟乙酸的1％的水的混合物组成。流动相流速为0.6ml/min，其中前20分钟具有27％b升高至50％b的梯度，且最后在30分钟内将50％b升高至75％b，在注入样本后，用相a进行10分钟洗涤。在分析期间，注入100μm样本或相a，并分别进行洗涤。通过使用uv检测器检测在210nm处存在的肽信号，如图12所示，其中标准面粉的液相色谱图用字母“a”表示，而经本发明的方法处理的面粉的液相色谱图用字母“a”表示。

从图12可以看出，对应于不同麦醇溶蛋白(rf在12分钟至17分钟之间)的级分在通过本发明的方法处理的面粉样品中显然消失了。

根据前述内容，对于本领域技术人员而言显而易见的是，仅出于说明性而非限制性目的示出了上述降解用于制作面包的面粉中的麦醇溶蛋白的方法的优选实施方式，因此只要根据本发明的原理进行设计，本领域的技术人员可以对上述方法做出多种变化。

因此，根据以下权利要求，本发明涵盖本领域技术人员在本说明书中包含的概念能够提出的所有实施方式。