本发明属于生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料、其制备方法及应用。
背景技术：
：农作物秸秆为农业生产的附属产物，在我国一直未能得到充分有效的利用。传统的种植习惯通常将大量农作物秸秆直接还田、废弃，甚至被焚烧，不仅污染了环境，影响和谐社会的构建，而且也会使秸秆的经济价值丧失。玉米秸秆含有30％以上的碳水化合物、2％～4％的蛋白质和0.5％-1％的脂肪；其中，无效粗纤维含量高，粗蛋白含量低，营养较低，需要经过处理后才能饲喂动物。大豆饼粕为植物性的蛋白质原料，粗蛋白含量较高，达到40-50％，必需氨基酸组成平衡，消化率高，饲料报酬高。其中，赖氨酸含量居饼粕类饲料中榜首，高达2.5-3％，但是蛋氨酸含量较少，仅为0.5-0.7％。其与玉米秸秆结合，能够形成良好的营养互补关系；然而大豆饼粕含有较多的抗营养因子，为了综合利用玉米秸秆和大豆饼粕的营养成分，目前亟需一种既能发酵玉米秸秆，又能有效去除大豆饼粕中抗营养因子的技术手段。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种营养价值高、提供动物免疫力的玉米秸秆-豆粕混合发酵料、其制备方法及应用。为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料，是发酵玉米秸秆与玉米粉、发酵豆粕按照1～6:0.5～3:2～12的重量比混合后，经酶解、二次发酵制备而成；所述发酵玉米秸秆经紫芝固体发酵而成。在上述方案的基础上，所述玉米秸秆发酵过程为：向粉碎的玉米秸秆中喷洒含有紫芝孢子的复合溶液；直至玉米秸秆的含水量为45～55％，25℃，发酵3d。在上述方案的基础上，所述含有紫芝孢子的复合溶液为：葡萄糖20g/l，kh2po43g/l，mgso40.7g/l，维生素b10.01g/l，紫芝孢子5×107个/l，甘露醇15g/l，水余量。在上述方案的基础上，所述发酵豆粕是向豆粕中接种米曲霉和黑曲霉固体发酵而成。在上述方案的基础上，所述豆粕的发酵方法为：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种米曲霉和黑曲霉，米曲霉的接种量为7～10％，黑曲霉接种量为3～5％，充分混合后，28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。在上述方案的基础上，所述酶解为向发酵玉米秸秆、玉米粉和发酵豆粕的混合物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2～4h；调节ph4.5，40℃，酶解4～6h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温。在上述方案的基础上，所述二次发酵为：向酶解后的物料中添加2～5％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和简单芽孢杆菌按1:2:1:2的比例混合而成。在上述方案的基础上，所述玉米秸秆-豆粕混合发酵料的制备方法，步骤为：(1)玉米秸秆发酵：将玉米秸秆粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；向粉碎的玉米秸秆中喷洒含有紫芝孢子的复合溶液；直至玉米秸秆的含水量为45～55％，25℃，发酵3d；(2)豆粕发酵：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种米曲霉和黑曲霉，米曲霉的接种量为7～10％，黑曲霉接种量为3～5％，充分混合后，28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃；(3)酶解：发酵玉米秸秆与玉米粉、发酵豆粕按照1～6:0.5～3:2～12的重量比混合后，加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2～4h；调节ph4.5，40℃，酶解4～6h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向酶解后的物料中添加2～5％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(5)调整出料：向二次发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。上述方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料在提高动物生长发育、提高免疫力、增强消化吸收功能中的应用。一种提高动物生长发育、提高免疫力、增强消化吸收功能的饲料，是在饲料中添加上述方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料，添加量为10％～12％。本发明技术方案的优点：本发明的玉米秸秆-豆粕混合发酵料中的玉米秸秆通过紫芝发酵而得，紫芝发酵后的玉米秸秆中木质素降解效果好，发酵后的玉米秸秆与黑曲霉与米曲霉发酵后的豆粕混合，在适宜的温度下进行酶解，黑曲霉和米曲霉发酵豆粕后产生大量的胞外酶，其中含有纤维素酶、果胶酶等，玉米秸秆中的纤维素和半纤维素在酶解过程中被进一步降解。此外，紫芝发酵后的菌丝中富含蛋白质、氨基酸、糖类香豆素、甾体及三萜化合物等生物活性成分，这些有效成分能够调节机体平衡，强身健体，提高免疫力，改善消化不良等症状。在紫芝孢子接种时，同时添加葡萄糖、kh2po4、mgso4、维生素b1、甘露醇等成分，能够提高紫芝孢子的萌发，加快紫芝的生长，更好的发酵玉米秸秆，并缩短发酵时间。发酵后的玉米秸秆和发酵后的豆粕混合后，能够形成良好的营养互补关系；进行二次发酵后，能增加菌体蛋白和益生菌的含量，不仅能够作为饲料使用，还能作为动物肠道的微生态制剂，调节胃肠功能，抑制病原微生物的生长。总之，本发明制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料中营养成分含量高，不仅能够提高动物的生长性能，还能改善胃肠消化功能，提高机体的抗氧化性能，增强免疫力。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1紫芝为中华灵芝(紫芝)ganodermasinense，编号为bncc143276，纳创联生物技术有限公司；经发酵制备成孢子粉。米曲霉和黑曲霉的活化与发酵菌种的制备米曲霉bncc195382，北纳创联生物技术有限公司；黑曲霉cicc2377，中国工业微生物菌种保藏管理中心；粉碎豆壳过10目筛，经121℃、15min灭菌；调节含水量50～65％，将经豆汁斜面培养基活化后的米曲霉和黑曲霉菌种按1％的接种量分别接种于豆壳培养基，25-30℃培养48～60h，制得发酵菌种，菌种含量≥109cfu·g-1。实施例2唾液乳杆菌为唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)xjp2，保藏编号为cgmccno:11386。活化和发酵培养基：mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温801ml/l，磷酸氢二钾2g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph6.2。将保存的唾液乳杆菌xjp2接种于mrs固体培养基活化培养，活化后的菌种以1％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃、160rpm培养16～24h，至菌含量≥109cfu/ml。植物乳杆菌lactobacillusplantarumcicc21790，中国工业微生物菌种保藏管理中心；活化和发酵培养基：mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温801ml/l，磷酸氢二钾2g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph6.2。将植物乳杆菌cicc21790菌种接种于固体平板上活化，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃、160rpm培养16～24h，至菌含量≥109cfu/ml。凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)cicc21736，中国工业微生物菌种保藏管理中心；活化和发酵培养基配方为：豆粕3-5％，蛋白胨1-2％，玉米面3-5％，葡萄糖1-1.5％，磷酸氢二钾0.3-0.5％，硫酸锰0.02-0.1％，硝酸钠0.05-0.1％。将凝结芽孢杆菌cicc21736菌种接种于固体平板上活化，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃、160rpm培养48h，至菌含量≥1010cfu/ml。简单芽孢杆菌为简单芽孢杆菌(bacillussimplex)f5，保藏编号为cgmccno:10051。所述活化和发酵培养基的配方为：玉米浆10g/l，葡萄糖30g/l，酵母膏5g/l，kh2po41g/l，k2hpo41.5g/l，(nh4)2so45g/l，nac11g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，余量为水，ph7.0～7.2。将保存的简单芽孢杆菌f5接种于固体培养基活化培养，活化后的菌种以1％的接种量接种于液体发酵培养基，37℃、180rpm培养16～24h，至菌含量≥109cfu/ml。实施例3一种发酵玉米秸秆的制备方法，步骤为：将玉米秸秆粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；向粉碎的玉米秸秆中喷洒含有紫芝孢子的复合溶液；直至玉米秸秆的含水量为45～55％，25℃，发酵3d；所述含有紫芝孢子的复合溶液为：葡萄糖20g/l，kh2po43g/l，mgso40.7g/l，维生素b10.01g/l，紫芝孢子5×107个/l，甘露醇15g/l，水余量。一、不同发酵菌对玉米秸秆的降解情况1.1试验菌株中华灵芝(紫芝)(ganodermasinense)，编号为bncc143276，纳创联生物技术有限公司；云芝栓孔菌(trametesversicolor)编号为bncc145690，北纳创联生物技术有限公司；黑曲霉(aspergillusnige)编号为cicc2377，北纳创联生物技术有限公司；绿色木霉(trichodermaviride)编号为as3.3711，北纳创联生物技术有限公司；黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporiumburdsall)编号为bncc149828，北纳创联生物技术有限公司；枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)编号为accc11025，中国农业微生物菌种保藏管理中心；1.2试验方法及结果将玉米秸秆粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；向灭菌后的玉米秸秆喷洒无菌水，至其含水量为45～55％；分别接种1.1中的试验菌种，接种量为2.0～2.8×107cfu/kg；25～32℃，发酵3d；分别测定各组中木质素、纤维素和半纤维素的含量，计算木质素、纤维素和半纤维素的降解率，结果如表1所示：表1不同发酵菌对玉米秸秆的降解情况发酵菌株木质素(％)纤维素(％)半纤维素(％)紫芝85.745.657.3云芝栓孔菌81.638.351.5黑曲霉24.232.587.4绿色木霉29.540.584.2黄孢原毛平革菌40.635.885.7枯草芽孢杆菌5.431.468.9由表1可知，紫芝和云芝栓孔菌对玉米秸秆中的木质素具有较好的降解效果，对半纤维素的降解效果不如其他菌；而黑曲霉、绿色木霉和黄孢原毛平革菌对半纤维素具有很好的降解效果，而对木质素的降解效果较差；由纤维素降解情况可知，紫芝对纤维素的降解效果优于其他各组。实施例4一种发酵豆粕的制备方法，步骤为：豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种米曲霉和黑曲霉，米曲霉的接种量为8％，黑曲霉接种量为4％，充分混合后，28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。实施例5一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料的制备方法，步骤为：(1)酶解：发酵玉米秸秆与玉米粉、发酵豆粕按照2:0.8:3的重量比混合后，加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解2h；调节ph4.5，40℃，酶解4h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(2)二次发酵：向酶解后的物料中添加2％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(3)调整出料：向二次发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和简单芽孢杆菌按1:2:1:2的比例混合而成。实施例6一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料的制备方法，步骤为：(1)酶解：发酵玉米秸秆与玉米粉、发酵豆粕按照3:1.5:6的重量比混合后，加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解3h；调节ph4.5，40℃，酶解5h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(2)二次发酵：向酶解后的物料中添加4％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(3)调整出料：向二次发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和简单芽孢杆菌按1:2:1:2的比例混合而成。实施例7一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料的制备方法，步骤为：(1)酶解：发酵玉米秸秆与玉米粉、发酵豆粕按照4:2:10的重量比混合后，加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解4h；调节ph4.5，40℃，酶解6h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(2)二次发酵：向酶解后的物料中添加5％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(3)调整出料：向二次发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和简单芽孢杆菌按1:2:1:2的比例混合而成。对比例1一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料的制备方法，步骤为：(1)将玉米秸秆与玉米粉、豆粕按照3:1.5:6的重量比混合后，粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；(2)调节灭菌后混合物料的水分含量为55～65％，并接种米曲霉和黑曲霉，米曲霉的接种量为8％，黑曲霉接种量为4％，充分混合后，28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃。(3)发酵后的物料中加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解3h；调节ph4.5，40℃，酶解5h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)二次发酵：向酶解后的物料中添加4％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(5)调整出料：向二次发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和简单芽孢杆菌按1:2:1:2的比例混合而成。对比例2一种玉米秸秆-豆粕混合发酵料的制备方法，步骤为：(1)将玉米秸秆粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；向灭菌后的玉米秸秆喷洒无菌水，至其含水量为45～55％，然后接种紫芝孢子，接种量为2.0～2.8×107个/kg；25℃，发酵3d；(2)豆粕粉碎过10目筛，高压蒸汽灭菌121℃30min，灭菌完成后，冷却至室温；调节灭菌后豆粕的水分含量为55～65％，向豆粕中接种米曲霉和黑曲霉，米曲霉的接种量为8％，黑曲霉接种量为4％，充分混合后，28℃～30℃、相对湿度85～90％发酵培养36h～42h；当物料温度上升至35℃时，翻动物料，控制发酵物料温度不超过35℃；(3)发酵玉米秸秆与玉米粉、发酵豆粕按照3:1.5:6的重量比混合后，加入1倍重量的去离子水，调节ph7.0，40℃，酶解3h；调节ph4.5，40℃，酶解5h；酶解完成后，100℃，处理10min，冷却至室温；(4)向酶解后的物料中添加4％复合微生物菌剂，混合均匀，控制发酵温度28～32℃，发酵48h；(5)向二次发酵后的物料中添加发酵物料总重4％的食用酒精，混合均匀，出料。所述复合微生物菌剂为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和简单芽孢杆菌按1:2:1:2的比例混合而成。二、不同制备方法对玉米秸秆-豆粕混合发酵料营养成分的影响对实施例5～7和对比例1～2制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料的粗蛋白质、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量进行分析；其中，粗蛋白质、粗纤维测定根据gb/t6432-1994、gb/t6434-1994标准进行，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维测定根据gb/t20806-2006、ny/t1459-2007标准进行。结果如表2所示：表2不同制备方法对玉米秸秆-豆粕混合发酵料营养成分的影响粗蛋白质(％)粗纤维(％)中性洗涤纤维(％)酸性洗涤纤维(％)实施例559.7425.1454.1138.35实施例662.2324.4852.7337.64实施例761.6624.7553.4537.93对比例154.5829.5361.1841.55对比例258.3727.2756.7439.87由表2可知，本发明实施例5～7制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料的粗蛋白含量显著高于对比例1、2组，粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著低于对比例1、2组。三、不同方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料对断奶仔猪生长性能和免疫指标的影响3.1试验材料实施例5～7和对比例1～2方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料。3.2试验方法选取240头25日龄健康且体重接近的的“杜×长×大”断奶仔猪，按照公母各半的原则分为6个处理组，每组4个重复，每个重复10头。其中，第1～3组分别饲喂含有实施例5～7制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料的基础日粮；第4～5组分别饲喂含有对比例1～2组制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料的基础日粮；其中各组玉米秸秆-豆粕混合发酵料的添加量10％，第6组基础日粮中不添加任何发酵料，基础日粮的具体组成如表3所示，试验期30d，分别在试验开始和结束时称量猪的体重，试验全程采用盲测。试验全期采用栏养方式饲养，日喂3～4次。每天上午07:00清理料槽，统计采食量，自由饮水，上午和下午各清理1次圈舍。每日记录温度和湿度。日常管理及免疫程序按照常规进行。表3基础日粮原料组成及营养成分项目含量原料组成，％膨化玉米38.5碎米13.7膨化大豆10.0大豆粕10.8鱼粉8.3乳清粉12.7蔗糖2.0预混料①4.0营养指标干物质，％89.11消化能，mj/kg13.92粗蛋白，％19.66钙，％0.80总磷，％0.69有效磷，％0.51赖氨酸，％1.46蛋氨酸+胱氨酸，％0.72注：①预混料为每千克日粮提供：维生素a250000iu，维生素d31600iu，维生素e48.3mg，维生素k346.6mg，维生素b67.5mg，烟酸42mg，泛酸10mg，铁150mg，锌160mg，铜10mg，锰70mg。3.3试验指标的测定3.3.1生长性能测定生长性能指标包括平均日增重、平均日采食量、仔猪腹泻率、仔猪成活率。其中，平均日增重＝(结束日体重－开始日体重)/试验天数；平均日采食量＝总采食量/(试验天数×头数)；仔猪腹泻率(％)＝(试验期腹泻仔猪头数×腹泻天数)/(试验仔猪头数×试验天数)×100％；仔猪成活率(％)＝仔猪成活数/仔猪总数。3.3.2断奶仔猪血清抗氧化指数的测定于试验第30天饲喂前，从各试验组随机选取健康状况良好、体重相近的仔猪5头，前腔静脉采血30ml，静置，3000rpm离心10min，离心后血清分装于离心管中，-30℃保存待测。测定抗氧化指标：总超氧化物歧化酶(t-sod)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh)。3.3.3断奶仔猪血清免疫指标的测定采用间接酶联免疫吸附试验(elisa)方法测定血清免疫指标iga、igg、il-4。3.4试验结果3.4.1不同方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料对断奶仔猪生长性能的影响表4不同方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料对断奶仔猪生长性能的影响由表4可知，使用实施例5～7组玉米秸秆-豆粕混合发酵料的断奶仔猪平均日增重、平均日采食量和成活率高于各对比例组和空白对照组，料重比和腹泻率显著低于各对比例组和空白对照组；由此可见，本发明的玉米秸秆-豆粕混合发酵料能够显著提高断奶仔猪的生长性能。3.4.2不同方法制备的玉米秸秆-豆粕混合发酵料对断奶仔猪免疫指标的影响3.4.2.1断奶仔猪血清抗氧化指数的测定结果表5不同玉米秸秆-豆粕混合发酵料对断奶仔猪抗氧化性能的影响由表5可知，实施例5～7组断奶仔猪血清中t-sod活性显著高于对比例1组和空白对照组，与对比例2组相差不大；各试验组gsh的活性无显著差异。3.4.2.2断奶仔猪血清免疫指标的测定结果表6玉米秸秆-豆粕混合发酵料对断奶仔猪血清免疫指标的影响由表6可知，实施例5～7组断奶仔猪血清的il-4和igg显著高于虽比例1和空白对照组，各组血清中iga变化不大。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12