益母草提取物及在鱼饲料中的应用、鱼饲料及其制备方法与流程

本发明涉及鱼饲料技术领域，具体涉及益母草提取物及其应用、鱼饲料及其制备方法。

背景技术：

益母草(leonurusartemisia(laur.)s.y.huf)是唇形科益母草属一年或二年生草本植物。全国大部分地区均有分布，生于山野荒地、田埂、草地等。益母草干燥地上部分为常用中药。现代药学研究结果显示，益母草富含生物碱、二萜、黄酮、多酚和多糖等物质，具有镇静、镇痛、抑菌、抗炎、抗缺氧、抗氧化、抗应激、抗疲劳、补血、活血化瘀、促凝血和提高蛋鸡产量的作用。

鱼类饲养需要大量的饲料，鱼的生长决定着鱼类的产量，因此，在现有的水产养殖和饲料加工中，常常会在饲料中添加促生长剂，促生长剂也称为生长促进剂。传统上在饲料中最常用的促生长剂有抗菌剂(如抗生素、磺胺类和呋喃类等)和激素或激素类似物。由于使用抗生素已给动物本身、动物产品以及环境带来了一系列的危害。目前我国已严格限制在水产饲料中使用抗生素。一些抗生素，如喹乙醇、正三十烷醇以及磺胺类药物等，已被明令禁用。考虑到激素对人类可能造成的危害，我国在1999年5月29日颁布的《饲料和饲料添加剂管理条例》中已明令禁止在饲料中添加肾上腺素受体激动剂、性激素、蛋白同化激素、精神药品等。从食品的安全、人类的健康和环境保护的角度来讲，开发新型、绿色环保的生长促进剂符合可持续发展的要求，是饲料业发展的必然方向，具有重要的现实意义。

为此，现有技术已开始研究将各类植物提取物用于鱼饲料添加剂，对于将益母草作为鱼饲料添加剂已有报道，但是现有的方法多是将益母草直接添加到鱼饲料中，而这种添加方式并不能很好地释放益母草的有效成分，对鱼的促生长效果有限。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：现有的益母草用于鱼饲料添加剂的有效成分不明确且利用率不高，在淡水鱼高密度养殖中的促生长效果不明显，有待根据作用机理进行进一步提高。

本发明提供了解决上述问题的益母草提取物及其在鱼饲料中的应用、鱼饲料及其制备方法。

本发明通过下述技术方案实现：

益母草提取物在鱼饲料中的应用，益母草提取物在淡水鱼高密度养殖鱼饲料中作为促生长剂。

一种益母草提取物，包括益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯提取物、益母草乙醇提取物和益母草水提取物的一种或多种，所述益母草石油醚提取物是采用石油醚对益母草进行多次提取合并得到，所述益母草乙酸乙酯提取物是采用石油醚提取后的滤渣ⅰ用乙酸乙酯多次提取合并得到，所述益母草乙醇提取物是乙酸乙酯提取后的滤渣ⅱ用乙醇多次提取合并得到，所述益母草水提取物是乙醇提取后的滤渣ⅲ用水多次提取合并得到。

一种益母草提取物，包括益母草乙酸乙酯提取物和益母草乙醇提取物中的一种或两种，所述益母草乙酸乙酯提取物是采用乙酸乙酯对石油醚提取后的滤渣i进行多次提取合并得到；所述益母草乙醇提取物是采用乙醇对乙酸乙酯提取后的滤渣ⅱ多次提取合并得到。

本发明优选一种益母草提取物，为益母草乙醇提取物。

优选地，所述益母草乙醇提取物通过以下方式获得：首先采用石油醚对益母草进行多次提取得到滤渣i，再用乙酸乙酯对滤渣i进行多次提取得到滤渣ⅱ，最后用乙醇对滤渣ⅱ进行多次提取得到合并的滤液，最后对滤液进行减压蒸馏除去乙醇而得到益母草乙醇提取物。

优选地，所述益母草提取物中黄酮类和多酚类的含量比为1.35～1.45。

进一步地，所述益母草提取物中黄酮类和多酚类的含量比为1.41。

一种鱼饲料，所述鱼饲料中所述益母草提取物的添加量占饲料总重的0.35～0.6％。

优选地，所述益母草提取物在鱼饲料中的添加量占饲料总重的0.34-0.36％。

优选地，所述鱼饲料的组成成分为：粗蛋白34～35％，粗脂肪5～6.3％，磷0.9～1.0％。

进一步，粗蛋白为34.82％，粗脂肪为5.52％，磷为0.93％。

益母草提取物作为添加剂的鱼饲料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：干燥益母草并粉碎得到益母草粉末；

步骤2：采用石油醚对益母草粉末进行多次提取，得到滤渣ⅰ和滤液ⅰ，将滤液ⅰ减压蒸馏除去石油醚得到益母草石油醚提取物；

步骤3：采用乙酸乙酯对滤渣ⅰ进行多次提取，得到滤渣ⅱ和滤液ⅱ，将滤液ⅱ减压蒸馏至恒重去除乙酸乙酯，获得益母草乙酸乙酯提取物；

步骤4：采用乙醇对滤渣ⅱ进行多次提取，得到滤渣ⅲ和滤液ⅲ，将滤液ⅲ减压蒸馏至恒重去除乙醇，获得益母草乙醇提取物；

步骤5：采用水对滤渣ⅲ进行多次提取，得到滤渣ⅳ和滤液ⅳ，将滤液ⅳ减压蒸馏至恒重去除水，获得益母草水提取物。

步骤6：将上述提取物分别添加到鱼饲料中。

优选地，分别将益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯提取物、益母草乙醇提取物和益母草水提取物加入到鱼饲料中。

优选地，所述益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯或益母草乙醇提取物添加到鱼饲料的具体操作为：将益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯或益母草乙醇提取物先溶解于鱼饲料的油脂中，再与鱼饲料的其它物料混合。

所述油脂是鱼油、大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油中的一种或几种的混合物。

优选地，所述油脂为玉米油。

优选地，所述鱼饲料的原料百分比为：

益母草提取物：0.35-0.6％

鱼粉：25％

豆粕：32％

dl-蛋氨酸：0.70％

面粉：37％

鱼油：1.5％

玉米油：1.8％

维生素添加剂：1％

矿物质添加剂：1％。

进一步地，所述维生素添加剂包括视黄醇、维生素d3、dl-α-生育酚、维生素k3、维生素b1、核黄素、吡哆醇、氰钴胺、d-泛酸钙、烟酸、d-生物素、肌醇和叶酸。

进一步地，所述矿物质添加剂包含：feso4·7h2o、cuso4·5h2o、znso4·7h2o、mnso4·h2o、na2seo3·5h2og和ki。

本发明具有如下的有益效果：

1.本发明通过将益母草提取物加入到高密度养殖的淡水鱼饲料中作为促生长剂，提高了鱼的肠道脂肪酶和淀粉酶活性，提高了肠道组织抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)以及降低肠道组织丙二醛(mda)含量，利于鱼类生长，显著提高摄食量和饲料效率。

2.本发明益母草提取物为益母草乙醇提取物，黄酮类和多酚类的含量比值为1.35～1.45，且含这两种有效成分的提取物按照0.35-0.6％的浓度加入到鱼饲料中，起到了显著的促生长和提高摄食的效果，在相同生长情况下，可以提高淡水鱼的养殖密度，提高养殖产量，减少养殖面积。

3.本发明采用多种不同溶剂对益母草进行多步提取，每一步获得的干提取物量不同且不同提取物中所含的黄酮类和多酚类物质含量也不同，通过筛选，在用石油醚和乙酸乙酯提取后再采用乙醇提取黄酮和多酚类物质的量最大，效果最好，且对黄酮类物质的提取效果好于多酚类物质的提取效果。

4.本发明通过改进益母草提取物的添加方式，首先将提取物加入到油脂中，再加入到其它饲料原料中，使得益母草提取物在饲料中的分散性好，饲料效率得到提高。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明养殖密度与鲫鱼增重的关系图。

图2为本发明养殖密度与饲料效率的关系图。

图3为本发明养殖密度与死亡率的关系图。

图4为本发明投喂益母草提取物后鲫鱼的摄食率、肠道脂肪酶和淀粉酶活性与其多酚类含量的关系图。

图5为本发明投喂益母草提取物后鲫鱼的摄食率、肠道脂肪酶和淀粉酶活性与其黄酮类含量的关系图。

图6为本发明投喂益母草提取物10天后鲫鱼肠道组织抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)和丙二醛(mda)含量与其多酚类含量的关系图。

图7为本发明投喂益母草提取物10天后鲫鱼肠道组织抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)和丙二醛(mda)含量与其黄酮类含量的关系图。

图8为本发明投喂含不同浓度益母草乙醇提取物的饲料60天后，鲫的增重回归分析图。

图9为本发明投喂含不同浓度益母草乙醇提取物的饲料60天后，鲫的摄食量回归分析图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

获得益母草地上部分1000g，50℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎过18目筛，获得益母草粉末。

取益母草粉末400g，按益母草粉末与石油醚按照1:7-9的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液过滤，获得澄清的滤液和残渣，将该残渣重复提取3次合并滤液并得到残渣ⅰ；将滤液减压蒸馏至恒重去除石油醚，获得益母草石油醚提取物。将益母草石油醚提取后的残渣ⅰ与乙酸乙酯按照1:7-9的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液过滤，获得澄清的滤液和残渣，将残渣重复提取3次合并滤液并得到残渣ⅱ；将滤液减压蒸馏至恒重去除乙酸乙酯，获得益母草乙酸乙酯提取物。按益母草乙酸乙酯提取后的残渣ⅱ与乙醇1:7-9的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液过滤，获得澄清的滤液和残渣，将残渣重复提取3次合并滤液并得到残渣ⅲ；将滤液减压蒸馏至恒重去除乙醇，获得益母草乙醇提取物；按益母草乙醇提取后残渣ⅲ与水1:7-9的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液离心，获得澄清的上清液和残渣，将残渣重复提取3次合并上清液；将上清液减压蒸馏至恒重去除水，获得益母草水提取物。

采用folin–ciocalteau试剂法和硝酸铝显色法分别测定四种益母草提取物的多酚类物质和黄酮类物质含量，结果见表1。

表1益母草提取物的获得率、黄酮类和多酚类物质含量

数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。

所述益母草石油醚提取物中，得到的黄酮类和多酚类的含量比为2.73；

所述益母草乙酸乙酯提取物中，得到的黄酮类和多酚类的含量比为1.76；

所述益母草乙醇提取物中，得到的黄酮类和多酚类的含量比为1.41；

所述益母草水提取物中，得到的黄酮类和多酚类的含量比为2.51；

从上表可以看出，不同溶剂提取获得的干提取物的获得率不同，表现为：水>乙酸乙酯>乙醇>石油醚，而不同溶剂获得的干提取物中黄酮类和多酚类物质的含量并不同，比值也不同，具体表现为：乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物，且黄酮类和多酚类的含量比也表现出1.41＜1.76＜2.51＜2.73，证明在四种溶剂中，在依次采用石油醚和乙酸乙酯提取后，再用乙醇对黄酮和多酚类物质的提取效果最好，而对黄酮类物质的提取效果优于对多酚类物质的提取效果。

而在石油醚和乙酸乙酯进行前期提取后，再采用乙醇作为溶剂对前处理得到的滤渣ⅱ进行提取，多酚类和黄酮类的提取量达到最大，分别为50.27–55.43g/kg和71.28–78.00g/kg。

实施例2

为了探究益母草提取物作为鱼饲料添加剂对淡水鱼高密度养殖的影响，作如下实验：

1.研究养殖密度变化对鱼体重、摄食量和饲料效率的影响。

在当地购得若干鲫鱼苗，在养殖室内暂养一周后，选择体重8.0±0.2g鲫鱼苗720尾，随机分为8个处理组，每组4个鱼缸，8个处理组的鱼尾数分别为：5、10、15、20、25、30、35和40尾/缸。其中，每个鱼缸的形态、大小和颜色相同，尺寸都为30cm×30cm×40cm并内置800l/h流量增氧机一台。以自来水为水源、缸内水体积为31l。控制养殖室温22±2℃；增氧机持续供氧；投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料；每2～3天换水一次，养殖期为60天。60天养殖期后，考察各处理组鱼增重、摄食量、饲料效率和死亡率。养殖密度对鲫体重和摄食量的影响见表2；养殖密度对鱼增重、饲料效率和死亡率的影响分别见图1～3，图中增重＝末重－初重；饲料效率＝100×增重/摄食量。图中的数据以4个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。

表2养殖密度对鲫体重和摄食量的影响

数据以4个重复的平均数±标准差表示；在同一指标数据中，上标字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。

由表2和图1至图3可知，在放养密度为0.16-0.48尾/l水时，鲫鱼增重最多且在该范围内，增重比较稳定；从随着养殖密度的提高，增重逐渐下降，增重最少的养殖密度为0.97-1.29尾/l水。摄食最多的放养密度为0.32-0.48尾/l水；随着养殖密度的提高，摄食量逐渐下降，摄食最少的密度为0.97-1.29尾/l水。饲料效率最高的放养密度为0.16-0.48尾/l水；随着养殖密度的提高，饲料效率逐渐下降，饲料效率最低的密度为0.97-1.29尾/l水。放养密度1.13-1.29尾/l水时，鲫鱼出现死亡。因当养殖密度为0.48尾鱼/l水时，鲫鱼的增重、摄食量和饲料效率最高，确定最佳放养密度为0.48尾/l水。随着密度的提高，鲫鱼的增重、摄食量和饲料效率逐渐降低；当鲫鱼的密度增至0.97尾/l水时，鲫鱼增重、摄食量和饲料效率下降到最低水平；进一步提高鲫鱼密度达1.13尾/l水时，鲫鱼出现死亡。在以上养殖密度梯度条件下对比，得出不引起鲫鱼死亡的最高养殖密度为0.97尾/l水。

2.研究不同提取步骤中益母草提取物对高密度养殖下鲫鱼生长的影响

第一步，按照实施例1的提取方法获得4种益母草提取物；

第二步：根据下表3的鱼饲料配方，将益母草的4种提取物按0和2g/kg饲料的浓度添加到饲料原料中混合，制成直径2mm的颗粒饲料。

表3鱼基础饲料配方

¹每千克维生素添加剂包含：视黄醇(500,000iu/g)0.80g、维生素d3(500,000iu/g)0.48g、dl-α-生育酚(50％)20.00g、维生素k3(23％)0.43g、维生素b1(90％)0.11g、核黄素(80％)0.63g、吡哆醇(81％)0.92g、氰钴胺(1％)0.10g、d-泛酸钙(90％)2.73g、烟酸(99％)2.82g、d-生物素(2％)5.00g、肌醇(99％)52.33g和叶酸(96％)0.52g。

²每千克矿物质添加剂包含：feso4·7h2o(含fe20％)69.70g、cuso4·5h2o(含cu25％)1.20g、znso4·7h2o(含zn23％)21.64g、mnso4·h2o(含mn32％)4.09g、na2seo3·5h2o(含se1％)2.50g和ki(含i4％)2.90g。

具体的制备过程为：

(1)根据基础饲料配方计算出单位质量饲料中所需鱼油和玉米油的质量，称取该质量的鱼油和玉米油，将二者混合。

(2)根据设计的饲料中提取物的含量计算出相同单位质量饲料中所需益母草提取物的质量，称取该质量的益母草提取物，将益母草提取物与以上混合油混合，超声振荡20min使其混匀；

(3)将步骤(2)所得混合物加入到相同单位质量饲料的其余组分原料中，混匀后制成直径2mm的颗粒状饲料。

第三步：选用不造成鲫鱼死亡的最高养殖密度0.97尾/l水，并采用上述鱼饲料对鱼进行鲫鱼饲养并跟踪效果。

在与上述相同养殖环境条件下，选择体重22.5±0.9g鲫鱼苗495尾，随机分为6个处理组，每组3个鱼缸。6个处理组的鲫鱼尾数分别为：15、30、30、30、30和30尾/缸，分别命名为空白、对照、益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯提取物、益母草乙醇提取物和益母草水提取物组。6个处理组分别投喂含0、0和2g/kg益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯提取物、益母草乙醇提取物和益母草水提取物的饲料。每天投喂4次，早上8：00投喂第一次，以后每隔4小时投喂一次，晚上8：00进行最后一次投喂。投喂第1天，每次0.5克/缸；以后每次投喂增加0.1克/缸；直至出现剩料不再增加投喂量。以后每天必须保证有剩料，并于每次投喂后30分钟开始迅速捞出残饵，及时烘干残饵并记录重量；等剩料消失后再增加投喂量。

投喂实验进行10d后，统计每个处理组的摄食量和鱼的体重，计算摄食率。停喂1天后，采集鱼的肠道样品，采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)法测定6个处理组肠道组织脂肪酶、淀粉酶、抗超氧阴离子(asa)和抗羟自由基活性(ahr)以及丙二醛(mda)含量。

检测结果见表4和5，结果显示投喂四种益母草提取物有利于提高鱼的摄食和肠道消化酶活性和抗氧化作用；且随着黄酮类和多酚类含量的增加，效果越明显，其中益母草乙醇提取物处理组的鱼摄食率、肠道脂肪酶和淀粉酶活性、asa和ahr最高、mda含量最低，即效果最好。

相关性分析结果见图4、5、6和7，图中数据以3个重复的平均数表示。结果显示，益母草提取物对鱼摄食、肠道消化酶活性和抗氧化作用的提高与其多酚类和黄酮类物质含量存在密切关系。是由于益母草提取物中的多酚类和黄酮类物质提高了鱼的肠道抗氧化能力而提高了鱼的消化功能，进而提高了鱼的摄食率。

表4在高密度养殖条件下，投喂益母草提取物10天后，鲫摄食率、肠道脂肪酶和淀粉酶活性

数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。

表5在高密度养殖条件下，投喂益母草提取物10天后，鲫肠道抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)和丙二醛(mda)含量

数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。

由此可知，虽然添加了相同量的益母草石油醚提取物、益母草乙酸乙酯提取物、益母草乙醇提取物和益母草水提取物，但是由于不同溶剂提取黄酮类和多酚类物质的量不同，得到的提取物中黄酮类和多酚类物质的含量比不同，最终对高密度养殖条件下鲫鱼的生长影响也不同。具体表现为：益母草乙醇提取物中有效成分黄酮类和多酚类含量最多，黄酮类和多酚类含量比为1.41，对鲫鱼消化功能和摄食率提高最多，促生长效果最好。

3.研究益母草乙醇提取物在鱼饲料中不同添加量对鲫鱼生长的影响

由于益母草乙醇提取物中黄酮类和多酚类含量最高，黄酮类和多酚类含量比为1.41，效果最好，选择该提取物作为鱼饲料添加剂，按第三步的方法将益母草乙醇提取物分别按0、1、2、3、4、5和6g/kg的浓度添加到饲料中，制成相应的7种颗粒饲料，在放养密度0.97尾/l水和上述相同的养殖环境下，选择体重6.40±0.19g鲫鱼苗900尾，随机分为8个处理组，每组4个鱼缸。8个处理组的鱼尾数分别为：15、30、30、30、30、30、30和30尾/缸，分别命名为空白、对照、1g、2g、3g、4g、5g和6g组。8个处理组分别投喂含0、0、1、2、3、4、5和6g/kg益母草乙醇提取物的饲料。60天后，测定投喂益母草乙醇提取物对鲫生长、摄食量和饲料效率的影响并进行折线回归分析。

结果见表6、图8和9，图中数据以4个重复的平均数±标准差表示。

表6在高密度养殖条件下，投喂益母草乙醇提取物(ee)60天对鲫生长、摄食量和饲料效率的影响

数据以4个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。增重＝末重－初重；饲料效率＝100×增重/摄食量。

结果显示益母草乙醇提取物提高了鲫鱼的增重、摄食量和饲料效率，且随着益母草乙醇提取物添加量的提高，增重、摄食量和饲料效率逐渐提高，通过在鱼饲料中添加不同浓度的益母草乙醇提取物，相对对照组，增重率增加了43～133个百分点，摄食量增加了11.4～33.6个百分点，饲料效率增加了6～17.5个百分点。但是当添加量增加到一定量后，增重、摄食量和饲料效率增幅大幅减小，通过回归分析，从促生长的效果和经济性考虑，益母草乙醇提取物添加量3.49g/kg为最优添加量，而从摄食量和经济性考虑，添加饲料的益母草乙醇提取物添加量3.55g/kg为最优添加量，因此，综合以上结果，优选益母草乙醇提取物在鱼饲料中的最佳添加量为3.49-3.55g/kg，对鲫鱼养殖的综合效应最好。

本发明改善了由于高密度养殖对鲫鱼带来的生长缓慢和摄食率降低的问题，在添加了益母草乙醇提取物之后，在相同的鲫鱼生长条件下可以提高养殖密度，利于提高养殖产量，减少养殖面积。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。