本发明属于功能性食品添加剂
技术领域：
，尤其涉及一种荷叶中抑制晚期糖基化产物形成活性组分的制备方法。
背景技术：
：晚期糖基化产物（ages）是蛋白质的游离氨基与还原糖的羰基经糖基化反应产生的一类有害化合物的总称，可分为荧光性（如戊糖素）和非荧光性产物（如羧甲基赖氨酸（cml）、羧乙基赖氨酸（cel）等）。ages易在体内积累，可导致蛋白质、脂类和dna结构和功能的改变，有“糖毒素”之称，是ⅱ型糖尿病、糖尿病并发症、动脉粥样硬化、老年痴呆症、尿毒症、白内障和衰老等慢性疾病发生的重要因素。膳食是人体内ages最主要的来源，高蛋白高脂肪类食品和高碳水化合物高油脂食品在蒸煮、油煎、油炸、烘烤、热处理等条件下和储存过程中均会产生较多的ages。有效控制食品加工过程中ages的产生以提高食品的安全与品质对提升人民的健康水平和食品工业的发展均具有重要意义。添加ages抑制剂是抑制食品加工和贮藏过程中ages形成的有效方法。荷叶（nelumbonuciferaleaf）为我国有名的药食两用资源，具有清暑利湿、清心去热、止血利水等功效。研究表明，荷叶提取物具有降脂减肥、抗炎、抗氧化、抗癌、降血压、抑制动脉粥样硬化和抗糖尿病等作用，黄酮类化合物为其主要活性成分，其次为酚酸。但目前还没有文献报道从荷叶中制备抑制蛋白非酶糖基化过程中晚期糖基化产物形成的活性组分的工艺。技术实现要素：本发明提供了一种荷叶中抑制晚期糖基化产物形成活性组分的制备方法，包括以下步骤：（1）将荷叶粉碎，得到荷叶颗粒；（2）以亲水性有机溶剂为提取剂，采用溶剂提取法处理荷叶颗粒得到提取液；再将提取液浓缩干燥，得到荷叶粗提取物；（3）用水溶解荷叶粗提取物配制为荷叶粗提取物水溶液，采用柱层析法进一步提纯，得到抑制ages形成的活性组分。进一步地，所述步骤（1）中的荷叶为干燥的荷叶。进一步地，所述步骤（2）中的亲水性有机溶剂为体积浓度为50%～100%的乙醇的水溶液，所述亲水性有机溶剂的加入量与荷叶颗粒比例为1g:10ml～40ml。进一步地，在所述步骤（1）中的所述荷叶颗粒中参入五味子果肉干粉，五味子果肉干粉和荷叶颗粒的质量比五味子果肉干粉/荷叶颗粒=5～8:100；亲水性有机溶剂中参有甘氨酸和琥珀酸，甘氨酸和琥珀酸比亲水性有机溶剂的浓度分别为甘氨酸3～5g/300ml亲水性有机溶剂，琥珀酸0.8～1g/300ml。进一步地，所述步骤（2）中的溶剂提取法为超声波提取，超声提取时间为20min～60min，超声功率为300～500w。进一步地，所述步骤（3）中柱层析法的条件为：以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为1～3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为12小时；用20～100%乙醇为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为1～3bv/h。进一步地，所述大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇或甲醇浸泡，再用乙醇或甲醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为2%～4%hcl溶液浸泡，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为2%～4%naoh溶液浸泡，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂，大孔吸附树脂进行预处理所用乙醇或甲醇、hcl溶液、naoh溶液浸泡时间皆为2~8小时。因此，通过上述技术方案可知，本发明的有益效果在于：本发明的荷叶提取物制备方法简单、得率高、成本低；此方法操作简单，容易实现。制得的ages形成抑制组分含量较大，且抑制效率高，抑制效果良好，具有很高的实用价值；其原料为天然产物，毒副作用小。具体实施方式下面结合实施例进行详细的说明：称取300g干荷叶粉末（颗粒），以乙醇体积分数70%的酒精溶液按料液比1：20（g/ml）的比例超声浸提干荷叶粉末。超声条件为400w、室温超声提取40min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：20（g/ml）的比例添加乙醇体积分数70%的酒精溶液，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。分别独立地用20%~100%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积均为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集各洗脱组分，浓缩成膏状，称量各组分的质量，计算样品提取物的得率。样品提取物得率见表1。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。表1大孔树脂洗脱各组分得率洗脱乙醇浓度重量得率（%）20%乙醇2.130.7140%乙醇3.891.3060%乙醇4.611.5480%乙醇1.650.55100%乙醇0.790.26评价抑制活性：由上述实施例中所得的ages形成抑制组分在体外对voa的抑制实验叙述如下：果糖和ova为原料。具体实验方法如下：将各组洗脱浓缩后的样品提取物分别溶解在蒸馏水中配置成样品提取物浓度为0.2mg/ml的样品溶液，将100µl样品溶液与1ml糖基化体系（0.5ml20mg/ml的果糖溶液和0.5ml20mg/mlova）混匀，55℃反应24h后在激发波长370nm，发射波长440nm测荧光值，实验重复测三次。酶抑制作用计算公式为：ac为样品溶液用100μl70%乙醇替代的反应体系的荧光值；ab为10mg/ml果糖溶液和提取物均用缓冲溶液代替的反应体系的荧光值，as为添加了提取物的糖基化体系的荧光值。按规定方法进行实验，最终结果如下所示。表2大孔树脂洗脱各组分抗蛋白糖基化抑制活性洗脱组分抑制率（%）20%乙醇0.0540%乙醇39.3060%乙醇52.2980%乙醇63.87100%乙醇-19.26从上表可以看出，80%乙醇-水溶液洗脱组分抑制ages形成的效果最佳，为63.87%，该活性组分的重量占荷叶原料重量的1.65%。实施例1将新鲜采摘的荷叶洗净后晒干，用粉碎机粉碎后过20目筛，称取300g过筛后的干荷叶粉末（颗粒），以乙醇体积分数50%的酒精溶液按料液比1：10（g/ml）的比例超声浸提干荷叶粉末。超声条件为300w、室温超声提取20min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：10（g/ml）的比例添加乙醇体积分数50%的酒精溶液，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。用80%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集洗脱组分，浓缩成膏状，即获得本实施例的样品提取物。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。实施例2将新鲜采摘的荷叶洗净后晒干，用粉碎机粉碎后过20目筛，称取300g过筛后的干荷叶粉末（颗粒），以乙醇体积分数60%的酒精溶液按料液比1：20（g/ml）的比例超声浸提干荷叶粉末。超声条件为400w、室温超声提取30min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：20（g/ml）的比例添加乙醇体积分数60%的酒精溶液，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。用80%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集洗脱组分，浓缩成膏状，即获得本实施例的样品提取物。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。实施例3将新鲜采摘的荷叶洗净后晒干，用粉碎机粉碎后过20目筛，称取300g过筛后的干荷叶粉末（颗粒），以乙醇体积分数80%的酒精溶液按料液比1：30（g/ml）的比例超声浸提干荷叶粉末。超声条件为400w、室温超声提取50min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：30（g/ml）的比例添加乙醇体积分数80%的酒精溶液，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。用80%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集洗脱组分，浓缩成膏状，即获得本实施例的样品提取物。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。实施例4将新鲜采摘的荷叶洗净后晒干，用粉碎机粉碎后过20目筛，称取300g过筛后的干荷叶粉末（颗粒），用乙醇按料液比1：40（g/ml）的比例超声浸提干荷叶粉末。超声条件为500w、室温超声提取60min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：40（g/ml）的比例添加乙醇，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。用80%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集洗脱组分，浓缩成膏状，即获得本实施例的样品提取物。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。对比例1将新鲜采摘的荷叶洗净后晒干，晒干后的荷叶与五味子果肉干混合，混合质量比五味子果肉干粉/荷叶颗粒=6:100；混合物用粉碎机粉碎后过20目筛，称取300g过筛后的粉末，以乙醇体积分数70%的酒精溶液按料液比1：20（g/ml）的比例超声浸提粉末。超声条件为400w、室温超声提取40min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：20（g/ml）的比例添加乙醇体积分数80%的酒精溶液，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。用80%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集洗脱组分，浓缩成膏状，即获得本对比例的样品提取物。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。对比例2将新鲜采摘的荷叶洗净后晒干，晒干后的荷叶与五味子果肉干混合，混合质量比五味子果肉干粉/荷叶颗粒=6:100；混合物用粉碎机粉碎后过20目筛，称取300g过筛后的粉末，用提取剂按料液比1：20（g/ml）的比例超声浸提粉末，本对比例所述的提取剂为乙醇体积分数70%、甘氨酸浓度为4g/300ml、琥珀酸浓度为0.8g/300ml的水溶液。超声条件为400w、室温超声提取40min，然后抽滤，收集清液，残渣再按料液比1：20（g/ml）的比例添加提取剂，分别在上述相同条件下重复提取、抽滤2次，合并3次清液，浓缩成膏状。按料液比为500mg/ml将粗提物浸膏分散于蒸馏水中，离心后取上清液得上样溶液，以经过预处理的大孔吸附树脂为固定相，上样量为0.5bv，上样流速为3bv/h，吸附方式为静态吸附，吸附时间为10小时。用80%乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱体积为3bv，洗脱流速为3bv/h。收集洗脱组分，浓缩成膏状，即获得本对比例的样品提取物。其中，大孔吸附树脂进行预处理的方法为：将大孔吸附树脂用乙醇浸泡5h，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用去离子水洗至无醇味，后用溶质质量百分含量为3%hcl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，再用溶质质量百分含量为3%naoh溶液浸泡5h，再用去离子水洗至清洗后液呈中性，得到处理后的大孔吸附树脂。将上述实施例1～4和对比例1～2所得各组样品提取物分别溶解在蒸馏水中配置成样品提取物浓度为0.2mg/ml的样品溶液，分别将100µl样品溶液与1ml糖基化体系（0.5ml20mg/ml的果糖溶液和0.5ml20mg/ml）混匀，55℃反应24h后在激发波长370nm，发射波长440nm测荧光值，实验重复测三次。计算各组分抗蛋白糖基化抑制活性，结果如表3所示。表3试验组抑制率（%）实施例158.76%实施例260.69%实施例363.38%实施例461.10%对比例179.82%对比例282.33%对比实施例2和对比例1可知，在荷叶干中混入五味子果肉干复合提取后，获得的提取物抗蛋白糖基化抑制活性有所提高，对比对比例1和对比例2可知，乙醇、甘氨酸、琥珀酸混合水溶液作为提取液比单纯的酒精提取效果要好，表现为产物抑制活性得到进一步改善。以上对本发明所提供的技术方案进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。当前第1页12