用于测量组织的还原当量产量以确定代谢率的方法及使用方法与流程

本发明涉及测量还原当量(例如nadh、fadh2、nadp(h)和/或辅酶q)以在动物和人类中测量组织代谢率的用途。测量还原当量的方法提供了确定动物或人类的代谢率的高通量手段。该方法可用于多种目的，例如评估饲料效率、评估动物的生产力、确定发展成肥胖的可能性、分选动物等。

政府支持

本发明是在政府支持下在usda/nifa授予的补助第2016-67016-24866号、第2015-70007-24236号和第2010-38500-21758号下进行的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术：

基础代谢率可以通过在代谢室中饲养动物来估计，但是由于实际和经济的挑战，代谢室的使用是困难的。或者，可以使用氧传感器或通过测量培养基的co2酸化来测量组织的离体代谢率。然而，这些措施都不具有与本发明所述的信号积累相关的灵敏度，并且两者都遭遇到介质和空气之间的气体交换。

本文所述的技术先前用于评估细胞生存力，而不是代谢率。因此，令人惊讶的是发现测量动物(或人类)组织中的还原当量可以用作测量动物(或人类)代谢率的替代物。当发现可以应用组织代谢率来评估个体的饲料效率或组织的生产潜力时，获得了额外的飞跃。本发明的方法的特征在于测量还原当量(例如，nadh、fadh2、nadp(h)、辅酶q等)，其用于确定动物或人类的代谢率(例如，组织特异性代谢率)。本发明提供了确定动物或人类的代谢率的高通量方法。

本发明的特征还在于所述方法的用途，例如，使用还原当量测量来测量代谢率的方法。例如，本文的方法可用于：

·鉴定和/或选择饲料有效的动物；

·消除饲料效率差的动物；

·鉴定和/或选择高产动物(例如，高产奶量、高产蛋量、肉产量或任何其它适当的动物产品)；

·鉴定更可能变得超重或肥胖的动物或受试者(例如人类)；

·鉴定对肥胖具有更强抗性的动物或受试者(例如人类)；

·在动物中发展饲料效率、生长、产奶或产蛋的估计的繁殖值；

·选择生产效率较高或饲料效率较好的饲养动物；

·鉴定具有发展成肥胖的特定可能性的动物或人类；

·测试对药物(例如抗生素)、营养物或其它分子的代谢率响应。根据饲料效率和产量的关系，可以应用这些测试来评价这种刺激对产量、饲料效率和服从性驱动的影响；

·评价应激或刺激(例如运动)对动物代谢率的影响。考虑到与饲料效率和产量的关系，这些测试可用于评价这种刺激对产量、饲料效率和服从性驱动的影响。

不希望将本发明限于任何理论或机制，相信本发明的技术是有利的，因为它提供了快速、高通量、可扩展和容易的评估组织代谢率的方法(通过细胞生存力测定，例如测量还原当量)，同时允许用户将该代谢率与参数如饲料效率和组织特异性生产形成相关联。例如，通过将其应用于年轻动物的骨骼肌，可以评估生长；通过在成年骨骼肌中应用这种方法，可以测量或评估饲料效率；通过将其应用于泌乳的乳腺，人们可以确定产奶量。

技术实现要素：

如前所述，本发明的特征在于测量动物(或人类)组织中还原当量(例如nadh、fadh2，辅酶q等)以确定动物(或人类)的代谢率(或组织特异性代谢率)的方法。本发明不限于用于测量还原当量的任何特定方法。例如，本发明不限于使用刃天青、mtt或任何其它特定的还原当量指示剂。在一些实施方案中，测量还原当量可以表征为测量nadh产生。在一些实施方案中，测量还原当量可表征为测量fadh2产生。在一些实施方案中，测量还原当量可表征为测量辅酶q。在一些实施方案中，测量还原当量可表征为测量nadh、fadh2、nadp(h)或辅酶q的组合。

如本文所用，术语“动物”可指任何合适的动物或人类，例如牛(例如，奶牛、肉牛)、山羊、绵羊、猪、小鼠、狗、猫、人类、非人灵长类动物、鸡、鱼、软体动物等。例如，在人类、非人灵长类动物、狗、猫等中，本发明的方法可用于确定肥胖的可能性。本发明的方法和系统不限于本文公开的动物。

如本文所用，术语“组织”可指动物或人类的任何合适的组织，例如骨骼肌、乳腺组织、棕色脂肪组织、白色脂肪组织、肝、肾、鳍等。本发明的方法和系统不限于本文公开的组织。

不希望将本发明限于任何理论或机制，如果组织质量相对于整个体重(例如骨骼肌)较大，则较低的组织特异性代谢率可指示较低的整个动物基础代谢率(维持适当的组织功能而不改变组织质量所消耗的能量)。较低的基础代谢率允许更少的饮食能量趋向于身体维持能量需求并且更多的饮食能量趋向于生长或产物(例如，奶、蛋、肉等)形成。因此，缓慢/不生长成年动物的低骨骼肌代谢率指示良好的饲料效率(产品质量/饲料质量)的潜力，以及产品(例如，奶、肉)生产等的高潜力。

本发明的特征还在于测量还原当量的方法用于测定动物(或人类)的代谢率的用途。

例如，本发明提供了鉴定具有特定饲料效率，例如高饲料效率的动物的方法。如本文所用，术语“饲料效率”是指每单位饲料获得的重量或每单位饲料产生的产物量。本发明的特征还在于基于饲料效率将动物分类的方法。本发明的特征还在于选择(例如，分组、隔离等方法)具有特定饲料效率(例如，高饲料效率)的动物的方法。在一些实施方案中，通过本文的方法确定的饲料效率可用于计算预期的后代差异。

上述方法(例如，鉴定具有特定饲料效率的动物的方法等)和本文所述的其它方法可包括确定来自动物的组织样品(例如，骨骼肌组织样品)中的还原当量产量(例如，量、变化等)，其中组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)与饲料效率成反比。在一些实施方案中，如果骨骼肌组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)低于预定阈值，则与具有高于预定阈值的还原当量产量(例如，量、变化等)的动物相比，从中获得骨骼肌组织样品的动物具有高饲料效率。确定组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)可包括向组织样品引入还原当量指示剂并测量还原当量指示剂(其指示代谢活性)的量或变化。

预定阈值可以是动物的品种、群或物种的还原当量产量的平均值。预定阈值可以由用户确定，例如，基于所期望的饲料效率选择严格性。预定阈值可以是百分位水平(例如，第5百分位、第10百分位、第25百分位、第50百分位等)。预定阈值可以使用具有已知的还原当量产量(例如，量、变化等)和已知的饲料效率的动物群组来确定。预定的阈值可以通过饲料效率对动物进行分类。

关于本文所述的方法，在一些实施方案中，还原当量是nadh。在一些实施方案中，还原当量是nadp(h)。在一些实施方案中，还原当量是fadh2。在一些实施方案中，还原当量是辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadh或fadh2。在一些实施方案中，还原当量是nadh或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是fadh2或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadh或nadp(h)。在一些实施方案中，还原当量是nadp(h)或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadp(h)或fadh2。在一些实施方案中，还原当量是nadh、fadh2、nadp(h)和辅酶q中的一种或多种。在一些实施方案中，还原当量是nadh、fadh2或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadh、fadh2、nadp(h)或辅酶q。

该方法还可以包括使用鉴定为具有高饲料效率的动物进行繁殖。该方法还可以包括使用被鉴定为具有高饲料效率的动物来生产动物产品(例如，奶、肉等)。

本发明还提供了鉴定具有特定产奶量，例如高产奶量的动物的方法。本发明的特征还在于基于产奶量对动物进行分类的方法。本发明的特征还在于选择(例如，分组、隔离等方法)具有特定产奶量(例如，高产奶量)的动物的方法。

上述方法(例如，鉴定具有高产奶量的动物的方法等)和本文所述的其它方法可包括确定来自动物的乳腺组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)，其中乳腺组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)与产奶量潜力直接相关。在一些实施方案中，如果乳腺组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)高于预定阈值，则与具有低于预定阈值的还原当量产量(例如，量、变化等)的动物相比，从中获得乳腺组织样品的动物具有高产奶量潜力。确定组织样品中的还原当量产量可包括将还原当量指示剂引入组织样品并测量还原当量指示剂(其指示代谢活性)的量或变化。

预定阈值可以是动物的品种、群或物种的还原当量产量的平均值。预定阈值可以由用户确定，例如，基于期望的对产奶量潜力的选择严格性。预定阈值可以是百分位水平(例如，第5百分位，第10百分位，第25百分位，第50百分位等)。预定阈值可以使用具有已知的还原当量产量(例如，量、变化等)和已知的产奶量的动物群组来确定。预定阈值可以通过产奶量潜力对动物进行分类。

关于本文所述的方法，在一些实施方案中，还原当量是nadh。在一些实施方案中，还原当量是nadp(h)。在一些实施方案中，还原当量是fadh2。在一些实施方案中，还原当量是辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadh或fadh2。在一些实施方案中，还原当量是nadh或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是fadh2或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadh或nadp(h)。在一些实施方案中，还原当量是nadp(h)或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadp(h)或fadh2。在一些实施方案中，还原当量是nadh、fadh2、nadp(h)和辅酶q中的一种或多种。在一些实施方案中，还原当量是nadh、fadh2或辅酶q。在一些实施方案中，还原当量是nadh、fadh2、nadp(h)或辅酶q。

该方法还可以包括使用鉴定为具有高产奶量的动物进行繁殖。该方法还可以包括使用被鉴定为具有高产奶量的动物来生产奶。

本发明的特征还在于计算动物的饲料效率繁殖值的方法。在一些实施方案中，所述方法包括基于来自动物的组织样品的代谢率来确定饲料效率，例如，如本文所述，其中代谢率通过确定还原当量产量(例如，量、变化等)来确定；以及基于所述组织样品的代谢率分配与所述繁殖平均值的估计的预期子代差异。在一些实施方案中，估计的繁殖值指示潜在亲本培养的饲料效率的遗传。在一些实施方案中，所述方法还包括将估计的饲料效率与一个或多个另外的估计的繁殖值(例如，肋骨面积、肌内脂肪、脂肪深度、出生体重、断奶体重和胴体产量)组合。

本发明的特征还在于将动物种群(例如，新生动物种群)的遗传组成向具有高饲料效率偏好或偏斜的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定来自动物的组织样品(例如，骨骼肌组织)的代谢率(如本文所述)。在一些实施方案中，所述方法还包括选择具有最佳饲料效率的动物用于培育具有特定预测的饲料效率的新生动物种群。

本发明的特征还在于将动物种群(例如，新生动物种群)的遗传组成向具有高产奶量偏好或偏斜的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定来自动物的组织样品(例如，乳腺组织)的代谢率(如本文所述)。在一些实施方案中，所述方法还包括选择具有最佳产奶量的动物用于培育具有特定预测的产奶量的新生动物种群。

本发明的特征还在于用于检测药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的饲料效率的影响的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过测量来自动物的第一组织样品(例如骨骼肌)中的还原当量产量(例如，量、变化等)来确定动物的基线组织特异性代谢率；将所述药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物施用给所述动物；然后测定动物组织的第二组织样品中的还原当量产量(第二组织特异性代谢率)。在一些实施方案中，如果第二组织特异性代谢率等于基线组织特异性代谢率，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物不影响动物的饲料效率。在一些实施方案中，如果第二组织特异性代谢率小于基线组织特异性代谢，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的饲料效率具有积极影响。在一些实施方案中，如果第二组织特异性代谢率大于基线组织特异性代谢，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的饲料效率具有负面影响。

在一些实施方案中，所述方法包括向动物施用药物、饮食补充剂、饮食或组合物；以及通过确定动物的组织(例如骨骼肌)中还原当量产量(例如，量、变化等)来确定动物的代谢率。在一些实施方案中，如果动物的代谢率等于对照代谢率，对照代谢率是未施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的一种或一组动物的代谢率，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物不影响动物的饲料效率。在一些实施方案中，如果动物的代谢率小于对照代谢率，所述对照代谢率是未施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的一种或一组动物的代谢率，则所述药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的饲料效率具有积极影响。在一些实施方案中，如果动物的代谢率大于对照代谢率，所述对照代谢率是未施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的一种或一组动物的代谢率，则所述药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的饲料效率具有负面影响。

本发明的特征还在于检测药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物产奶量的影响的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过测量动物乳腺组织的第一组织样品中的还原当量产量(例如，量、变化等)来确定动物的基线组织特异性代谢率；将所述药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物施用给所述动物；以及通过测量动物乳腺组织的第二组织样品中的还原当量产量(例如，量，变化等)来确定动物的第二组织特异性代谢率。在一些实施方案中，如果第二组织特异性代谢率等于基线组织特异性代谢率，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物不影响动物的产奶量。在一些实施方案中，如果第二组织特异性代谢率小于基线组织特异性代谢，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的产奶量具有负面影响。在一些实施方案中，如果第二组织特异性代谢率大于基线组织特异性代谢，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的产奶量具有积极影响。

在一些实施方案中，所述方法包括向动物施用药物、饮食补充剂、饮食或组合物；以及通过确定动物乳腺组织中的还原当量产量(例如，量，变化等)来确定动物的组织特异性代谢率。在一些实施方案中，如果动物的组织特异性代谢率等于对照组织特异性代谢率，则对照组织特异性代谢率是未施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的一种或一组动物的乳腺组织的代谢率，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物不影响动物的乳汁产生。在一些实施方案中，其中如果动物的组织特异性代谢率小于对照组织特异性代谢率，则对照组织特异性代谢率是未施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的一种或一组动物的代谢率，则药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的乳产量具有积极影响。在一些实施方案中，其中如果动物的组织特异性代谢率大于对照组织特异性代谢率，所述对照组织特异性代谢率是未施用所述药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的一种或一组动物的代谢率，则所述药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物对动物的产奶量具有负面影响。

本发明的特征还在于体外测试药物、饮食补充剂、饮食或组合物的方法。该方法的特征可以是从动物获得样品并用培养物中的药物、饮食补充剂、饮食或组合物处理样品以确定是否存在药物、饮食补充剂、饮食或组合物对还原当量(例如代谢率)的产生的影响。

如本文所用，术语“基线”是指代谢率或其它参数，可以指由产业或用户预先确定的量。例如，基线可以由使用者通过在施用药物或组合物之前测试动物的代谢率(或产奶量)来预先确定。在一些实施方案中，基线由其它个体预先确定，例如，国家平均值、品种平均值等。

本发明的特征还在于用于处理动物以改善产奶量的方法。该方法可以包括确定施用以实现特定的产奶量的药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的量(例如，使用本文所述的方法或方法的组合)，以及施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物以实现所需的产奶量的剂量。

本发明的特征还在于处理动物以提高饲料效率的方法。该方法可以包括确定施用以实现特定饲料效率的药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物的量(例如，使用本文所述的方法或方法的组合)，以及施用药物、饮食补充剂、饮食或其它组合物以实现所需的饲料效率的剂量。

如本文所用，术语百分位，百分位水平，阈值，阈值水平和/或基线可指由用户或产业确定的预定的量或水平。例如，在一些实施例中，阈值水平或百分位水平是产业平均值。在一些实施例中，阈值水平或百分位水平由用户设置。阈值水平对于特定的品种或群可以是唯一的。阈值水平或百分位水平可取决于所需的饲料效率、产奶量等。

在一些实施例中，阈值或百分位是第50百分位或平均值。在一些实施例中，阈值或百分位是第5百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第10百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第15百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第20。在一些实施例中，阈值或百分位是第25百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第30百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第35百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第40百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第45百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第55百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第60百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第65百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第70百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第75百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第80百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第85百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第90百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第95百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第5百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第99百分位。在一些实施例中，阈值或百分位是第5百分位。

本发明不限于上述阈值或百分位。本发明不限于上述确定阈值或百分位的方法。

不希望将本发明限于任何理论或机制，本发明方法的特征和优点包括但不限于：(a)测试组织特异性代谢率的能力；(b)测试遗传、营养、内分泌和生理作用对组织特异性代谢率的能力；(c)测试体内或离体作用的能力；(d)测试任何水或dmso可溶性化合物对代谢率的影响的能力；(e)易于应用和测量(包括荧光变化或颜色变化，其可以从照片测量)；(f)使用累积信号，其比简单的耗氧量测量更敏感并且允许区分动物之间的小差异；(g)简单，仅包括数种溶液的混合物；以及(h)将其放大以同时测量1000s的样品的能力。

本文描述的任何特征或特征的组合包括在本发明的范围内，只要包括在任何这样的组合中的特征不是相互不一致的，如从上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识中显而易见的。本发明的其它优点和方面在以下详细描述和权利要求书中是显而易见的。

附图的简要说明

通过考虑以下结合附图给出的详细描述，本发明的特征和优点将变得显而易见，其中：

图1a显示骨骼肌活组织检查引起荧光信号随时间线性增加，表明骨骼肌组织继续产生还原当量并通过孵育期保持存活。此外，显示该信号对禁食敏感(禁食16小时)。

图1b显示肝脏活组织检查引起荧光信号随时间线性增加，表明肝脏组织继续产生还原当量并通过孵育期保持存活。此外，显示该信号对禁食(16小时禁食)不敏感。

图1c显示来自图5a和图5b的4小时代谢率(荧光变化/ngdna)。通过禁食(16小时)降低骨骼肌活组织检查的代谢率，但禁食不影响肝活组织检查的代谢率。这确定了该测定可用于评估营养状态对组织特异性代谢率的影响。

图1d显示培养基中的葡萄糖(1mm)增加骨骼肌活组织检查代谢率，测量为荧光/mg组织的相对变化。这确定了该测定可用于评估营养物对组织特异性代谢率的影响。

图1e显示异丙肾上腺素(β-肾上腺素受体激动剂)在高葡萄糖浓度(2mm)下增加骨骼肌代谢率。这确定了该测定可用于评估药物对组织特异性代谢率的影响。

图1f显示了组织活组织检查(例如，棕色脂肪组织(bat)、白色脂肪组织(wat)、白色骨骼肌、红色骨骼肌、心脏、肾脏和肝脏)的代谢率(表示为荧光变化/mg组织)在组织之间以及随小鼠年龄(1个月、3个月)而不同。这确定了该测定可用于评估生理参数(包括但不限于年龄、运动、激素状态等)对组织特异性代谢率的影响。

图2显示进食和禁食小鼠中许多组织(例如，棕色脂肪组织(bat)、白色脂肪组织(wat)、白色骨骼肌、红色骨骼肌、心脏、肾和肝)的代谢率(随时间的荧光变化)。这确定了本文所述的本发明可应用于组织。

图3显示乳腺活组织检查代谢率可用于预测产奶量。使用本专利中所述的测定所测量的离体乳腺代谢率(上图)预测了离体乳腺乳糖产生(下图)，其响应于热应激(妊娠第13-19天，35℃/50％湿度)、保持在室温(rt；22-24℃/50％湿度)且随意获取饲料、或保持在室温(22-24℃/50％湿度)且饲料限于由热应激动物随意获取所消耗的饲料(成对喂食；pf)。

图4a显示由从幼小和成熟的angus牛收集的骨骼肌活组织检查诱导的荧光变化(相对于基线的荧光变化＝上图；荧光变化百分比＝下图)。图4a显示来自成熟的完全生长的牛的活组织检查，其具有比从幼年生长的牛收集的活组织检查低的代谢率。由来自年轻和成熟奶牛的骨骼肌活组织检查诱导的fc/4h的可变性是鲁棒性的。这种可变性对于提高效率的遗传可能是重要的。

图4b显示由从angus和hereford牛收集的骨骼肌活组织检查诱导的荧光变化(相对于基线的荧光变化＝上图；荧光变化百分比＝下图)。hereford和angus牛的骨骼肌代谢率无品种差异。然而，在hereford和angus牛中骨骼肌代谢率(fc/4h)的种内动物-动物可变性是广泛的。这种可变性对于提高效率的遗传可能是重要的。

图5显示骨骼肌活组织检查诱导荧光的相对变化，相当于随时间累积能量消耗，其在整个2-h孵育期内增加并且基于喂食转向高纤维高淀粉(hf-hs)、高纤维低淀粉(hf-ls)、低纤维高淀粉(lf-hs)和低纤维低淀粉(lf-ls)饮食而不同。这证实了该测定可用于理解饮食对牛体内组织特异性代谢率的影响。

图6确定了基于在饮食处理中所保持的骨骼肌代谢率的动物的相对等级。处理包括高(hs)或低(ls)瘤胃可降解淀粉源和高(hf)或低(lf)瘤胃可降解纤维源。动物编号是任意的并且反映了由农场分配的动物标识符。这些标识符被包括在图例中以显示跨饮食的动物等级的一致性。该图证实基于骨骼肌代谢率的类似处理的动物的等级可以有效地独立于饮食而保持。

图7示出了生长转向的骨骼肌代谢率(如x轴所示，相对荧光变化)与平均日增重(adg)直接相关(上图)、与平均干物质摄入量(dmi)无关(中图)、并且与饲料与增重比(f:g)反向相关(下图)。(每个点代表个体动物。)虚线示出了性能变量对相对荧光的最佳拟合线性回归。所呈现的r²值反映了每一回归的确定系数。该数据确定骨骼肌还原当量(nadh、fadh2等)，用作组织代谢率的代表，可用于预测生长中动物的生长和饲料效率。

具体实施方式

测定代谢率

本发明提供了测量动物(或人类)的代谢率的方法，其中所述方法的特征在于测量还原当量(例如，nadh、fadh2、nadp(h)、辅酶q等)。该方法可以包括从动物获得组织活组织检查(例如，骨骼肌组织活组织检查、乳腺组织活组织检查等)。活组织检查可以通过适当的手段获得，例如使用针活组织检查工具，通过粗切等。该方法可以包括将活组织检查的至少一部分置于板或盘(例如，12孔板、24孔板、96孔板等)中的适当培养基中。然后使盘中的活组织检查接受还原当量指示剂，例如染料。然后读取活组织检查，例如颜色(例如rgb分析)、吸光度、荧光和/或可以被测量以评估信号变化的任何其它适当的参数。所测量的变化指示还原当量(例如nadh、fadh2、nadp(h)、辅酶q等)产生的程度。值得注意的是，可以滴定还原当量指示剂(例如刃天青、mtt、alamarblue、prestoblue)的浓度以满足具体需要；浓度的滴定可改变测定的灵敏度。本发明不限于上述还原当量指示剂。

作为非限制性具体实例，本文的一些研究使用刃天青测定来测量nadhh⁺产生。从动物收集活组织检查并立即放入含有具有pen/strep的dulbecco’s改良eagle培养基(dmem)的96孔板的孔中，并放入具有95％o2、5％co2的37℃培养箱中。平衡1小时后，将活组织切片移入填充有300μl补充有0.1％dmso、pen/strep和0.16％的10x刃天青的dmem的孔中。在移动组织活组织检查后，立即测量颜色(rgb分析)、吸光度(570-600nm)或荧光(激发530nm，发射590nm)。然后以一定间隔“读取”板(颜色分析或板读数器测量吸光度和荧光)以评估信号变化。测量的信号变化表示nadhh⁺产生的程度。信号随时间累积。

图1a、图1b、图1c、图1d、图1e和图1f显示了基于刃天青的测定对从小鼠收集的恒温组织的应用。图1a显示骨骼肌代谢率随时间至4小时线性增加并且对禁食敏感。图1b显示肝脏代谢率(随时间线性增加，并且对禁食不敏感)。图1c显示骨骼肌中的代谢率(表示为荧光变化/ngdna)因禁食而降低。图1d显示培养基中的葡萄糖增加骨骼肌代谢率(对离体营养物施用敏感)。图1e显示异丙肾上腺素(β-肾上腺素受体激动剂)在高葡萄糖浓度下增加骨骼肌代谢率(对药物应用敏感)。图1f显示了不同组织的代谢率随小鼠的年龄(1个月、3个月)而不同。

图2显示了进食和禁食小鼠中的各种组织，例如棕色脂肪组织(bat)、白色脂肪组织(wat)、白色骨骼肌、红色骨骼肌、心脏、肾脏和肝脏的代谢率，显示了生理变化(禁食)对代谢率的影响(通过4小时荧光变化/mg组织测量)。当测量为每mg组织4小时荧光变化时，白色脂肪组织和肝脏是受禁食影响的两种组织。骨骼肌组织不受影响。不希望将本发明限于任何理论或机制，dna可以是优选的校正因子。

本发明不限于上述用于测量还原当量的方法和组合物。

饲料效率和生产力

不希望将本发明限于任何理论或机制，据信较低的组织代谢率与较高的饲料效率和/或较高的生产力(例如，较高的奶、肌肉、蛋等产量)有关。

本发明提供了用于鉴定(和/或)选择具有高饲料效率的动物的方法。本发明还提供了鉴定具有增加的生产力(例如，产蛋量、产奶量等)的动物的方法，预测具有高生产力的动物的方法，以及选择具有高生产力的动物的方法。本文的方法选择较低的组织特异性代谢率(例如，较低的骨骼肌代谢率)和/或较低的基础代谢率等。

本文提供的其它方法包括但不限于确定动物繁殖值的方法。

在一些实施方案中，为了确定动物的饲料效率，测试来自动物的组织(例如骨骼肌)以通过确定还原当量产量(例如，量、变化等)来确定代谢率。作为实例，用还原当量指示剂测试动物或来自动物的组织(例如骨骼肌)，并通过评估荧光、吸光度(当使用刃天青时，570-600nm)的变化或通过颜色来评估。在一些实施方案中，然后将获得的代谢率与荧光、吸光度或颜色的已知变化范围进行比较，并确定百分位。在一些实施方案中，针对样品的dna、蛋白质或质量校正荧光、吸光度或颜色的组织特异性变化。

在一些实施方案中，在数学模型中使用的还原当量可以与还原当量(代谢率)数据结合使用，以确定或预测饲料效率或生产力，例如体重增加、产蛋、产奶等。在产奶的实例中，可以使用牛群的前瞻性研究来预测高产奶量。可以获得乳腺组织并测试代谢率，并且可以为每个受试者确定产奶量。可以选择候选计分函数将未来的测试动物分类成高产奶量或低产奶量的类别(或其它不同的或附加的类别)。例如，那些具有高乳腺代谢率的动物可以被选择为预测具有高产奶量的动物。

在一些实施方案中，本发明的方法的特征在于选择具有低基础代谢率(例如，低组织特异性代谢率)的动物。在一些实施方案中，本发明的方法的特征在于选择具有高基础代谢率(例如，高组织特异性代谢率)的动物。

参照图3，乳腺代谢率可用于预测产奶量。图3显示离体乳腺代谢率(上图)预测了离体乳腺乳糖产生(下图)，其响应于热应激(妊娠第13-19天，35℃/50％湿度)、保持在室温(rt；22-24℃/50％湿度)且随意获取饲料、或保持在室温(22-24℃/50％湿度)且饲料限于由热应激动物随意获取所消耗的饲料(成对喂食；pf)。

图4a和图4b显示幼小牛和完全生长的牛(angus和hereford)的代谢率。图4a显示成熟的完全生长的牛比年轻生长的牛具有更低的代谢率。图4b显示hereford和angus牛的代谢率没有平均差异。fc/4h的可变性在幼牛和成熟牛以及hereford和angus牛中是广泛的。这种可变性对于提高效率的遗传是重要的。

因此，可以研究营养、营养物、药物、环境刺激和其它因素(例如，年龄等)对代谢率(例如，组织特异性代谢率)的影响。本发明的方法也可用于研究对生产力重要的特定组织(例如，对产奶重要的乳腺组织)的效率。

肥胖症

本发明还提供了用于鉴定动物(或人类)对肥胖的易感性或抗性的方法，例如，用于确定受试者(例如，动物、人等)是否具有发展成肥胖或变得超重的可能性，或动物或人类是否对肥胖具有抗性。

作为非限制性实例，为了开发数学评分函数(临床数学模型)以预测发展肥胖或变得超重的可能性，可以使用对具有已知结果的群组的前瞻性研究来开发结果与代谢率之间的关系(例如，计算一个或多个候选评分函数等)。例如，可以评估患者的群组，其中每个个体提供骨骼肌活组织检查，其通过测量还原当量产量(例如，量、变化等)来测试代谢率。所得到的骨骼肌代谢率可以相对于响应于给定生活方式干预的体重变化作图。或者，可进行长期纵向研究以评估体重随时间的变化。

作为非限制性实例，可以基于用于将个体分类为非超重、超重和肥胖的已知标准将结果分组。例如，在人类的情况下，25.0至29.9的体重指数(bmi)被定义为超重，并且30或更多的bmi被定义为肥胖。因此，bmi值可用于确定群组中个体的结果。

一旦选择了候选评分函数，就可以选择一个或多个截断来将患者分类为上述类别。用于确定类别的截断的机制的非限制性示例可以是接受者操作特性(roc)曲线。roc曲线允许用户将模型的敏感性(例如，将捕获尽可能多的“阳性”或“可能变成超重/肥胖”受试者的优先级)与模型的特异性(例如，最小化“可能变成超重/肥胖候选者”的假阳性)相平衡。

所选择的评分函数(以及任选地由roc曲线确定的截止值)提供了用于评价测试受试者对肥胖的易感性的预定阈值。

本发明的特征还在于选择饲料的方法，例如选择具有高饲料效率的饲料，选择具有高生产率的饲料等。繁殖选择可以以测试母亲或父亲的组织特异性代谢率(例如骨骼肌等)为特征，其可以指示子代的饲料效率和/或生产力。

药物或其它刺激剂的作用

本发明还提供了用于确定遗传、环境刺激、药物治疗(例如抗生素)、生理治疗(例如运动)、饮食补充、饮食或营养处理对感兴趣的动物的代谢率(例如基础代谢率、组织特异性代谢率)的影响以及由此对饲料效率、生产力等的影响的方法。

例如，可以向一组动物(例如牛)施用营养处理，并且可以确定骨骼肌代谢率以评估营养处理对代谢率和潜在饲料效率、生产力等具有何种影响。

由骨骼肌nadh还原率将牛分类

本发明的特征在于用于评估选择的能量消耗以提高效率的高通量方法。例如，下面的方法描述了通过骨骼肌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原率对牛进行分类的肌肉活组织检查技术，用于评估牛中骨骼肌活组织检查的代谢率。该技术可用于遗传选择跨越物种的生长或饲料效率。本发明不限于本文所述的方法、测定和组合物。

使用氧化还原指示剂刃天青评估的组织活组织检查代谢活性可用作评估与非生长动物的维持或生长动物的生长速率相关的能量消耗的代替。这些方法可评估基于刃天青的测定的可重复性、实用性和敏感性，以基于代谢活性对牛骨骼肌活组织检查进行分级。6岁的荷斯坦母牛(bw＝330±11.3kg)喂食4种饮食处理，所述饮食由以部分复制的拉丁方设计因子排列的高或低瘤胃可降解淀粉和纤维组成。期间为18天，3天饮食转换，14天饮食适应和1天样品收集。在每个时期内，从每只母牛收集半腱肌活组织检查到冰冷的dulbecco's改良的eagle培养基(dmem)中。在样品收集的1小时内开始分析。为了评估组织代谢率，将活组织检查转移至具有刃天青的dmem中，并在37℃下孵育。在时间0并以15分钟间隔读取每个样品的荧光持续2小时。荧光的变化代表骨骼肌还原当量产量(例如nadh)。各动物样品信号强度随荧光时间的增加而增加(p<0.001)，但时间与处理之间没有显著的交互作用(p>0.05)，表明在单个时间点的荧光比较是足够的。当考虑到周期的随机效果时，在120分钟时荧光的变化被用于分析纤维、淀粉的固定效果以及动物。当动物处于高瘤胃可降解淀粉饮食时收集的样品比从低淀粉饮食的动物收集的样品具有更大的代谢活性(p＝0.023)。还鉴定了个体动物中代谢活性的显著差异(p＝0.003)。每个个体的平均相对荧光与干物质摄入量(dmi)、平均日增重(adg)以及饲料与增重比(f:g)配对。与adg和f:g对荧光变化相关的pearson相关系数强(adg＝0.749；f:g＝-0.783)且趋向显著(adgp＝0.0864；f:gp＝0.066)。dmi与荧光变化的关系的pearson相关系数较弱(0.153)且无显著性差异(p＝0.773)。因此，该方法可以基于代谢活性对个体动物进行分级，并检测与饮食变化相关的代谢活性的差异。

处理饮食和适应期

在部分重复的拉丁方设计中，将6只瘤胃插管的荷斯坦母牛(bw＝330±11.3kg)随机分成4个饮食处理。对于每个时期，重复两次处理，而其它两次处理不重复。时间长度为18天。第一个3天用于使动物在日粮之间适应，动物消耗处理日粮14天，并在最后一天收集样品。以玉米青贮饲料为基础(29.4-35.6％dm)，并采用以下组合：大麦粉(高瘤胃可降解淀粉(hs)14.1-14.8,％dm；低瘤胃可降解淀粉(ls)0.310-0.670,％dm)或玉米(hs0.00-0.380,％dm；ls10.5-12.3,％dm)以及粒化甜菜浆(高瘤胃可降解纤维(hf)3.55-6.05,％dm；低瘤胃可降解纤维(lf)30.2-32.9,％dm)或梯牧草(hf19.9-25.0,％dm；lf0.020-1.43,％dm)，以产生高瘤胃和低瘤胃可降解淀粉和纤维。如表1所述，饮食还含有大豆餐(hs-hf9.3,％dm；hs-lf17.1,％dm；ls-hf9.95,％dm；ls-lf15.3,％dm)，血餐(hs-hf3.78,％dm；hs-lf0.00,％dm；ls-hf4.37，％dm；ls-lf0.040,％dm)以及玉米麸质饲料(hs-hf3.26,％dm；hs-lf0.00,％dm；ls-hf1.65,％dm；ls-lf7.22,％dm)，使它们等氮。这些治疗组合导致对动物的不同能量供应，并且计算出的每种日粮的代谢能量(me)包括于表1。

表1.以干物质为基础表示的每种处理饮食的成分和营养组合物。

¹hs-lf＝高瘤胃可降解淀粉，低纤维处理

²hs-hf＝高瘤胃可降解淀粉，高纤维处理

³ls-lf＝低瘤胃可降解淀粉；低纤维处理

⁴ls-hf＝低瘤胃可降解淀粉；高纤维处理

样品制备和收集

将至坐骨点5cm至35cm腹侧的10cm宽区域剃毛并用倍他啶和异丙醇洗涤三次。皮下施用10ml利多卡因于5至6个径向排列在活组织检查部位外部2cm的位置。靶活组织检查部位距坐骨点20cm。通过用#20手术刀刀片穿过皮肤获得1cm切口，将20号活组织检查针(一次性核心活组织检查仪器)插入到4cm深度，并且按压针收集护套以获得样品来收集肌肉组织样品。为了获得约30mg样品，每只动物每周期收集三个活组织检查，以评价样品收集(样品质量、肌肉内的收集部位和其它未知因素)的变化如何影响结果的一致性。在收集后不称量样品，因为在农场没有分析天平。使用单丝#2缝合线密封切口部位，用异丙醇清洁，并用粘合剂绷带喷雾。在阶段1和3取样右半腱肌，在阶段2和4取样左半腱肌。

在收集后立即将结构完整的核心样品置于填充有预测试溶液的96孔板的各个孔中。测试前溶液含有30mldmem(fisherscience21-041-025)、7.5mgfungizone(fisherscience15-290-026)、0.12mg氯霉素(fishersciencebp904-100)和0.03mg氨苄青霉素(fisherscienceaaj6097714)。在收集所有样品后，将它们从预测试溶液转移至填充有刃天青测试测定溶液的96孔板的各个孔中。测试溶液与添加了1.6％(刃天青基试剂，thermoscientificy00-100)的预测试溶液相同。在活组织检查收集之前立即混合溶液，使用无菌0.22μm过滤器过滤，并在使用之前温热至37℃。

样品分析

在样品收集后，立即将活肌肉组织样品在预测试溶液中运输到实验室，转移到测试溶液中并分析。在组织收集的1小时内开始分析以确保组织存活力。当将样品转移到测试溶液中时，将测试溶液板在读板器(spectramaxm5；moleculardevices，llc，sanjose，ca)中于37℃孵育，在时间0并每15分钟分别使用530和590nm的激发和发射波长读取荧光2小时。使用softmaxpro6.1(moleculardevices,llc,sanjose,ca)定量所得的发射，并在每个时间点计算每个样品的相对荧光(标准化至时间0)。

动物期内样品一致性

在动物期内收集一式三份样品以评价从类似样品获得的动物等级的一致性。相对荧光的动物内期cv约为20％，表明需要通过蛋白质或dna含量或质量来标准化样品。尽管从消耗相同饮食的相同动物收集的样品之间存在一定程度的差异，当使用不同的个体样品时，wilcoxon秩和检验在动物的等级上没有发现显著的差异(p>0.05)，表明这种差异不会阻碍通过骨骼肌代谢活性对动物进行分级的机会。

统计分析

在每个时间点计算每个动物期的平均相对荧光。在r版3.1.0.中进行平均荧光数据的统计分析(r核心团队，2014)。将分析结构化为2个问题：1)孵育时间是否改变处理对相对nad+降低率的感知影响；以及2)2小时后可辨别的动物和处理之间的差异。为了解决第一个问题，使用线性混合效应模型来测试时间、纤维和淀粉可消化性、动物和周期如何影响标准化荧光读数。纤维、淀粉和时间是固定效应，并且还评价了这些固定效应之间的2元和3元交互作用。处理期和动物为随机效应。淀粉或纤维相互作用的显著时间将表明处理差异在整个采样周期内不一致，并且需要确定一些理想的荧光读取时间以从数据作出可靠的推断。为了解决第二个问题，使用具有固定的纤维、淀粉和动物的效应和随机的周期效应的线性混合效应模型分析来自最后时间点(2h)的数据。显著的淀粉、纤维或动物效应将表明该测定(仅使用2小时荧光时间)足够敏感以基于动物水平因素(遗传潜力或饮食)对样品分级。

时间

由于可以在多个时间点读取板，测试了时间对样品内荧光的影响(参见图5)。引起刃天青发荧光的还原反应是不可逆的，且结果是，信号随时间累积，从而允许小的短期差异随着孵育时间积累被扩大。总信号随时间线性增加(p<0.0001)，这表明组织活组织检查在整个孵育期中以恒定速率继续代谢。时间对饮食中基于淀粉(p＝0.5106)或纤维(p＝0.8072)的荧光没有不同影响，这支持了如果在2小时内的任何时间点进行评价，样品的等级是类似的结论。

饮食

当母牛处于高瘤胃可降解淀粉饮食时所取的骨骼肌活组织检查具有比当母牛喂食低瘤胃可降解淀粉饮食时所取的活组织检查更高的相对荧光(p＝0.023)。淀粉源和骨骼肌代谢活性之间的联系可以由能量利用率的变化引起。然而，与瘤胃可降解淀粉相比，用瘤胃可降解纤维更多地改变了饮食中计算的me，使得这种解释不太可能。或者，组织代谢活性随着瘤胃可降解淀粉的增加而增加可能与不同的被吸收的挥发性脂肪酸分布有关。在后吸收系统中，不同的vfa被用于具有不同效率的能量。对肌肉的近似vfa贡献取决于个体vfa代谢。少于30％的乙酸酯、40-55％的丙酸酯和最少量的丁酸酯可用于外周。在反刍动物中葡萄糖对骨骼肌的贡献是由于糖异生。丙酸盐、戊酸盐和异丁酸盐的肝摄取允许增加糖异生底物。如果不同的淀粉源有助于吸收的vfa的不同分布，则吸收的vfa分布可能有助于瘤胃可降解淀粉对骨骼肌代谢活性的影响。与驱动这种饮食效应的机制无关，结果表明该测定可用于理解定量变化的代谢效应。

动物

动物之间的比较显示，个体之间骨骼肌代谢活性不同(p＝0.003)。饮食的效果在动物中是一致的，并且动物在饮食中排名类似(参见图6)。这种一致性表明骨骼肌代谢活性的固有差异可能在各种条件下是可区别的，使得可能廉价且持久地筛选动物的与生长相关的能量消耗或在非生长动物中的保持。

反刍动物的代谢活性是在非活性、热中枢环境中的体重和代谢流量的函数。代谢流中的这些差异有助于饲料效率的可变性。个体代谢流可受遗传潜能、活性和行为、环境和母牛饲养实践的影响。参照图7，每个个体的平均骨骼肌代谢活性(表示为相对荧光)与干物质摄入(dmi)、平均日增重(adg)和计算的饲料与谷物比(f:g)配对。与adg和f:g的荧光变化相关的pearson相关系数强(adg＝0.749；f:g＝-0.783)且趋向显著(adgp＝0.0864；f:gp＝0.066)。dmi与荧光变化之间的关系的pearson相关系数较弱(0.153)且无显著性差异(p＝0.773)。

骨骼肌活组织检查代谢活性是这些年轻、快速生长的母牛生长和维持的能量消耗的指示。在这些研究中，与生长和饲料对增益率的正相关表明代谢活性的测量比维持能量消耗更受生长能量消耗的影响。取自成熟动物的样品可以更有效地解决饲料效率的遗传潜力。考虑到该测定对检测动物间差异足够敏感的事实，它可以是一种有用的筛查工具，以允许在维持时基于成熟牛的饲料效率进行遗传选择。

实施例1

以下实施例描述了鉴定具有高饲料效率的动物的方法。本发明不限于本文所述的方法和组合物。

农场主拥有一群牛并且有兴趣选择具有最高饲料效率的动物用于繁殖目的。对于每个成年动物，她获得骨骼肌组织样品并通过测量还原当量来测量代谢率。

骨骼肌组织的代谢率与饲料效率成反比，因此农民选择以最低的25％的代谢率饲养动物，这将具有最高的饲料效率。例如，对于一组100只动物，农场主选择25只具有最低骨骼肌代谢率的动物。选择第25百分位的那些动物用于繁殖目的。剩余的75％的动物不用于繁殖。

实施例2

以下实施例描述了鉴定具有高产奶量的动物的方法。本发明不限于本文所述的方法和组合物。

农民拥有一群牛并且有兴趣选择具有最高产奶量的动物用于繁殖目的。对于每个动物，他获得乳腺组织样品并通过测量还原当量来测量代谢率。

乳腺组织的代谢率与潜在的产奶量直接相关。农民先前已经进行了基于乳腺组织的特定代谢率来确定每天产生的奶量(每天的加仑)的研究。例如，代谢率为1000(每mg组织的荧光变化)或更多，则预测动物每天将产生至少6加仑的奶。2000的代谢率(每mg组织的荧光变化)或更多，则预测动物将每天产生至少9加仑的奶。3000的代谢率(每mg组织的荧光变化)，则预测动物每天将产生至少12加仑。

一半的牛的代谢率为1000(荧光变化/mg组织)或更低。只有10％的牛的代谢率为2000(荧光变化/mg组织)或更高，并且农民只选择预期每天产生至少9加仑奶的那些动物。

实施例3

以下实施例描述了用于检测药物对动物饲料效率的影响的方法。本发明不限于本文所述的方法和组合物。

农场主拥有40只牛，对确定药物a如何影响牛的饲料效率感兴趣。对于每个动物，她获得骨骼肌组织样品并通过测量还原当量来测量代谢率。她计算该组动物的平均代谢率。

她随后每天一次对20只动物施用药物a，持续两周，并对剩余的20只动物施用安慰剂。在两周结束时，她从每只动物获得骨骼肌组织样品，并通过测量还原当量来测量代谢率。她计算用药物a处理的动物组的平均代谢率和给予安慰剂的动物组的平均代谢率。

农场主计算用药物a处理将动物的平均代谢率降低20％。这也与动物的平均饲料效率的20％变化相关。

实施例4

以下实施例描述了一种用于检测药物对动物产奶量的影响的方法。本发明不限于本文所述的方法和组合物。

农民拥有100头母牛，并且有兴趣确定药物b将如何影响动物的产奶量。对于每个动物，他获得乳腺组织样品并通过测量还原当量来测量代谢率。他计算该组动物的平均代谢率。

他随后每天两次对50只动物施用药物b，持续4周，并对剩余的50只动物施用安慰剂。在四周结束时，他从每只动物获得乳腺组织样品，并通过测量还原当量来测量代谢率。她计算用药物b处理的动物组的平均代谢率和给予安慰剂的动物组的平均代谢率。

农民计算出用药物b处理使动物的平均代谢率增加10％。这与产奶量增加10％相关。

以下美国专利的公开内容通过引用整体并入本文：pct/us16/48006。

除了在此描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员从上述描述将是显而易见的。这种修改也在所附权利要求的范围内。本申请中引用的每个参考文献通过引用全文并入本文。

尽管已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是本领域的技术人员将容易明白，可以对其进行不超过所附权利要求的范围的修改。因此，本发明的范围仅由所附权利要求限定。在权利要求中引用的参考数字是示例性的，并且仅仅是为了便于由专利局进行审查，而不是以任何方式进行限制。在一些实施例中，本专利申请中给出的附图是按比例绘制的，包括角度、尺寸比等。在一些实施例中，附图仅是代表性的，权利要求不受附图尺寸的限制。在一些实施方案中，使用短语“包含”描述的本发明的描述包括可被描述为“由....组成”的实施方案，并且因此满足使用短语“由.....组成”要求保护本发明的一个或多个实施方案的书面描述要求。

在权利要求中引用的附图标记仅是为了便于审查本专利申请，并且是示例性的，而不是要以任何方式将权利要求的范围限制在附图中具有相应附图标记的特定特征。