本发明属于生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种玉米秸秆的发酵方法、该方法制备的发酵玉米秸秆及应用。
背景技术：
：农作物秸秆为农业生产的附属产物，在我国一直未能得到充分有效的利用。传统的种植习惯通常将大量农作物秸秆直接还田、废弃，甚至被焚烧，不仅污染了环境，影响和谐社会的构建，而且也会使秸秆的经济价值丧失。农作物秸秆粗纤维含量高，难以被动物消化吸收，可利用养分少，适口性差，在饲料分类学上归为粗饲料。纤维素、半纤维素和木质素紧密结合、相互缠绕构成粗纤维，也称木质纤维素，是植物细胞壁的主要成分。这些天然有机高分子化合物，结构很牢固，只能吸水润胀，不能为单胃动物的消化液和酶所分解，仅靠其盲肠微生物少量酵解，消化率很低，只适用于反刍家畜的饲养。利用微生物发酵技术提高秸秆的饲用价值是畜牧界、饲料界的研究热点，而现有技术中天然复合菌种组成复杂，单一菌种发酵效率低，人工复配菌种发酵过程控制严谨，发酵效果受多种因素干扰，发酵过程具有不确定性。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种发酵效率高、纤维素降解率高、营养成分丰富的玉米秸秆的发酵方法、该方法制备的发酵玉米秸秆及应用。为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，蒸汽爆破处理；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂和发酵增强剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；(4)向有氧发酵后的物料中加入2～5％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(5)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为1:1:1。所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)编号为accc11025，中国农业微生物菌种保藏管理中心；所述黑曲霉(aspergillusniger)编号为cicc2377，中国工业微生物菌种保藏管理中心；所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)为解淀粉芽孢杆菌hfj-7，保藏编号为cgmccno:10011。在上述方案的基础上，所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照2:1:1.5:0.8的重量比组成。所述干酪乳酸菌(lactobacilluscasei)编号为cicc6117，中国工业微生物菌种保藏管理中心；所述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)编号为cicc6226，中国工业微生物菌种保藏管理中心；唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)为唾液乳杆菌xjp2，保藏编号为cgmccno:11386。嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)为嗜酸乳杆菌l100，保藏编号为cgmccno:10701。在上述方案的基础上，所述蒸汽爆破为2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min。在上述方案的基础上，所述发酵增强剂的添加量为2.5～5％。在上述方案的基础上，所述发酵增强剂，由以下组分按重量份数组成：酵母培养物12份，茶树精油1.6份，葡萄籽提取物0.8份，甘露醇0.6份，葡萄糖氧化酶0.6份，酪素0.6份，维生素b10.03份，微量元素0.05份。在上述方案的基础上，所述微量元素为：kh2po45.0g/l、k2hpo42.0g/l、mgso42.0g/l、feso42.8g/l、cuso43.0g/l、mnso41.5g/l、znso42.4g/l、cacl22.4g/l、水余量。在上述方案的基础上，所述酵母培养物由液体发酵培养物与固体发酵培养物按5:1的重量比混合而成，其中，所述酵母液体发酵培养物的制备方法为：将酵母按10％的接种量接种至液体发酵培养基中，32℃，195r/min，培养64h；离心收集菌体，即为酵母液体发酵培养物；所述酵母固体发酵培养物的制备方法为：将酵母液体菌种按20％的接种量喷洒至固体发酵培养基，在45℃下，厌氧发酵36h，发酵完成后加入1％的纤维素酶，40℃，酶解4h，酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温，即得酵母固体发酵培养物。上述方法发酵的玉米秸秆。上述发酵玉米秸秆在制备畜禽饲料中的应用。本发明技术方案的优点本发明发酵玉米秸秆的方法能够有效降解玉米秸秆中的纤维素成分，并提高玉米秸秆中蛋白质含量，使用本发明发酵的玉米秸秆饲喂畜禽，能够显著提高动物的生长性能，维持肠道内环境稳定，减少肠道病原菌的数量。本发明采用蒸汽爆破方法处理玉米秸秆，能够将紧密缠绕的粗纤维结构打开，有利于微生物发酵和胞外酶的降解；先用较高压强爆破短暂时间，再用稍低的压强爆破，有利于提高爆破的效率，降低爆破的时间。蒸汽爆破后的玉米秸秆先经有氧发酵过程，有利于纤维素等大分子物质的分解，有氧发酵后，玉米秸秆的结构变疏松，并且产生大量的有机代谢物，为厌氧发酵提供物质基础。厌氧发酵可在有氧发酵的基础上，继续分解有机物，并产生乳酸等有机酸类，厌氧发酵还可以增加玉米秸秆中益生菌的数量，发酵后的玉米秸秆不仅可以作为饲料与其他饲料配合使用，还可以作为一种微生态制剂，调整动物体肠道微生态平衡，减少病原微生物的繁殖。在微生物发酵过程中添加发酵增强剂，有利于提高发酵的效率，缩短发酵时间；提高发酵产品的质量。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1一种发酵增强剂，由以下组分按重量份数组成：酵母培养物12份，茶树精油1.6份，葡萄籽提取物0.8份，甘露醇0.6份，葡萄糖氧化酶0.6份，酪素0.6份，维生素b10.03份，微量元素0.05份。所述微量元素为：kh2po45.0g/l、k2hpo42.0g/l、mgso42.0g/l、feso42.8g/l、cuso43.0g/l、mnso41.5g/l、znso42.4g/l、cacl22.4g/l、水余量。所述酵母培养物由液体发酵培养物与固体发酵培养物按5:1的重量比混合而成。酵母液体发酵培养物的制备方法：产朊假丝酵母(candidautilis)编号为as2.281，北纳创联生物技术有限公司；活化培养基：麦芽汁琼脂。液体发酵培养基为：葡萄糖40g/l、蛋白胨10g/l、kh2po42g/l、mgso4·7h2o0.3g/l，加水定容至1l；121℃、高压蒸汽灭菌15min；将酵母按10％的接种量接种至液体发酵培养基中，32℃，195r/min，培养64h；离心收集菌体，即为酵母液体发酵培养物。所述酵母固体发酵培养物的制备方法为：所述固体发酵培养基为：豆粕80％、玉米蛋白粉15％、氨基酸粉15％，加水使含水量32％，ph5～6，121℃、高压蒸汽灭菌15min。将酵母液体菌种按20％的接种量喷洒至固体发酵培养基，在45℃下，厌氧发酵36h，发酵完成后加入1％的纤维素酶，40℃，酶解4h，酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温，即得酵母固体发酵培养物。上述发酵增强剂的制备方法，步骤如下：(1)将酵母培养物与微量元素混合后，喷雾干燥成粉末a；(2)将酪素、葡萄籽提取物添加到茶树精油中，再依次加入维生素b1、甘露醇、葡萄糖氧化酶，混合均匀得混合物b；(3)将粉末a与混合物b充分混合后，真空包装，低温储存。实施例2黑曲霉的活化粉碎豆壳过10目筛，经121℃、15min灭菌；调节含水量50～65％，将经豆汁斜面培养基活化后的黑曲霉菌种按1％的接种量分别接种于豆壳培养基，25-30℃培养48～60h，制得发酵菌种，菌种含量≥109cfu·g-1。枯草芽孢杆菌bacillussubtilisaccc11025，中国农业微生物菌种保藏管理中心；活化和发酵培养基：蛋白胨0.5--3g、葡萄糖1--3g、kh2po40.02--0.08g、mgso40.01--0.04g、nacl0.2--0.4g、蒸馏水100ml。将枯草芽孢杆菌accc11025菌种接种于固体平板上活化，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃，200rpm培养24～36h，至菌含量≥109cfu/ml。所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)为解淀粉芽孢杆菌hfj-7，保藏编号为cgmccno:10011。活化和发酵培养基同枯草芽孢杆菌；将解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌种接种于固体平板上活化，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃，200rpm培养24～36h，至菌含量≥109cfu/ml。干酪乳酸菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌和嗜酸乳杆菌活化和发酵培养基：mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温801ml/l，磷酸氢二钾2g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph6.2。将保存的保藏的菌种分别接种于mrs固体培养基活化培养，活化后的菌种以1％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃、160rpm培养16～24h，至菌含量≥109cfu/ml。实施例3一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂和3％发酵增强剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为1∶1∶1；(4)向有氧发酵后的物料中加入4％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照2∶1∶1.5∶0.8的重量比组成。(5)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。实施例4一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂和3％发酵增强剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为2∶0.8∶1.2；(4)向有氧发酵后的物料中加入2％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照2∶1∶1.5∶0.8的重量比组成。(5)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。实施例5一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂和3％发酵增强剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为1∶1∶1；(4)向有氧发酵后的物料中加入5％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照1.5∶2∶2∶0.5的重量比组成。(5)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例1一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过40目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂和3％发酵增强剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为1∶1∶1；(3)向有氧发酵后的物料中加入4％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照2∶1∶1.5∶0.8的重量比组成。(4)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例2一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂和3％发酵增强剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为1∶1∶1；(4)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例3一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入4％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照2∶1∶1.5∶0.8的重量比组成。(4)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。对比例4一种玉米秸秆的发酵方法，步骤如下：(1)玉米秸秆除去杂物后，机械粉碎，过20目筛，调节玉米秸秆水分含量10％，2.5mpa条件下蒸汽爆破50s；再在2.0mpa条件下蒸汽爆破5min；(2)将蒸汽爆破后的物料高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(3)调节灭菌后物料的含水量70～85％，并向其中加入1.5％的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的复合菌剂后进行有氧发酵，28℃～32℃，发酵36h后，再于32～35℃发酵24h；所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉的重量比为1∶1∶1；(4)向有氧发酵后的物料中加入4％复合微生物菌剂，混合均匀后无氧发酵，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为：干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌按照2∶1∶1.5∶0.8的重量比组成。(5)调整出料：向无氧发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。一、不同方法对发酵玉米秸秆的营养成分影响对实施例3～5和对比例1～4方法发酵玉米秸秆的粗蛋白质、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量进行分析；其中，粗蛋白质、粗纤维测定根据gb/t6432-1994、gb/t6434-1994标准进行，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维测定根据gb/t20806-2006、ny/t1459-2007标准进行。结果如表1所示：表1不同方法对发酵玉米秸秆营养成分的影响粗蛋白质(％)粗纤维(％)中性洗涤纤维(％)酸性洗涤纤维(％)实施例322.4823.6550.1534.28实施例420.7126.8253.4737.13实施例518.3924.1751.2434.87对比例117.6630.4360.1144.55对比例29.3527.2555.0739.75对比例312.7233.7664.3646.63对比例48.1829.3458.8142.27由表1可知，实施例3发酵的玉米秸秆中粗蛋白质的含量显著高于其他各组，粗纤维和中性洗涤纤维含量显著低于其他各组，酸性洗涤纤维含量与实施例5组无显著差异，但显著低于其他各组的含量。二、饲料中添加不同发酵玉米秸秆对家禽生长性能的影响选择同批孵化、体重相近、健康的240只黄羽肉鸡随机分成8组，每组3个重复，每个重复10只；其中1～3组在基础日粮中分别添加30％实施例3～5制备的发酵玉米秸秆替代能量饲料和蛋白质饲料；4～7组在基础日粮中分别添加30％对比例1～4制备的发酵玉米秸秆替代能量饲料和蛋白质饲料；第8组饲喂不添加任何发酵玉米秸秆的基础日粮，其他试验条件完全一致。试验时间20d。所述基础日粮如表2所示：表2基础日粮的组成及营养水平注：维生素和微量元素预混料包括(每kg全价料中计)：va12000iu；vd33000iu；ve20iu；vk31.0mg；vb12.0mg；核黄素(vb2,riboflavin)6mg；烟酸(尼克酸)nicotinicacid35mg；胆碱choline1.3g；泛酸钙10mg；vb63.5mg；vb120.01mg；生物素biotin0.15mg；叶酸folicacid1.25mg；铜cu(ascoppersulfate)8mg；铁fe(asferroussulfate)100mg；锰mn(asmanganesesulfate)80mg，锌zn(aszincoxide)60mg；碘i(ascalciumiodate)0.45mg；硒se(assodiumselenite)0.35mg。试验过程中记录初重、末重、日采食量、腹泻率、死亡率，并计算料肉比，结果如表3所示：表3饲料中添加不同发酵玉米秸秆对家禽生长性能的影响平均日增重/g平均日采食量/g料肉比腹泻率/％死亡率/％实施例335.8765.631.830.000.00实施例433.8262.171.840.210.00实施例533.7562.401.851.043.33对比例131.4260.181.921.866.67对比例231.1361.111.962.7510.00对比例332.2862.171.932.126.67对比例431.9362.141.952.646.67空白对照组33.5362.151.851.123.33由表3可知，饲喂实施例3组发酵玉米秸秆的鸡平均日增重和平均日采食量显著高于其他各组，料肉比、腹泻率和死亡率显著低于其他各试验组。试验结束后，每组随机取3只鸡，屠宰，取肠道，测定肠道中大肠杆菌和乳酸菌的数目如表4所示：表4饲料中添加不同发酵玉米秸秆对家禽肠道微生物的影响(lg，cfu/g)大肠杆菌乳酸菌实施例37.05±0.319.35±0.17实施例47.31±0.249.21±0.35实施例57.84±0.279.08±0.28对比例18.27±0.358.67±0.31对比例29.35±0.318.34±0.33对比例38.26±0.288.59±0.35对比例48.17±0.258.81±0.27空白对照组10.83±0.378.01±0.25由表4可知，实施例3组大肠杆菌数量显著少于其他各组，乳酸菌的数量显著高于其他各组。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12