双乳化法-喷雾干燥生产复合益生菌双层微胶囊的技术方法与流程

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种适用于多种活性益生菌复合微生态制剂的双乳化法-喷雾干燥生产复合益生菌双层微胶囊的技术方法。

背景技术

常见的益生菌有双歧杆菌和乳杆菌。益生菌制剂可用于急性腹泻、慢性腹泻、慢性便秘、肠易激综合征、肝损伤、神经系统疾病和特应性疾病[等疾病的治疗,具有广阔的市场前景。但益生菌在制剂在胃酸环境中会大量死亡,因此益生菌的存活率和稳定性始终是益生菌制剂的巨大挑战。只有较大数量的存活益生菌通过宿主的上行消化系统后,在肠道释放并定植于肠道黏膜才能发挥功效。因此益生菌制剂产品对人体产生积极作用需要满足两个条件:一是益生菌制剂易于工业化生产、且在运输和储存过程中维持较高的活菌率；二是能够在通过胃液等不良环境后有大量的活菌到达肠道。冷冻干燥技术是传统益生菌产品的常用制备技术,它基于“饥饿存活”原理来降低益生菌的水分含量,使得益生菌处于休眠状态以延长保存期,但是这类产品对储存的环境要求高,且成品多孔疏松，热稳定性差，对胃酸没有耐受力；因此在很多应用方面受到限制。

益生菌通过微囊化可以隔绝芯材与外界环境,避免氧气、水分和光照等对敏感成分的不良影响,提高药物的稳定性,可以将芯材由液态向固态转变,可以控制芯材的释放,掩盖芯材的不良口味等。微胶囊适合于包载稳定性差的大分子蛋白、多肽类和益生菌等药物。常见的益生菌微囊化的制备方法有喷雾干燥法、喷雾冷却法、空气悬浮法、挤压法和乳化法。其中,挤压法具有操作简单,不需要有机试剂,制备的微胶囊机械强度大等优点,因此受到越来越多的关注。

然而，用以益生菌微胶囊化技术在实际生产应用过程中目前很多活菌微囊技术受限于不能加大生产规模这一问题，多数研究被限制于在实验室内，尤其是如何延长活菌产品的货架期,并使其能够抵抗人体胃肠道苛刻的环境、发挥其益生作用成为国内外研究热点。并且在市场上食品产品中没有广泛的应用，包埋的益生菌在其他食品药品产品中产业化应用还需要做更多可行的适合工业化生产的方法。且很多制备的单层微胶囊表面存在凹陷和突起、包埋效率较低、稳定性较差、具有多孔性、“爆释”现象严重。尤其是如何有效提高益生菌在生产、贮藏及销售过程中以及在宿主消化道内逆环境的抵抗力，成为国内外研究的热点和难点。

技术实现要素：

鉴于现有技术存在的问题，本发明以干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌为复合活性微生态制剂，采用双乳化-喷雾干燥法制备的双层微胶囊益生菌包埋效率高、活菌稳定性能良好、表面完整近似球形，而且被包埋组分通过两个界面才释放，克服了“爆释”现象，延长了释放时间，具有良好的控释性能。通过设备简单、操作方便、利于劳动保护，工艺周期短、生产率高，成品具有较好的耐酸和耐胆盐能力，为益生菌制品产业化工业化生产奠定基础。有关以干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌为复合活性微生态制剂，采用双乳化-喷雾干燥法制备的双层复合益生菌微胶囊还未见报道。

本发明旨在提出一种通过双乳化-喷雾干燥法制备耐热性好的乳杆菌-双歧杆菌复合益生菌双层微胶囊的技术方法。以大豆分离蛋白、麦芽糊精、油溶性成分、乳化剂等为材料，以干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌为复合活性微生态制剂，应用双乳化-喷雾干燥技术研制制备了一种具有缓释特性和良好稳定性、耐热性好的乳杆菌-双歧杆菌复合益生菌双层微胶囊。在加入植物油等油溶性成分形成内层油性壁材的基础上，再由大豆分离蛋白与麦芽糊精经分子间相互作用形成致密完整的外层囊壁，最终形成w/o/w双层活菌微胶囊，微胶囊外形较圆整、表面光滑、组织致密、无裂纹和凹陷、壁厚较均匀，粒径变化范围较窄≤12μm，微胶囊化效率较高，具有良好的稳定性。设备简单、操作方便、利于劳动保护，工艺周期短、生产率高，成品具有较好的热稳定性、耐酸和耐胆盐能力,制得的复合益生菌微胶囊粒径微小、有更好的热稳定性和贮藏能力,扩大了产品的应用范围。

本发明通过以下技术方案来实现：

双乳化法-喷雾干燥生产复合益生菌双层微胶囊的技术方法，包括：

(1)、选取壁材：以大豆分离蛋白、麦芽糊精、葵花籽油作为壁材的组成材料，通过大量实验优选得到大豆分离蛋白：麦芽糊精：葵花籽油质量比为大豆分离蛋白25％～40％、麦芽糊精30％～45％、葵花籽油活菌混合液30％～45％。

在加入植物油等油溶性成分形成内层油性壁材的基础上，再由大豆分离蛋白与麦芽糊精经分子间相互作用形成致密完整的外层囊壁，最终形成w/o/w双层活菌微胶囊，大豆分离蛋白与麦芽糊精形成的致密的蜂窝状结构可以有效的保护内部的油相和芯材；通过对乳状液粘度和稳定性的比较确定最佳的壁材组合，优化了壁材的组成质量体积比为大豆分离蛋白25％～40％、麦芽糊精30％～45％、葵花籽油活菌混合液30％～45％，以此配方制备的微胶囊外形较圆整、表面光滑、组织致密、无裂纹和凹陷、壁厚较均匀。

(2)、初始w/o型乳状液的制备：将亲油性乳化剂卵磷脂作为第一乳化剂，其用量为0.5-2％(m/v)，优选1.5％，加入到葵花籽油中，高速分散混合均匀，乳化得到内层壁材，再加入芯材-益生菌溶液混合，5000～12000r/min高速分散乳化，制得初始w/o型乳状液，芯材添加量为2～20％(v/v)；再次乳化(工艺参数8000～12000r/min分散均匀乳化)，二次乳化后得到的初始w/o型乳状液；

随着初始乳化搅拌速度的增加，微胶囊包埋效率增加，包埋效果增强，这是由于在初始乳化过程中，初始搅拌速度越大，内水相中液滴被分散的越充分，微粒粒径越小，在复乳化后形成的多重乳状液更稳定，所以包埋效率越高；但是当搅拌速度仅增加至8000～10000rpm后，对包埋效果的影响不显著，反而再增大搅拌速度会破坏微胶囊，使得包埋效率下降。而乳化搅拌速度≤8000rpm，包埋率≤80％；本发明选定初始乳化搅拌速度8000～10000rpm，8000～12000r/min再次乳化，乳化物包埋率≥85％。

初始w/o型乳状液的稳定性影响双层微胶囊的形态，且适量的油相可有效地包埋芯材防止其扩散；单次乳化制备的是单层微胶囊表面存在凹陷和突起、包埋效率较低、稳定性较差、“爆释”现象严重，本发明采用二次乳化经喷雾干燥法制备的双层微胶囊包埋效率高、稳定性能良好、表面完整近似球形，而且被包埋组分通过两个界面才释放，克服了单层乳化制备的单层微囊“爆释”现象，延长了释放时间，具有良好的控释性能。

作为一种优选方案，所述步骤(2)中，所述益生菌选自干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌等。具体地，所述益生菌溶液优选为干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌为等体积比的复合活性微生态制剂；进一步优选所述微生态制剂在混合前，先与海藻糖、低聚果糖分别为0.9～1.5％、维生素e0.01～0.02％等混合，实现益生菌的良好保护。

作为一种优选方案，所述步骤(2)中，优选复合活性微生态益生菌制剂与保护剂溶液混合，其中，保护剂为海藻糖、低聚果糖、维生素e中一种或者几种，优选海藻糖质量比为0.9～1.5％、低聚果糖的质量比为0.9～1.5％、维生素e的质量比0.01～0.02％，稳定性提高10％以上。

作为一种优选方案，所述步骤(2)中，复合菌剂加入量10¹⁰～10¹²cfu/ml混合液。

(3)、多重w/o/w型乳状液的制备：

首先，外层壁材制备：称取大豆分离蛋白溶于水中，搅拌均匀，然后在80℃水浴中边加热边搅拌，保温20～30min，冷却至室温后加入麦芽糊精，其中大豆分离蛋白与麦芽糊精按质量比1～2：1～3比例混合制备，得到30％-40％(v/v)混合液，搅拌均匀，再次经30～40mpa压力均质处理，高速分散得到外层壁材；

然后，将上述步骤(2)的初始w/o型乳状液加入到外层壁材中，经8000～10000r/min分散预乳化，8000～12000r/min再次乳化，制得均匀的多重w/o/w型乳状液。

其中，大豆分离蛋白：麦芽糊精：葵花籽油质量体积比为大豆分离蛋白25％～40％、麦芽糊精30％～45％、葵花籽油活菌混合液30％～45％，其中，葵花籽油活菌溶液中，所含活菌总数≥10⁷g^-1～≥10¹⁰g^-1。

(4)、喷雾干燥，即得所述双层微胶囊。

大豆分离蛋白中蛋白质含量高达90％以上，具有亲水基和疏水基，并且分子表面和分子内部的吸引力作用，其成膜性、乳化性良好，包埋率高，作为外层微胶囊化的壁材。麦芽糊精不易吸水，粘度低，水溶性好，成膜性好，作为微胶囊工艺中的配伍壁材，与大豆分离蛋白一起使用，两者由于氢键的作用可形成非常致密完整的蜂窝状结构。一些非极性植物油类，如葵花籽油也用作微胶囊化的壁材，用作油包水(w/o)型乳状液中的油相，是相对较新且非常有发展前途的微囊壁材。因此，本发明选取大豆分离蛋白、麦芽糊精和葵花籽油作为微胶囊化的主要壁材。

喷雾干燥工艺要求用壁材配制成的乳状液具有良好的稳定性，且粘度尽可能低为好。

前述技术方案是通过大量实验优选得到的，例如，选定大豆分离蛋白(spi):麦芽糊精(md)质量比＝1:1，改变初始乳状液的添加量，其他条件同上，测定多重乳状液的乳化稳定指数(esi)和双层微胶囊的包埋率(mee)，如图2所示。

初始乳状液添加量增大对多重乳状液的稳定性影响不大，而对微胶囊化效率有明显影响，油相用量较小时形成的双层微胶囊的效率较低，但总的微胶囊化效率较大，这是由于油相用量少无法充分的包埋芯材，外层壁材包埋了油相和芯材，形成了较多的单层微胶囊，这从多重乳状液的显微图可以看出；油相用量增加，包埋住芯材的能力增加，形成双层微胶囊的效率也随之增大，但油相用量太大，外层壁材不能充分包埋内层壁材与芯材，微胶囊化效率下降。所以选用初始乳状液添加量30％～45％进行优化。

通过对乳状液粘度和稳定性的比较确定最佳的壁材组合；乳状液稳定性较好，粘度低，且内层壁材用量也适当，符合喷雾干燥工艺要求；油相膜材用量过多会导致油相粘度过大，在复乳化时不易被打碎成更小的液滴，粒径增大。经过比较确定的最佳壁材组合大豆分离蛋白：麦芽糊精：葵花籽油质量体积比为大豆分离蛋白25％～40％、麦芽糊精30％～45％、葵花籽油活菌混合液30％～45％。

利用双乳化－喷雾干燥法制备微胶囊的生产中，乳化剂含有亲水基和亲油基，能使脂溶性物质分散于水(或水溶性物质分散于油)中形成稳定均匀的乳状液，起着非常重要的作用，选用了五种不同的乳化剂(卵磷脂、吐温－60、吐温-80、单甘酯、蔗糖酯、卵磷脂+吐温-80*，其用量相对于总量为0.6～1.0％)，其他条件不变，分别测定了多重乳状液的粘度和乳化稳定指数(esi)和双层微胶囊的包埋率(mee)，并比较了不同乳化剂对微胶囊包埋效果的影响，使用不同的乳化剂其乳化效果不同，用吐温系列乳化剂的包埋效果一般，溶解性较好，制得的多重乳状液粘度和乳化稳定指数esi比较大，不太适于喷雾操作。用单甘酯时溶解性较好，包埋效率较高，但是双层效果一般，且制得的多重乳状液粘度较大，不太适于喷雾操作，而蔗糖酯的溶解性较差，包埋效率较高，而制得的多重乳状液的粘度很大，不适合于喷雾干燥操作。

本发明采用的技术方案中，外层壁材中大豆分离蛋白具有较好的乳化能力，不需要另外加入乳化剂，包埋效率也较高，如果加入第二乳化剂后乳状液的粘度增大，影响喷雾干燥操作。

在步骤(3)中，随着初始乳化搅拌速度的增加，微胶囊包埋效率增加，包埋效果增强，这是由于在初始乳化过程中，初始搅拌速度越大，内水相中液滴被分散的越充分，微粒粒径越小，在复乳化后形成的多重乳状液更稳定，所以包埋效率越高；但是当搅拌速度增加至8000～10000rpm后，对包埋效果的影响不显著，反而再增大搅拌速度会破坏微胶囊，使得包埋效率下降，乳化搅拌速度≤8000rpm，包埋率≤80％；本发明选定初始乳化搅拌速度5000～10000rpm，8000～12000r/min再次乳化，乳化物包埋率≥85％。

所得多重w/o/w型乳状液中固形物浓度影响乳状液的粘度，稳定性、生产成本等，最佳的固形物浓度为20％～30％。

优选的，所述步骤(4)为：低温喷雾干燥：将步骤(3)多重w/o/w型乳状液在以下条件下进行低温喷雾干燥，进风温度135～180℃，进料流量15ml/min～45ml/min，出风温度55～65℃。该工艺可以大幅提高生产效率，收率90％以上。

随着进风温度的升高，微胶囊化效率先升高后下降，但温度过高不利于菌体存活，进风温度≤130℃，包埋率≤70％；进风温度135～180℃，包埋率≥85％。

通过前述制备工艺，复合益生菌经此法制备的双乳化微胶囊包埋率在85％～90％以上，复合益生菌双乳化微胶囊所含活菌总数≥10⁷g^-1。

本发明相对于现有技术的有益效果包括：

本发明将以干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌为复合活性微生态制剂，应用双乳化-喷雾干燥技术研制制备了一种具有缓释特性和良好稳定性、耐热性好的乳杆菌-双歧杆菌复合益生菌双层微胶囊。在加入植物油等油溶性成分形成内层油性壁材的基础上，再由大豆分离蛋白与麦芽糊精经分子间相互作用形成致密完整的外层囊壁，最终形成w/o/w双层活菌微胶囊，微胶囊外形较圆整、表面光滑、组织致密、无裂纹和凹陷、壁厚较均匀，粒径小≤12.5μm，且变化范围较窄，扩大了产品的应用面；复合益生菌经此法制备的包埋率在85％～90％以上，复合益生菌微生态制剂所含活菌总数≥10⁷g^-1。微胶囊化效率较高，具有良好的稳定性。设备简单、操作方便、利于劳动保护，工艺周期短、生产率高，成品具有较好的热稳定性，适合工业化大规模生产。

附图说明

图1，本发明实施例的工艺流程图。

图2，初始乳状液不同体积比对esi的影响示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1

参照图1的工艺流程图，双乳化法-喷雾干燥生产复合益生菌双层微胶囊的技术方法，包括：

(1)、选取壁材：以大豆分离蛋白、麦芽糊精、葵花籽油作为壁材的组成材料，大豆分离蛋白：麦芽糊精：葵花籽油质量比为大豆分离蛋白30％、麦芽糊精30％、葵花籽油活菌混合液40％。

(2)、初始w/o型乳状液的制备：将亲油性乳化剂卵磷脂作为第一乳化剂，其用量为1.5％(m/v)，加入到葵花籽油中，高速分散混合均匀，乳化得到内层壁材，再加入复合益生菌活菌制剂-益生菌溶液混合，7500r/min高速分散乳化，制得初始w/o型乳状液，芯材添加量为10％(v/v)；再次高速分散乳化(10000r/min)，二次乳化后得到的初始w/o型乳状液；

所述益生菌选自干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌的六种益生菌的复合菌，复合菌剂加入量：≥10¹¹cfu/ml混合液；

(3)、多重w/o/w型乳状液的制备：首先，外层壁材制备：称取大豆分离蛋白溶于水中，搅拌均匀，然后在80℃水浴中边加热边搅拌，保温20min，冷却至室温后加入麦芽糊精，其中大豆分离蛋白与麦芽糊精按2：3(质量比)比例混合制，加入亲水性乳化剂等其它外层壁材成分得到40％(v/v)混合液搅拌均匀，再次经40mpa压力均质处理；高速分散乳化得到外层壁材；

然后，将上述步骤(2)的初始w/o型乳状液加入到制备好的外层壁材中，经7500r/min分散预乳化，10000r/min再次乳化，制得均匀的多重w/o/w型乳状液。

(4)、低温喷雾干燥：将步骤(3)多重w/o/w型乳状液在以下条件下进行低温喷雾干燥，进风温度140℃，进料流量20ml/min，出风温度55℃。

实施例2：

参照图1的工艺流程图，双乳化法-喷雾干燥生产复合益生菌双层微胶囊的技术方法，包括：(1)、选取壁材：以大豆分离蛋白、麦芽糊精、葵花籽油作为壁材的组成材料，大豆分离蛋白：麦芽糊精：葵花籽油质量比为大豆分离蛋白30％、麦芽糊精30％、葵花籽油活菌混合液40％。

(2)、初始w/o型乳状液的制备：将亲油性乳化剂卵磷脂作为第一乳化剂，其用量为1.0％(m/v)，加入到葵花籽油中，高速分散混合均匀，乳化得到内层壁材，再加入复合益生菌活菌制剂-益生菌溶液混合，8000r/min高速分散乳化，制得初始w/o型乳状液，芯材添加量为10％(v/v)；再次高速分散乳化(8000r/min)，二次乳化后得到的初始w/o型乳状液；

所述益生菌选自干酪乳酸菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌的六种益生菌的复合菌，复合菌剂加入量：≥10¹²cfu/ml混合液；

(3)、多重w/o/w型乳状液的制备：首先，外层壁材制备：称取大豆分离蛋白溶于水中，搅拌均匀，然后在80℃水浴中边加热边搅拌，保温20min，冷却至室温后加入麦芽糊精，其中大豆分离蛋白与麦芽糊精按1：1(质量比)比例混合制，加入亲水性乳化剂等其它外层壁材成分得到30％(v/v)混合液搅拌均匀，再次经40mpa压力均质处理；高速分散乳化得到外层壁材；

然后，将上述步骤(2)的初始w/o型乳状液加入到制备好的外层壁材中，经8000r/min分散预乳化，8000r/min再次乳化，制得均匀的多重w/o/w型乳状液。

(4)、低温喷雾干燥：将步骤(3)多重w/o/w型乳状液在以下条件下进行低温喷雾干燥，进风温度150℃，进料流量30ml/min，出风温度60℃。

对比实施例1

参照图1的工艺流程图，以大豆分离蛋白、麦芽糊精＝5：5为单层壁材，直接与芯材益生菌制剂，其它技术条件同上实施例1，单层乳化喷雾干燥制备出单层微胶囊。

对比实施例2

参照图1的工艺流程图，以大豆分离蛋白：麦芽糊精：葵花籽油质量比为大豆分离蛋白30％、麦芽糊精30％、葵花籽油活菌混合液40％壁材，其它技术条件同上实施例1，但步骤(2)和步骤(3)中步骤只经8000r/min单次分散乳化，制得双层微胶囊。

实施例3效果检测

人工肠液：取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.4％氢氧化钠溶液调节ph值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释成1000ml，即得。临用前制备。测定结果如下：

从上述结果可见，说明本发明技术方案相对于常规技术方案减少暴释，包埋率高，以及微粒间的粒径差异小。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。