本发明涉及水产食品保鲜技术领域，尤其涉及一种基于鱼鳞蛋白酶解物的冷冻保鲜剂及制备方法和应用。
背景技术：
冻藏作为一种常用的水产品保鲜方式，使水产品中90％以上水分冻结，酶活性和微生物生长几乎完全受到抑制，从而使其得以长期保藏。然而，水产品在冻藏过程中会出现品质下降、干耗、蛋白变性、脂肪氧化等现象。镀冰衣作为一种有效的减少干耗，保护水产品的贮藏手段，被广泛应用于水产品冷冻保存中。镀冰衣在冻藏期间能有效减缓质构的劣变，但随着贮藏时间的延长，简单镀冰衣水产品通常出现颜色变化，蛋白质氧化、保水性下降等现象。此外，随着人们健康意识逐渐加深，开始关注保鲜剂成分残留问题，因此化学保鲜这一方法的发展受到一定的限制。天然生物保鲜剂凭借安全健康、水溶性好，对水产品品质影响小，能保持水产品较好的风味而更受欢迎。目前还没有利用鱼鳞酶解物作为鱼片天然保鲜剂及其应用的报道。
技术实现要素：
本发明在现有水产品镀冰衣保鲜的研究基础上，结合鱼体自身产物鱼鳞的特点，利用鱼鳞为原料，应用生物酶解技术制备了具有抗氧化和抗冻功能的冷冻保鲜剂，将冷冻保鲜剂应用于镀冰衣的鱼片中，鱼片冻藏9个月后，产品品质保持较好的水平，感官品质保持新鲜鱼肉的92％以上，显著优于纯水镀冰衣或茶多酚的鱼片。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种基于鱼鳞蛋白酶解物的冷冻保鲜剂，其通过将鱼鳞经复合蛋白酶酶解而得到，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶。
优选的，上述冷冻保鲜剂中，以所述鱼鳞的干物质质量计，所述复合蛋白酶的添加量为0.05～0.5％，优选为0.1～0.3％。
优选的，上述冷冻保鲜剂中，所述复合蛋白酶中，所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为0.8～1.2：1～2：1～2：1。
优选的，上述冷冻保鲜剂中，所述鱼鳞为罗非鱼鱼鳞或草鱼鱼鳞。
本发明还提供了上述冷冻保鲜剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鱼鳞与水混合，得到鱼鳞-水混合物；
(2)将所述鱼鳞-水混合物依次经热处理、振动筛过滤、超声处理后，得到浆液；
(3)将所述浆液进行所述复合蛋白酶酶解，即得。
优选的，上述制备方法中，步骤(1)中，以鱼鳞的干物质质量计，所述水的用量为400～500wt％；
和/或，步骤(2)中，所述热处理的温度为115～121℃；
和/或，步骤(2)中，所述振动筛的目数为30～60目；
和/或，步骤(2)中，所述超声处理的频率为80～100kh，超声处理的时间为10～15min，超声处理的温度为75～85℃。
优选的，上述制备方法中，步骤(3)中，所述酶解包括以下步骤：
向所述浆液中加入所述复合蛋白酶，先在45～55℃下酶解0.5～1.0h，然后在90～95℃下保温15～20min。
优选的，上述制备方法中，步骤(3)中，所述酶解后，还包括过滤和将所得滤液调节为蛋白含量为1.5～2wt％的悬浮液的步骤。
本发明还提供了上述冷冻保鲜剂或上述制备方法制备得到的冷冻保鲜剂在鱼肉的冷冻镀冰衣贮藏保鲜中的应用。
优选的，上述应用中，首先将鱼肉经过在-35～-40℃环境下冷冻至温度为-18～-23℃，然后将冷冻的鱼肉浸没于所述冷冻保鲜剂中10～15s，冰衣含量控制在15～20％，得到镀冰衣的鱼肉，真空包装后冻藏。
本发明所取得的有益效果：
(1)本发明的基于鱼鳞蛋白酶解物的冷冻保鲜剂中没有添加任何化学物质，能广泛作为水产食品天然保鲜剂；
(2)本发明的基于鱼鳞蛋白酶解物的冷冻保鲜剂采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+风味蛋白酶)，在温和条件下，经过适度酶解获得特定功能的鱼鳞蛋白肽，为100％鱼鳞蛋白肽；
(3)本发明的基于鱼鳞蛋白酶解物的冷冻保鲜剂生产工艺简单，鱼鳞不需要脱灰处理、不需要分离纯化，生产成本低，具有较好的抗冻、抗氧化功能；
(4)本发明的基于鱼鳞蛋白酶解物的冷冻保鲜剂用于鱼片的贮藏保鲜，具有显著的保鲜效果，产品贮藏9个月后，产品感官品质保持在92％以上。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
本发明中，所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。以下实施例中，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶均购自novozymes公司，胰蛋白酶购自sigma公司。
实施例1
(1)用新鲜罗非鱼鱼鳞1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼鳞,鱼鳞清洗后加入鱼鳞重量5倍的水，在121℃的条件下煮制60分钟，然后用40目震动筛过滤，将温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kh)处理15分钟，得到鱼鳞浆液；
(2)按照鱼鳞重量0.2％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，蛋白酶由(碱性蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+风味蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1：2：1)，在50℃的条件下进行酶解反应1.0h，将温度调整到95℃，保持15分。用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到2wt％，冷却至0℃；
(3)罗非鱼宰杀后，去内脏，取鱼片，用水漂洗后沥干，经过-40℃冷库中冷冻至温度为-18℃，将冷冻的鱼片浸没于步骤(2)0℃的液体中15s，冰衣含量控制在约17％，得到镀冰衣的鱼片；
(4)镀冰衣的鱼片装入聚乙烯封口袋中，真空包装置于-40℃冷库中冷冻至温度为-15℃后，于-23℃冷库冷冻。
对比例1
对比例1与实施例1的罗非鱼鱼片的镀冰衣方法相同，不同点仅在于：所镀液体为2wt％茶多酚液。
对比例2
对比例2与实施例1的罗非鱼鱼片的镀冰衣方法相同，不同点仅在于：所镀液体为纯水。
对比例3
对比例3与实施例1相比，其区别仅在于：蛋白酶由单一的碱性蛋白酶组成。
实施例2
(1)选用冷冻的草鱼鱼鳞，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼鳞,鱼鳞清洗后加入鱼鳞重量4倍的水，在121℃的条件下煮制120分钟，然后用30目震动筛过滤，将温度调整到85℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kh)处理10分钟，得到鱼鳞浆液；
(2)按照鱼鳞重量0.1％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，蛋白酶由(碱性蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+风味蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：2：1：1)，在55℃的条件下进行酶解反应0.5h，将温度调整到90℃，保持20分，用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到2wt％，冷却至0℃；
(3)草鱼宰杀后，去内脏，取鱼片，用水漂洗后沥干，经过-35℃冷库中冷冻至温度为-18℃，将冷冻的鱼片浸没于步骤(2)0℃的液体中12s，冰衣含量控制在约16％，得到镀冰衣的草鱼鱼片；
(4)镀冰衣的草鱼鱼片装入聚乙烯封口袋中，真空包装置于-35℃冷库中冷冻至-15℃，于-23℃冷库冷冻。
对比例4
对比例4与实施例2的草鱼鱼片的镀冰衣方法相同，不同点仅在于：所镀液体为2wt％茶多酚液。
对比例5
对比例5与实施例2的草鱼鱼片的镀冰衣方法相同，不同点仅在于：所镀液体为纯水。
实验例鱼片品质的测定
1、蒸煮损失率的测定
鱼片解冻后，称一定重量的鱼肉装入保鲜袋中，排出空气并封口，于85℃水浴锅中煮20min后取出，室温冷却10min，用滤纸擦干后再次称重，计算蒸煮损失率。
蒸煮损失率(％)＝(蒸煮前鱼肉重-蒸煮后鱼肉重)/蒸煮前鱼肉重*100
2、二硫键含量的测定参照benjakul等人(foodchemistry,2003,80(4):535-544.)的方法。
二硫键含量计算公式为:二硫键含量＝a×d/(c×b)，其中a表示吸光值，b表示待测液蛋白浓度(mg/ml)，c表示摩尔吸收系数，其值为13600mol-1·cm-1·l，d为稀释倍数，本实验为1.25。
3、羰基含量的测定：
羰基含量的测定使用dnph法(oliver，1987)。将1ml肌原纤维蛋白溶液(2mg/ml)中加入等体积的10mmdnph-hcl溶液于暗处反应1h。反应完毕后加入10％(w/v)三氯乙酸溶液终止反应并在10,000g条件下离心5min。弃去上清液后，沉淀中未反应的dnph用乙醇/乙酸乙酯(1：1，v/v)溶液洗涤三次。洗涤后的沉淀用3ml6m盐酸胍溶解并于37℃水浴锅中孵育15min。待溶液恢复至室温后，在370nm条件下测定溶液的吸光度值(a370)。使用2,4-二硝基苯腙的摩尔消光系数(22,000m-1cm-1)计算羰基含量，羰基含量表示为nmol/mg蛋白。
羰基含量计算公式为:羰基含量(nmol/mg蛋白)＝(od(370nm)-空白)/(22*浓度(mg/ml))×125×10×5。
4、参照sc/t3032-2007标准水产品中挥发性盐基氮的方法，采用半微量蒸馏法测定挥发性盐基氮。称取5.00g绞碎的鱼肉置于100ml的烧杯中，加入100ml蒸馏水，搅拌30min后用中速滤纸过滤，收集滤液。取5ml滤液与5ml10g/l氧化镁混悬液在消化管中迅速混合，以盛有10ml20g/l硼酸及5-6滴甲基红-次甲基蓝混合指示剂的锥形瓶作为接受器，利用凯氏定氮仪蒸馏5min。用0.010mol/l的盐酸标准溶液滴定吸收液，以蓝紫色作为滴定终点。同时，以等量蒸馏水替代滤液进行空白试验。
5、参照fan等(foodchemistry,2008,108(1):148–153.)的方法测定k值。取1.00g绞碎的鱼肉置于研钵中，加入2ml10％冷高氯酸研磨，在6000rpm的条件下离心5min，上清液留存待用，残渣用2ml5％冷高氯酸洗涤并离心两次，合并三次上清液。用10mol/lnaoh溶液、1mol/lnaoh溶液及5％的高氯酸溶液调节上清液ph值至6.40±0.05，6000rpm离心5min，残渣用ph6.4的高氯酸洗涤，合并上清液并定容至10ml。样液经0.22μm的水系滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪测定，所用色谱柱为cosmosil5c18-paq(4.6×250mm)，流动相为ph6.8的磷酸盐缓冲液，检测波长为254nm，进样量为50μl，流速为1ml/min。根据标准曲线及峰面积计算atp关联物的浓度。k值的计算公式如下：
6、感官评价的测定
任意选鱼片10片，由受专门培训的感官评定小组(15人)根据表1对鱼肉感官品质综合评分，最后取平均值。以五项指标成绩加和作为最终感官评价结果，25表示绝对新鲜，12表示已发生较明显的品质劣变。
表1鱼片感官评价标准
本实验例对不同处理鱼片冻藏9个月后的主要品质指标进行比较，结果见表2，其中，新鲜鱼片是指刚宰杀、未冻结的鱼片，不镀冰衣组是指没有镀冰衣冻藏9个月的鱼片。
表2不同处理鱼片冻藏9个月后主要品质指标比较
上述结果说明，本发明实施例1制得的罗非鱼鱼鳞和草鱼鱼鳞的冷冻保鲜剂及利用其进行镀冰衣的罗非鱼鱼片和草鱼鱼片经过9个月冻藏后，其感官评价达到23.0分，感官品质保持在92％以上，蒸煮损失率低于12％，二硫键含量小于3.0mol/105g，羰基含量小于1.5nmol/mg蛋白，挥发性盐基氮小于8mg/100g，显著优于纯水冰衣组和不镀冰衣组，也优于镀2％茶多酚液冰衣组。可见本发明开发的鱼体自身鱼鳞冷冻保鲜剂能够显著延长罗非鱼鱼片和草鱼鱼片的保存期的品质，并在抗氧化和抗冻方面效果显著。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。