本发明属于生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种豆粕的发酵方法、该方法制备的发酵豆粕及应用。
背景技术：
：我国饼粕类资源十分丰富，主要有：大豆饼粕、菜籽饼粕、棉籽饼粕、花生粕、芝麻饼粕、油茶饼粕、葵花籽饼粕、亚麻籽饼粕、红花籽粕等。其中，大豆饼粕为植物性的蛋白质原料，粗蛋白含量较高，达到40-50％，必需氨基酸组成平衡，消化率高，饲料报酬高。其中，赖氨酸含量居饼粕类饲料中榜首，高达2.5-3％，但是蛋氨酸含量较少，仅为0.5-0.7％。大豆饼粕虽然含有丰富的蛋白质，同时也含有很多抗营养因子，例如：胰蛋白酶抑制因子、血细胞凝集素、致甲状腺肿物质、抗维生素因子、植酸、脲酶、大豆抗原、赖丙氨酸、皂甙、雌激素、胀气因子等。它们多数在大豆饼粕的正规生产过程中由于加热而失活，从而降低或丧失了其有害作用。但我国有些地区采用土法榨油时加热不足或溶剂浸提法生产豆粕时温度和时间控制不当，都会使大豆饼粕出现过生现象，其所含的有害物质会对动物产生不良影响。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种增加豆粕的营养、降低抗营养因子的发酵方法，以及该方法制备的发酵豆粕及应用。为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种米曲霉和黑曲霉的发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向上述酶解后的物料中添加2～5％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。在上述方案的基础上，所述米曲霉发酵菌种的接种量为7～10％，所述黑曲霉发酵菌种的接种量为3～5％。在上述方案的基础上，所述米曲霉和黑曲霉的发酵菌种是先经豆汁斜面培养基活化后，再接种于豆壳培养基发酵而得。在上述方案的基础上，所述米曲霉和黑曲霉的发酵菌种是由以下方法制备而成：粉碎豆壳过10目筛，经121℃、15min灭菌；调节含水量50～65％，将经豆汁斜面培养基活化后的米曲霉和黑曲霉菌种按1％的接种量分别接种于豆壳培养基，25-30℃培养48～60h，制得发酵菌种，菌种含量≥109cfu·g-1豆壳培养基。在上述方案的基础上，所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。在上述方案的基础上，所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。在上述方案的基础上，所述唾液乳杆菌为唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)xjp2，保藏编号为cgmccno:11386。上述方法制备的发酵豆粕。在上述方案的基础上，上述发酵豆粕在提高动物生长发育、提高免疫力、增强消化吸收功能中的应用。一种提高动物生长发育、提高免疫力、增强消化吸收功能的方法，是在饲料中添加上述发酵豆粕，添加量为0.1～0.25kg/kg饲料。本发明技术方案的优点本发明采用黑曲霉和米曲霉固态发酵豆粕。米曲霉和黑曲霉有强大的胞外酶系统，其产生的纤维素酶能够有效的降解豆粕中的纤维素成分，增加可溶性纤维的含量，使豆粕蓬松，内容物释放；产生的蛋白酶能够有效的降解豆粕中的植物性蛋白质，使其分解为小分子的多肽链，减轻了饲喂动物的胃肠负担，提高饲料的生物利用率，此外还能有效的降解大豆中的抗原蛋白，降低其对饲喂动物的危害；植酸酶能够有效降解不易被动物消化吸收的植酸，降低其抗营养作用；米曲霉和黑曲霉相互配合，相互促进，对豆粕中抗营养因子的降解具有协同增效作用。固态发酵后的酶解过程能够进一步的降解豆粕中蛋白质、纤维素等大分子有机物，减少抗营养因子的含量。通过添加复合微生物菌剂进行二次发酵过程，在前期米曲霉和黑曲霉发酵的基础上，唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌能够对抗营养物质和大分子物质进一步分解；在发酵过程中增加有机酸的含量。经本发明发酵方法制备豆粕能够增加可溶性膳食纤维、酸溶蛋白和l-乳酸的含量，发酵后的豆粕抗营养物质含量低，在饲料中添加上述发酵的豆粕能够提高断奶仔猪的生长发育、提高免疫力、增强消化吸收功能。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1米曲霉和黑曲霉的活化与发酵菌种的制备米曲霉bncc195382，北纳创联生物技术有限公司；黑曲霉cicc2377，北纳创联生物技术有限公司；粉碎豆壳过10目筛，经121℃、15min灭菌；调节含水量50～65％，将经豆汁斜面培养基活化后的米曲霉和黑曲霉菌种按1％的接种量分别接种于豆壳培养基，25-30℃培养48～60h，制得发酵菌种，菌种含量≥109cfu·g-1。实施例2唾液乳杆菌为唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)xjp2，保藏编号为cgmccno:11386。活化和发酵培养基：mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温801ml/l，磷酸氢二钾2g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph6.2。将保存的唾液乳杆菌xjp2接种于mrs固体培养基活化培养，活化后的菌种以1％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃、160rpm培养16～24h，至菌含量≥109cfu/ml。枯草芽孢杆菌bacillussubtilisaccc11025，中国农业微生物菌种保藏管理中心；活化和发酵培养基：蛋白胨0.5--3g、葡萄糖1--3g、kh2po40.02--0.08g、mgso40.01--0.04g、nacl0.2--0.4g、蒸馏水100ml。将枯草芽孢杆菌accc11025菌种接种于固体平板上活化，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃，200rpm培养24～36h，至菌含量≥109cfu/ml。植物乳杆菌lactobacillusplantarumcicc21790，中国工业微生物菌种保藏管理中心；活化和发酵培养基：mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温801ml/l，磷酸氢二钾2g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph6.2。将植物乳杆菌cicc21790菌种接种于固体平板上活化，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃、160rpm培养16～24h，至菌含量≥109cfu/ml。实施例3一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种7％米曲霉发酵菌种和3％黑曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向上述酶解后的物料中添加2％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。实施例4一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种8％米曲霉发酵菌种和4％黑曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向上述酶解后的物料中添加3％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。实施例5一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种10％米曲霉发酵菌种和5％黑曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向上述酶解后的物料中添加5％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例1一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)酶解：向上述豆粕中添加0.3‰酸性蛋白酶与0.3‰中性蛋白酶，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；其中，所述酸性蛋白酶和中性蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司，产品规格均为酶活5万u/g；(3)微生物发酵：向上述酶解后的物料中添加3％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例2一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)微生物发酵：向上述豆粕中添加3％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(3)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例3一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种8％米曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向上述酶解后的物料中添加3％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例4一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种8％米曲霉发酵菌种和4％黑曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)二次发酵：向上述发酵后的物料中添加3％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按5:2:3的比例混合而成。(4)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例5一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种8％米曲霉发酵菌种和4％黑曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例6一种豆粕的发酵方法，步骤如下：(1)原料预处理：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)固态发酵：调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种8％米曲霉发酵菌种和4％黑曲霉发酵菌种，充分混合后，进行固态发酵；所述固态发酵条件为：28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)酶解：向上述发酵完成后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向上述酶解后的物料中添加3％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按2:3的比例混合而成。(5)调整出料：向发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。一、不同发酵方法对豆粕营养成分含量的影响1.1试验材料实施例3～5和对比例1～6方法制备的豆粕1.2试验方法粗蛋白质：gb/t6432-94；酸溶蛋白(小肽)：gb/t22492-2008；koh蛋白质溶解度：gb/t19541-2004；可溶性膳食纤维含量：gb/t5009.88-2014；总酸(以乳酸计)：gb/t12456—2008；l-乳酸：sba-40d生物传感分析仪；ph：《中华人民共和国兽药典》三部附录4页ph值测定法。表1不同发酵方法对豆粕营养成分含量的影响由表1可知，实施例3～5与对比例1～6制备的豆粕中粗蛋白质的含量在49～51％之间，各组之间差异不显著；实施例3～5的豆粕中酸溶蛋白含量显著高于对比例1～5组，这说明本发明发酵豆粕中的微生物的使用使大豆蛋白降解成小分子肽类，有利于动物体的吸收利用；实施例3～5组的豆粕koh蛋白质溶解度均在70～80％之间，这说明本发明的发酵方法更好的保护了豆粕的营养，而koh蛋白质溶解度过高说明发酵豆粕过生，不利于动物利用。此外，实施例3～5的豆粕中可溶性膳食纤维、总酸和l-乳酸含量显著高于对比例组，ph显著低于对比例组，较高的乳酸含量能够降低动物胃内的ph，活化消化酶、增加消化能力，还能抑制有害微生物的生长；综上，可知，本发明方法发酵的豆粕营养价值高、有利于机体吸收。二、不同发酵方法对豆粕抗营养因子含量的影响2.1试验材料实施例3～5和对比例1～6方法制备的豆粕2.2试验方法大豆抗原：定性0.6％koh-sds-page；大豆低聚糖(水苏糖、棉籽糖、蔗糖)：定性tlc薄层层析；胰蛋白酶抑制剂的测定gb/t21498-2008；植酸含量测定：采用分光光度法测定过量的fe3+与植酸反应后的上清液中剩余fe3+，从而间接测定植酸含量；脲酶活性测定：将豆粕与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量的盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴；致甲状腺肿素含量测定：在有水介质存在的情况下，大豆中的硫代葡萄糖苷与同时存在硫代葡萄糖苷酶发生水解，在ph＝7的条件下，主要生成异硫氰酸酯，带羟基的异硫氰酸酯极不稳定，在极性溶液中自动环化成恶唑硫酮，在紫外区245nm处有特征吸收峰，可灵敏的检测到；大豆凝集素的测定：大豆凝血素与红血球有特异性凝血反应，细胞凝集从悬浮液中析出，可根据凝血反应强度，用凝血效价表示凝血素的含量。表2不同发酵方法对豆粕抗营养因子含量的影响由表2可知，实施例3～5相对于对比例1～6制备的豆粕大豆抗原、低聚糖、胰蛋白酶抑制剂、植酸、脲酶、致甲状腺肿素和大豆凝集素等抗营养因子含量低，这说明本发明发酵豆粕的方法能够有效降解豆粕中的抗营养因子。三、不同方法制备的豆粕对断奶仔猪生长性能的影响3.1试验材料实施例3～5和对比例1～6方法制备的豆粕3.2试验方法选取270头25日龄健康且体重接近的(7.9～8.1kg)的“杜×长×大”断奶仔猪(福建福清某大型养殖集团提供)，按照公母各半的原则分为9个处理组，每组3个重复，每个重复10头。其中，第1～3组分别饲喂含有实施例3～5制备的发酵豆粕的基础日粮；第4～9组分别饲喂含有对比例1～6组制备的豆粕的基础日粮；其中各组豆粕的添加量为基础日粮中豆粕的含量，基础日粮的具体组成如表3所示，试验期30d，分别在试验开始和结束时称量猪的体重，试验全程采用盲测。试验全期采用栏养方式饲养，日喂3～4次。每天上午07:00清理料槽，统计采食量，自由饮水，上午和下午各清理1次圈舍。每日记录温度和湿度。日常管理及免疫程序按照常规进行。表3基础日粮原料组成及营养成分注：①预混料为每千克日粮提供：维生素a250000iu，维生素d31600iu，维生素e48.3mg，维生素k346.6mg，维生素b67.5mg，烟酸42mg，泛酸10mg，铁150mg，锌160mg，铜10mg，锰70mg。3.3试验指标的测定3.3.1生长性能测定生长性能指标包括平均日增重、平均日采食量、仔猪腹泻率、仔猪成活率。其中，平均日增重＝(结束日体重－开始日体重)/试验天数；平均日采食量＝总采食量/(试验天数×头数)；仔猪腹泻率(％)＝(试验期腹泻仔猪头数×腹泻天数)/(试验仔猪头数×试验天数)×100％；仔猪成活率(％)＝仔猪成活数/仔猪总数。3.3.2挥发性脂肪酸(vfa)测定取1g食糜于离心管中，加入5ml的双蒸水，混合均匀后取1ml样品加25％偏磷酸和巴豆酸(内标法，100ml溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2ml，-20℃冰箱保存。测定前解冻，12000r/m离心10min，取上清液0.6μl测定。柱温130℃，进样器温度为180℃，检测器温度为180℃。高纯氮总流量30.2ml/min，柱流1.7ml/min，氢气流量40ml/min，空气流量400ml/min。3.4试验结果3.4.1不同方法制备的豆粕对断奶仔猪生长性能的影响表4不同方法制备的豆粕对断奶仔猪生长性能的影响由表4可知，各组断奶仔猪的平均初重相差不大，使用实施例3～5组豆粕的断奶仔猪平均日增重、平均日采食量和成活率高于各对比例组，料重比和腹泻率显著低于各对比例组；由此可见，本发明方法发酵的豆粕能够显著提高断奶仔猪的生长性能。3.4.2不同方法制备的豆粕对断奶仔猪粪便中挥发性脂肪酸的影响表5不同方法制备的豆粕对断奶仔猪粪便中挥发性脂肪酸的影响组别乙酸/mg/g丙酸/mg/g丁酸/mg/g总vfa/mg/g实施例32.080.410.513.52实施例42.120.420.553.54实施例52.110.410.543.52对比例11.910.350.382.91对比例22.010.320.252.38对比例31.950.370.352.55对比例41.990.350.332.52对比例51.880.340.222.04对比例61.970.390.473.15由表5可知，各组断奶仔猪粪便中乙酸、丙酸的含量差别不大，实施例3～5断奶仔猪粪便中丁酸和总vfa的含量显著高于各对比例组，后肠厌氧微生物的发酵，使本不可以被仔猪利用的原料转化成可直接被利用的vfa，这将进一步促进仔猪的生长，提高仔猪的生产性能。因此，本发明实施例3～5方法制备的发酵豆粕可增加仔猪后肠中可利用的能量，有助于提高仔猪的消化吸收功能，进一步增加仔猪的生长性能。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12