子宫内膜功能或相关功能的改善的制作方法

专利名称：子宫内膜功能或相关功能的改善的制作方法
发明的领域本发明特别涉及改变哺乳动物子宫内膜组织之一种或多种特性的方法。
发明的背景子宫内膜生理学胚脂逐渐植生于哺乳动物子宫中需要两个主要过程首先，准备子宫内膜以使之对胚泡的存在有反应，然后胚泡即可植入并通过胎盘形成而获得营养支持；其次，改变子宫肌层活性使之一定处于静止状态，从而允许胚泡逐渐定居在子宫腔内而没有被排出的危险。这两个过程都受到妊娠激素作用的控制，其中特别重要的是雌激素和孕酮。这些类固醇激素通过其定位于靶细胞核中的受体作用于子宫内膜和子宫肌层。一旦被激活，类固醇一核受体复合物即与DNA内的特定区域相互作用，以刺激、阻遏或去阻遏编码蛋白质及肽如酶或生长因子的基团。
借助一系列生物化学和生物物理学改变的级联过程原始胚胎植入。粘附分子(例如CAM 105)在胚泡附着于子宫壁上的早期阶段即已卷入了这一过程。此后，胚泡和子宫内膜采取各种策略以改善胎儿和母体组织间的密切联系。在有蹄动物中，形成胚泡之最外层的滋养层细胞迁移到它们继后与之融合的子宫上皮中。细胞迁移是在妇女子宫中发生的一个进一步的步骤，因为它不仅是发生迁移的离体或特异细胞类型，而且是滋生于子宫上皮细胞之间的大面积的滋养层细胞。为此目的，一些滋养层细胞融合在一起形成合胞体。该过程很迅速，并且胚胎在子宫上皮没有太多明显退化的情况下逐步植生于子宫组织中。在某些种属动物延迟了植入过程，以便等待可确保新生动物在一年内有利时间出生的环境预示信号，或者有鉴于如哺乳这样的生理学因素，以便母亲能在下一次怀孕确立之前使前一窝仔畜完成断奶。
子宫为植入进行的准备是通过分泌卵巢激素来调节的。受精卵通过输卵管的输送必须是按照精确的时间程序进行的，以使之能够在发育的正确时间，并且在子宫处于能接受胚胎的适宜状态时到达子宫内。在大多数条件下子宫对胚胎是不友好的，而且事实上比身体的某些其他区域更不友好。在多数状态下，子宫的上皮衬层阻止北养层细胞的附着和侵入，而只有在十分精确的体液状态下这种抗性才得以缓和。
就小鼠和大鼠来说，由于未交配的动物没有形成以渐增量产生孕酮的正常分泌的基体，所以它们没有完整的发情周期。如果在发情期交配，即当卵泡(从中排出卵细胞)分泌高水平雌激素时交配，将代替破裂的卵泡而形成黄体，然后由之分泌增高浓度的孕酮，开始植入并继续妊娠(时间长度21天)。如果发生未受孕交配，虽然出现相似过程，但黄体只持续存在大约11天并进而终止假妊娠。
已十分深入地研究了小鼠的大鼠子宫内膜中发生的细胞和生化改变，而且近年来关于妇女体内这些方面的研究资料也已大为增加。在所有品种的哺乳动物中，子宫内膜都是由三种主要组织构成的腔上皮、腺上皮和基质。在这三种组织中，细胞增殖发生在不同的时间。腔细胞在由卵巢中卵泡产生的高水平雌激素影响下，恰于动情期之前(动情前期)增殖。到妊娠第1天(啮合动物交配日)，细胞停止分裂，但其后到第3天又出现虽然较小但很突然的第二次分裂。颗粒细胞增殖在第4天最活跃，然后减弱。基质细胞在第4天前一直没有增殖，但其后在孕酮的影响下，于第5天达到高度增殖。在妇女体内有关这些预示植入过程的改变所知不多，但同小鼠和大鼠一样，在卵泡期内上皮细胞虽然是呈峰值增殖，而基质细胞则在黄体期或分泌期呈峰值增殖。
有关子宫膜细胞增殖的目的尚未完全阐明，但据信是通过增加那些将发挥营养和分泌功能(腺上皮)及参与最早期胎盘形成(绒毛膜脱膜)过程的细胞数目，为植入而准备子宫内膜。作为成功地植入的先决条件，细胞有丝分裂可向着细胞分化的方向进行，并因此在确立妊娠的早期过程中发挥关键性作用。支持这种作用的证据是子宫内膜产生生长因子(分裂素)、细胞因子和核致癌基团。这些化合物中，许多都是在对通过其受体起作用的卵巢激素的反应中，以逐增量产生的。
在生长因子中，同前特别关注的是表皮生长因子(EGF)、肝素结合的表皮生长因子(HBEGF)、双调蛋白及胰岛素结合的生长因子(IGF-1或IGF-II)。最近在小鼠中进行的实验已提供了其中至少一种生长因子，即双调蛋白之局部(旁分泌)作用重要性的证据。抗孕酮剂RU 486抑制了植入特异性的和孕酮调节的双调蛋白基因，并由此导致植入不能进行(Das等人，分子内分泌学9，691-705，1995)。
在细胞因子中，又根据基因剔除实验结果发现，白血病抑制因子(LIF)和集落刺激因子(CSF)(它们也是在植入时由小鼠子宫产生的)是必不可少的，证明除去这些因子是不能与植入和正常胎盘形成共容的(Stewart等人，自然359，76-79，1992；Pollard等人，发育生物学148，273-283，1991)。
在核致癌基因中，发现投用雌激素后在子宫中c-jun和c-fos水平(为基因转录的早期指标)增加，而且受到孕酮的抑制。
在植入时，各不同种哺乳动物间的滋养层细胞侵入程度存在重要差异。在妇女体内，早期滋养层是高度侵入性的，而猪则没有侵入形式的植入，在整个三个月妊娠期间子宫内膜上皮从未被破坏。两者的植入失败率分别达到60％和30％。这种高失败率的原因很复杂，而且尚未完全弄清楚。在妇女中，约有半数是由于遗传异常，但猪则如其他有蹄哺乳动物一样，虽植入失败率也较高，但只有较小比例是因遗传缺陷所致。
在妇女受精卵植入失败后，如同正常月经周期结束时一样因孕酮分泌下降而引起出血；这种情况在大多数其他动物中则没有。月经失调及植入异常是很常见的。此外，因系列激素治疗，或与连续联合激素替代治疗或投用长效单一孕酮避孕药结合引起的月经出血，也是妇女健康不佳的重要原因。
这种出血的基本原因是目前许多有关生物化学(如前列腺素、酶、肽和蛋白质、血管活性化合物如血小板活化因子PAF，以及血管内皮生长因子VEGF)和细胞机制(例如细胞向产生免疫抑制化合物的子宫内的迁移)研究的焦点。
目前对生殖过程的了解主要集中在控制类固醇激素产生和这些激素对其靶组织的作用上。尽管是与类固醇相互作用的，但已越来越多地看到旁分泌和自分泌因子是生殖功能的关键性介导物(Benton，1991细胞生物学的现行看法3，171-175；Rozengurt，1992细胞生物学的现行看法4，161-165；Tartalcovsky等人，1991发育生物学146，345-352；Robertson等人，1992免疫学的现行看法4，585-590；Smith，1994人类生殖9，936-946；和Tabibzadeh，1994人类生殖9，947-967)就这一点，一个最明确的例子见于卵巢切除的小鼠。在该模型中，子宫在对单剂雌二醇的反应中经历显著生长过程。而这种效应可被抗TGFα抗体阻断(TGF是“转化生长因子”)，此提示雌激素在该组织中的促有缘分裂效应是由TGFα介导的(Nelson等人，1992内分泌学131，1657-1664)。
因此如科学中的药物干预主要是建立在对子宫进行类固醇/抗类固醇调节的基础上(Yen & Jaffe，1991，见于“生殖内分泌学”，Eds.Yen，Jaffe& Benton，Pub.WB Saunders，Philadelphia；Baird，1993英国医学公报49，73-87)。尽管这一研究获得了不容置疑的成功，但20年来在避孕技术上未取得开创性进展，没有确定改善植入的手段，在促进胎盘生长和发育方面没有取得进展，而且没有找到治疗良性妇科疾病(月经失调和子宫肌瘤)的新方法。
已发表了许多有关在哺乳动物体内使用“基因转移”方法改变某些组织中至少某些细胞之基因型的元素。特别是，已知可向接受体内导入核酸序列，通过表达由所导入的核酸序列编码的多肽来克服接受体的遗传缺陷，从而试图对人进行“基因治疗”。已进行了基因治疗试验，例如将DNA序列(预先掺入病毒载体内)导入囊性纤维化患者的呼吸道内，以便改变患者呼吸道内壁上至少某些上皮细胞的表型。迄今，还没有公开发表过有关无论使用什么样的适当技术将DNA导入哺乳动物子宫内膜中的尝试。
发明的概要一个方面，本发明提供通过将核酸导入哺乳动物个体生殖道的至少某些细胞中，以改变所说细胞的一种或多种特征的方法。
第二个方面，本发明提供含有核酸的，用于改变哺乳动物个体生殖道之至少某些细胞的一种或多种特征的组合物。
第三个方面，本发明提供含有核酸的组合物在改变哺乳动物个体生殖道之至少某些细胞的一种或多种特征中的应用。
第四个方面，本发明提供含有核酸的组合物在制备用于改变哺乳动物个体生殖道之至少某些细胞的一种或多种特征的物质中的应用。
第五个方面，本发明提供创造用于改变哺乳动物个体生殖道之至少某些细胞的一种或多种特征的组合物的方法。
决不能将本发明简单地看作是已知的， 当应用可囊性纤维化患者的肺时已至少获得部分成功的基因治疗技术的显而易见的延伸。遗传性基因功能失调不是所有已知子宫内膜疾病的原因，所以不会激发本领域技术人员将基因治疗技术应用于子宫内膜。此外，与肺上皮(其为复层的)相比，子宫内膜上皮是属于不同类型的(立方上皮，从体腔上皮衍化的)，因此不能推测其以类似方式起作用。再者，至少在灵长类动物中，子宫内膜上皮有周期性脱落，从而可能导致被转化之细胞的丢失。最后，本发明人已发现被导入的DNA没有转移到母体的器官中，也没有转移到胚胎的胎盘中，两种情况可能都出现了并且已导致了实际操作上的困难。
一般是将核酸导入雌性哺乳动物(较好是女人)体内，特别是导入其子宫内膜细胞中。可望将核酸导入子宫内膜的腺上皮中。这些核酸可编码某种已由其中导入核酸的细胞天然合成的多肽，从而可通过基因剂量作用增加该多肽的表达水平。或者该方法亦可用于诱导细胞表达以前没有在那些细胞中合成的多肽。例如，多肽可能是自然界不存在的“人工”重组多肽，例如包括两种或多种不同蛋白质之全部或部分功能区域的嵌合多肽。
核酸较好是DNA，但也可以试着导入RNA(有义链或反义链)。可以使用反义分子抑制或干扰多肽在导入了核酸的细胞中的表达。被导入的核酸序列可以是反义RNA，或者可以是指导细胞内反义RNA合成的DNA序列。实现这种抑制作用的另一种方法是在细胞中导入指导核酶合成的序列，然后所说的核酶将特异性地切割合成那些试图要抑制其表达的多肽所需的mRNA。
本发明人已发现，投用核酸的时间(相对于生殖周期的不同阶段)对核酸摄入的效率有很大影响。发明人发现，一般说来，为了使所投用的核酸的摄入达到最佳程度，有必要在排卵后的时间并包括在血液内孕酮水平处于峰值时按周期给药。一般孕酮水平在一个大约与胚胎(如果存在于子宫中的话)逐渐植入的时间点达到峰值。
因此，例如本发明人已发现，所投用的DNA被小鼠子宫内膜最大摄入发生于周期的第2-3天(将第一次检测阴道栓的这一天定为第1天)。在人体中，排卵一般发生在周期的第14天，并且一般估计植入是发生在黄体中期(但对人来说很难定出准确时间)。
可以以裸露形式，或者与其他物质(如脂质体)结合的形式投用核酸。可以通过简单的转染方法(有或没有脂质体)将核酸导入接受体哺乳动物的细胞中，本发明人已发现这种方法特别有效，而且不需将核酸序列预先导入病毒载体内。不过，病毒载体也可能是适用的，特别是那些能以某些类型的细胞为靶目标的病毒载体(如WO 93/20221中所公开的病毒载体)。
可将核酸作为构建体(如质粒、粘粒等)的一部分方便地导入细胞中，所说的构建体应包括可在哺乳动物中工作的启动子，以例引起至少一部分被导入的核酸的转录。启动子可以是组成型的，更好是可诱导的，从而得以对被导入之序列的表达进行更大程度的控制。
在按照本发明完成的一个特定方法中，将核酸分子导入个别雌性哺乳动物的子宫内膜细胞中，以便对个体的生育进行向上或向下调节。本发明可特别用于提供使伴侣动物(如猫和狗)避孕以阻止不需要的怀胎的方法。本发明的其他实施方案中提供了改善猪、牛、羊等家畜的生育力的方法。
较好通过阴道将核酸导入生殖道中，而不必使用侵害性外科手术。但必要时也可借助外科技术将核酸直接导入生殖道内(如子宫内)。本发明提供了通过导入一种或多种很大数目的不同核酸序列来改变细胞的一种或多种特征的可能性。
在一个实施方案中，导入生殖道中的序列可指导细胞因子或生长因子之有效部分的表达(较好的高水平表达) (有效部分是指保留与整体特定联系，例如与特异性配体等相结合之生物学活性的分子的那个部分)。这些可由被导入的序列表达的多肽可包括但不只限于白介素、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合的表皮生长因子(HBEGF)、胰岛素结合的生长因子I和II(IGF-1和IGF-II)、双调蛋白、集落刺激因子(CSF)及肿瘤坏死因子(TNF)。
在另一个实施方案中，被导入的序列可指导细胞因子或生长因子拮抗剂，如IL-1受体拮抗剂之有效部分的表达。特别有利的是，拮抗剂可以是细胞因子或生长因子的可溶性受体。适当的例子包括下列因子的可溶性受体；转化生长因子(TGF)α、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGE)、白介素-6(IL-6)和VEGF。
在另一个实施方案中，被导入的序列可指导具有免疫学作用之多肽的有效部分的表达。具体地说，多肽可具有免疫原活性，从而可用于刺激局部免疫反应。因此，本发明可用于提供新的免疫方法。免疫原性多肽较好是来自粘膜病原体的抗原。依靠通用粘膜免疫系统，刺激抗体在生殖道中产生，可导致远端粘膜部位，如胃肠道、呼吸道、泪腺等部位相应抗体的产生。但抗原较好是来源于侵染和/或移植于生殖道之病原体，例如可引起性传播疾病的病原体的抗原。这类病原体的例子包括病毒如HIV、乳头瘤病毒(如各种类型的HPV)、衣原体和细菌(如N.gonorrhoea)。或者，具有免疫学效应的多肽也可以是免疫球蛋白或其有效部分(如Fab、Fv或scFv片段，或单链抗体)。免疫球蛋白或其有效部分可以是针对病原体(如上文提到的病原体)，或可以是针对某些其他抗原如类固醇或其他激素的。因此可在局部表达免疫球蛋白或其部分，以提供对抗疾病的保护作用或调节生育力。
在另一个实施方案中，导入的序列可指导多肽或其有效部分的表达，其对月经有一定影响。
在另一个实施方案中，导入的核酸可在生殖道细胞的表面上指导受体分子有效部分的表达。受体可以是细胞因子、类固醇激素或生长因子的受体(如EGF受体、TGFα受体、或VEGF受体)。许多受体是已知的，但因为其所结合的配体是未知的，故被描述为“孤独”受体。因为这些孤独受体可为新的治疗或预防化合物提供靶子，所以对医药工业是相当有用的。
因此，在本发明的另一个方面提供了鉴定多肽之生物学性质的方法，其包括将被鉴定的多肽编码序列导入哺乳动物生殖道的细胞中，并估价所表达的多肽的作用。哺乳动物较好是实验室动物，如小鼠或大鼠。被定性的多肽通常是孤独受体，并且一般对其特性的至少一部分的鉴定工作应包括鉴定其配体。总地说来，该方法将包括分析取自实验室动物的组织学切片，并用多种已知技术中的任何一种进行处理(如组织化学染色、原位杂交、免疫学染色等)。
因此本发明提供一种经体内直接基因转移对子宫内膜功能(以及生殖能力或生育力)进行类固醇调节的新的替代性方法。为此目的，可设计基因构建体用以特异性地调节细胞因子作用。可用多种方法实现这一目的。例如可使用启动子驱动的反义构建体或核酶阻断转录和翻译，以使产生分泌性细胞因子的细胞不能合成这种因子。另外，也可以用受体拮抗剂来阻断分泌性因子的作用。可以清除天然存在的可溶性受体并中和生物活性配体，从而发挥竞争性受体拮抗剂的作用。另外还有天然受体拮抗剂，例如IL1Ra(白介素-1受体拮抗剂)。腹腔内投用这种蛋白质可阻断小鼠体内的胚泡植入(Simon et al.，1994，文献如前所列)。
有相当多的证据表明，由输卵管和子宫上皮分泌的可溶性生长因子可直接通过胚胎上表达的受体发挥作用，控制哺乳动物胚胎的植入前发育(Pampfer等人，1990，体外细胞和发育生物学26，944-948)。反过来，发育的胚胎又产生可以按自分泌方式，或者在子宫内膜上起作用的生长因子，以影响其感受性。例如在小鼠体内，正好在植入前，于第4天显著地上调腺上皮中的LIF表达(来自母体组织)。LIF能够作用于表达LIF受体(LIF-R)的植入前胚泡。母体表达LIF对于植入是至关重要的，因为在LIF剔除小鼠中虽然按相似过程进行，但胚胎却没有植入，所以只以假妊娠过程结束。(Stewart等人，1992，文献同前所述)。
本发明人现已将这一工作扩展到人，并通过RT-PCR显示人胚胎表达编码LIF-R的mRNA，但不表达LIF本身。LIF通过与低亲和性受体LIF-R结合而起作用。当LIF/LIF-R复合物与信号转导辅助蛋白gp130相互作用时出现高亲和性结合。人胚胎也含有编码这种蛋白质的mRNA(Sharkey等人，1995生殖生物学53，955-562)。本发明人也已证明人腺上皮中的LIF分泌受类固醇的调节，在黄体期(大约在预期的植入时间)为最大(Charnock-Jones等人，1994，文献出处同前)。此外，已报导在体外给人的植入前胚胎投用LIF可改善发育状况。这一证据有力地支持LIF在人胚胎植入中可能如其在小鼠中一样重要这一观点。很显然，细胞因子可介导(以两个方向)子宫腔中的胚胎与子宫内膜间的重要讯息联系。本发明的方法得以利用基因转移来破坏或增进这种联系，产生新的避孕方法，或者相互地改善植入。
由于缺乏调节局部细胞因子/受体水平的有效方法，民以目前有关生殖功能的旁泌和自泌性调节的研究工作主要限于描述性分析。本申请中给出的证据表明，体外转染子宫上皮细胞是可行的。这一方法得以实验操作子宫内膜并提供新的治疗策略。下文概述的使用报导基因完成的工作者在证明体内子宫基因转移的可实践性。实践中，使用了能够改变子宫功能的基因(或其他DNA构建体)。这些基因包括受体拮抗剂(如IL-1Ra，可溶性VEGF受体等)、天然或修饰的细胞因子及生长因子、蛋白酶抑制剂或类固醇受体和各种核酶的基因，以及反义构建体。这一工作显示，可在体内将基因转移到子宫内膜，并将在处理许多子宫内膜(和胎盘)条件中找到其实用性，例如用于改善动物和人的胚胎植入、破坏植入(即避孕)、子宫内膜异位和月经过多、增生及腺癌。
使用我们建立的方法获得了下述的结果。这些结果证明可于体内(小鼠体内)和体外将基因构建体转移到子宫内膜中，而且证明这些构建体在转录上(和翻译上)是有活性的。
现将参照附图以阐述性实施例的方式进一步描述本发明。


图1A和1B显示用(A)指导β半乳糖苷酶报导基因表达的质粒，或(B)缺少报导基因的相似质粒转化之小鼠子宫内膜组织学切片的显微照片。在胞质内可由强烈的深(蓝)染色清楚地显示被转染的细胞，在切片B中则没有；图2是由如图1A中所述的同样质粒转化的体外人子宫内膜细胞的照片，其中由于报导基因的表达主要与余留的腺结构有关而出现深(蓝)染色，而周围细胞则染色较浅；图3是显示CAT试验结果(以每管的计数表示)的条线图，其中子宫内膜细胞是被编码氯霉素乙酰转移酶的基因(pcDNA3CAT)成功地转染的，并与由对照质粒(pcDNA3)转染的细胞相比较；图4是显示荧光素酶试验结果(以相对光单位表示)的条线图，其中子宫内膜细胞是被编码荧光素酶的基因(pc DNA3LUC)成功地转染的，并与由对照质粒(pcDNA3)转染的细胞相比较。
实施例实施例1小鼠缺对成组BALB/cJ小鼠被圈养在光(14小时光照10小时黑暗；在20.00小时关掉光照)和温度(22℃)控制的小动物房(Smal AnimalHouse)内，并饲以小鼠和大鼠食物(Labsure；Christopher Hill Group，Poole，Dorset，UK)。将它们与同一批的切除输精管的雄性小鼠一起放置过夜，并于次日早晨检查阴道栓是否存在。假定交配发生在02.00小时，即0时间，并将第1天计数为第一次检查栓子的日期。于实验前将交配的雌性动物单独圈养。
在Metafane(甲氧基荧烷，C-Vet Ltd.，Bury St.Edmunds)麻醉下使用无菌程序进行剖腹手术。经中腹部或两侧切开以暴露子宫角。在输卵管一子宫接合处向子宫角顶端注射，或者在子宫颈接合处向角的基底部注射。重复研究显示后一种技术提供了最好的给药方法，但为了某些目的，当必须尽可能地减小对生殖道的扰乱时则较好使用前一种方法。将扁平Stratatip的尖端插入子宫角的基底部以注射胎质体/DNA(pcDNA3构建体+/-β-半乳糖苷酶报导基因)、裸DNA或对照溶液(25-100μl)。借助Travesty涂药器(也可用于控制向子宫角内缓慢注射溶液)预先将溶液向上抽入尖端。
注射后，使用断开的褥垫缝合线缝合切口，使小鼠在其笼内苏醒并随意提供食物和水。
质粒构建体本申请中(以实例方式)描述的质粒都是基于市购的载体pcDNA3(Catalogue No.V790-20，购自Invitrogen；San Diego，California，USA)。使用没有报导基因的质粒pcDNA3作为阴性对照。实验质粒pcDNA3-βgal、pcDNA3-CAT行pcDNA3-Luc分别含有β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶及荧光素酶报导基因。这些质粒含有下列遗传元件氨苄青霉素抗性基因、Co1E1复制原点、CMV启动子(报道基因)、牛生长激素polyA加入位点、f1复制原点、SV40复制原点、新霉素抗性基因及SV40 poly A加入位点，这些元件以可运转的方式连接，从而在导入质粒后可于真核细胞内表达报导基因。用碱溶解法从大肠杆菌中纯化质粒DNA，并使用Qiagen离子交换柱(按照生产商的说明书)进一步纯化之。
脂质体制备所使用的脂质体是DOPSA(2，3-二油酰氧基-N-〔2(精胺甲酰氨基)乙基〕-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐)和DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)(Lipofect AMINE；Gibco BRL Paisley，Scotland)的3∶1(w/w)脂质配方。可使用如表1中所示的许多不同的DNA/脂质比例和注射体积。在每次实验前立即混合DNA/脂质。向10μl脂质溶液内加入10μlDNA溶液，轻轻混合并于室温下旋转15分钟。然后加入80μlPBS达到如表1中所示的DNA和脂质终浓度。然后将此溶液注射到假妊娠小鼠的子宫内(有关小鼠及其外科处理的方法参见上文)。
β半乳糖苷酶的组织化学定位用二氧化碳吸入法杀死动物并切下不带脂肪的肠系膜的子宫角。将每个角切成3片，顶和底部切片放在液氮中快速冷冻并贮存于-70℃，然后定量检测β-半乳糖苷酶含量。将每个子宫角的中间一片在溶于PBS的1.25％戊二醛中固定15分钟。在PBS中漂洗两次，并置于X-gal染色溶液(1mg/ml X-gal、5mM K3Fe(CN)6、5mMK4Fe(CN)6、2mMMgCl2、0.02％NP40和0.01％脱氧胆酸钠)中室温下着染24小时。然后在PBS/3％DMSO可(2×5分钟)和70％乙醇中(3×5分钟)冲洗，并置于100％乙醇中。在乙二醇异丁烯酸树脂中包埋组织并切成7μm切片，用中性红反染色后进行显微镜检查。
结果下列表1中显示所使用的各种条件和投用DNA/脂质体复合物后所得子宫切片的染色强度。表中所示的结果证明投用质粒DNA的时间的重要性，于第2天投用时表达水平最高，于第3天投用表达水平较好，但于第4天投用则报导基因的表达很差，推测这是由于在这个时间点上子宫内膜细胞可能没有摄入基因构建体，但进一步的原因还不完全清楚。
表1
染色强度+++强；++中等；+弱；-无染色对照未注射的6天假妊娠小鼠未出现子宫中β-半乳糖苷酶活性的染色。
注射50μl缺少β-半乳糖苷酶(2μg/ml)和脂质(20μg/ml)的pcDNA3的假妊娠小鼠(第2天投药；第6天尸体解剖)子宫中没有出现β-半乳糖苷酶活性染色。
用X-gal染色后检查组织学切片显示，腺上皮有强染色，腔上皮虽然也着染，但强度较低。在假妊娠第二天的50μl投药量，用2μg/ml DNA和20μg/ml脂质转染的动物中可见有最佳染色。图1a显示从这样的动物制得的切片，图1b显示接受(在相同条件下)不带β-gal基因之质粒的对照动物的切片。
实施例2转染人子宫内膜的原始培养物本发明人也已证明，可在体外以高效率转染人子宫内膜上皮细胞。
使用已介绍过的同样的质粒(pcDNA3，+/-β-半乳糖苷酶报导基因)和脂质。用Smith和Kelly(Smith等人，1987前列腺素34，553-561)的方法制行子宫内膜细胞。培养物一旦建立，便使用下列转染方案。分别在100μl无血清培养基(Opti-MEM1 BRL)中稀释DNA(2μg)和脂质体(8μg)，混合并于室温下保温15分钟。此后再加入800μl Opti-MEM1、先用PBS，然后再用Opti-MEM1洗细胞(在24孔平板中)。将DNA/脂质体混合物(0.5ml)加到细胞中并在CO2培养箱中于37℃温育3小时，然后加入0.5ml含有20％胎牛血清的培养基。转染后24小时固定细胞(0.1％戊二醛)、淋洗并用X-gal染色。
该工作显示可于体内将基因转移到子宫内膜中，并且这一方法可实际应用于许多的子宫内膜(和胎盘)生理或病理条件，例如改善动物和人的胚胎植入、破坏植入(即避孕)，治疗子宫内膜异位和月经过多、增生及腺癌。
得到与体外转染纯化的人子宫上皮细胞有关的进一步的数据。这一数据是对体内小鼠研究工作的补充，并表明在经过最少的培养时间之后，可由体内使用的同样脂质体和DNA有效地转染相似的细胞。
实施例3体外转染人子宫内膜上皮分离子宫内膜中的人原始上皮细胞并按照Zhang等人(细胞科学杂志，1995；108323-331)的方法培养之。将细胞铺敷在标准6孔组织培养板中，以于次日达到50％汇合的密度。将细胞培养5天，然后以每孔60,000个细胞的密度重新铺敷在24孔平板中。第2天用DNA/脂质体复合物(DNA/LC)转染细胞。按下述方法制备转染的细胞。
转染方法材料Lipofect AMINE(Gibco Catalogue No.18324-012)，Opti-MEMI(Gibco Catalogue No.51985-018)24孔培养器Zhang等人(文献同上)所述的细胞培养基。该培养基由DMEM/HEPES、10％FCS、内皮细胞生长添加物(Sigma CatalogueNo.E-2759)(30μg/ml)、肝素(Sigma Catalogue No.H-3149)(90μg/ml)、庆大霉素(Sigma Catalogue No.G-1272)(5μg/ml)和两性霉素B(Gibco Catalogue No.15290-018)(1μg/ml)组成。另外还使用无Mg++、Ca++PBS和2ml Eppendorf管。
使用两种含不同报导基因的不同的质粒构建体。pc DNA 3CAT得自Invitrogen公司，并会有编码氯霉素乙酰转移酶的报导基因。第二种质粒pc DNA3luc含有同样载体，但以编码荧光虫荧光素酶的基因代替CAT基因。使用Qiagen中型制备系统进行大规模DNA制备。使用不含有报导基因的pcDNA3作为阴性对照。
DNA/脂质体复合物的制备1)溶液A将1μg DNA稀释到装在Eppendorf管中的100μl Opti-MEMI中。转染培养基中所用的DNA终浓度为1μg/ml。
2)溶液B将4μl Lipofect AMINE稀释剂加于Eppendorf管内的100μl Opti-MEMI中。转染培养基中所用Lipofect AMINE的终浓度为8μg/ml。
3)将溶液A和B合并到一个新的试管中并轻轻混合之。
4)室温下温育15分钟。
细胞洗涤1)转染前，在不含血清的新鲜PBS中将细胞单层粗略精洗3次。
2)再用Opti-MEMI将细胞单层洗两次。
转染1)向含有DNA-脂质混合物的各管中加入800μl(总计1.0ml)Opti-MEM。DNA终浓度为1μg/ml，Lipofect AMINE浓度为8μg/ml。
2)除去细胞单层中的Opti-MEM。
3)轻轻混合DNA/LC混合物并在洗过的细胞上覆盖以稀释的复合溶液，0.5ml/24孔。
4)在CO2培养箱中将细胞单层37℃温育3小时。
进一步的细胞培养1)3小时后，除去转染混合物，向各孔内加入2ml Zhang培养基，并继续培养。
定量检测转染后24至48小时时提取细胞，并根据需要检测CAT或荧光素酶报导基因活性。
1，在PBS中将细胞洗3次。
2，用300μl溶胞缓冲液(Promega Catalogue No.E-3871)提取细胞，将细胞彻底刮到Eppendorf管中。
3，于-70℃下迅速冷冻提取物并储存备用。
4，为了检测，融化提取物并以13,000g离心5分钟。
5，将冷冻/融化/离心过程再重复一次。
6，使用购自Tropix的荧光素酶检测存盒(Catalogue No.BC 100L)检测荧光素酶报导基因活性。每管使用40μl每种提取物。
7，使用购自Amersham的Quan-t-CAT药盒(Catalogue No.TRK 1012)检测CAT报导基因活性。
结果按上述方法在24孔平板中转染原始子宫内膜上皮细胞。以一式三份分别用pcDNA3(作为对照)、pcDNA CAT和pc DNA3 LUC进行转染。48小时后收获细胞并检测荧光素酶或CAT活性。
CAT酶催化乙酰基团从乙酰辅酶A向氯霉素的转移。使用氚化的乙酰CoA导致放射标记向氯霉素的转移。样品中的CAT活性直接与所产生的氚化氯霉素的量成正比例。因此结果以每管cpm数表示。可使用含有已知量纯化的CAT的溶胞缓冲液制作标准曲线。
结果示于图3中，该条线图显示典型实验中三次重复检测的平均值±标准误差。下面给出数字形式的结果，用pcDNA3CAT处理的细胞中的CAT活性约比对照样品高6倍，证明已成功地转染了子宫内膜细胞。
pcDNA3pcDNA3CAT710 4480616 4134662 3234均值662±271均值3951±372在荧光素酶的检测法中，将含有荧光素酶的细胞提取物与其底物荧光素混合，导致光发射。光信号强度与提取物中存在的荧光素酶活性成正比，并可用发光计检测之。初始结果以相对光单位给出。
结果示于图4中，该条线解显示典型实验中三次重复检测的平均值±标准误差。结果以数字形式显示如下。从用pcDNA 3LUC处理的细胞发出的信号比对照样品的本底信号高30倍以上，再次证明成功地转染了子宫内膜细胞。
子宫内膜基因转移的可能的应用实例可将至少七种不同类型的基因构建体转染到子宫内膜中，以达到各种不同的效果。现对这些不同的类型依次描述如下。
1)细胞因子和生长因子的过表达从概念上说，将要设计的最简单类型的构建体是用于在子宫上皮细胞中过表达细胞因子或生长因子的。用于这种过表达的适当的cDNA可包括编码LIF、VEGF、EGF、CSF、TNF、双调蛋白及各种白细胞介素和集落刺激因子的DNA。已证明子宫内膜中天然表达这些因子，并且认为它们在调节子宫内膜功能中是十分重要的(Stewart等人，1992，自然359，76-79；Charnock-Jones等人，1994，生殖和生育力杂志101，421-426；Charnock-Jones等人，1993，生殖生物学48，1120-1128；Das等人，1995，分子内分泌学9，691-；Tabibzadeh(1994)，人类生殖现代化9，947-967)已发表了该领域的广泛评述文章)。这些因子各自影响生殖功能的不同方面，其中包括植入、血管发育及白细胞生物学。因此投用这类构建体的可能指征应是在希望改善生育力(特别是家畜生育力)，或阻止人和动物的妊娠，以及治疗人的各种月经紊乱时。
为改善家畜生育力而设计的实验的实例已证明LIF对于植入过程是不可缺少的(Stewart等人，1992，文献同上)。该因子是在植入时由子宫内膜产生的。因此在胚胎丧失率高的物种中，提高植入时子宫内膜的LIF表达水平或许能降低胚胎丧失率。因此为了指导在植入时由子宫内膜合成LIF而设计的基因构建体的转染，可改善该种动物的生育率。转染到子宫内膜中的构建体须含有适当的调节序列，以确保在适当的时间产生LIF蛋白质。为此，有可能使用得自所研究的这种动物的LIF基因的启动子达到这一目的。
也可设想利用子宫内膜基因转移技术进行处理，以缓解妇女的月经失调。其中一个例子是转染编码血管生成性生长因子例如VEGF的基因，以改变子宫内膜内的血管发育。局部VEGF生成量的增加可望增进毛细血管生长，并因而促使子宫内膜增厚。同样，增加VEGF的水平可有利于月经后毛细血管的修复，从而改变用这种类型的构建体处理的患者的出血特征。
2)受体的过表达可以预料，增加由子宫上皮表达的受体的数目和类型将会具有显著的生物学重要性。可希望过表达的受体类型包括但不限于生长因子和细胞因子受体，例如EGF、TGFα、VEGF和各种集落刺激因子及白细胞介素受体。类固醇激素受体也适合在上皮细胞中表达。当希望改善生育力、阻止妊娠、治疗月经紊乱以及希望阐明孤独受体(孤独受体是目前尚未鉴定出配体的受体)的功能时，预期这种转染作用将是有用的。因为鉴定配体的特征可能导致新药物的产生，所以孤独受体代表了一个医药工业十分感兴趣的领域。
人们已逐渐深入地了解到，子宫内膜的发育是由许多细胞因子和其受体间的相互作用介导的复杂过程，而且卵巢类固醇的刺激作用常常是通过这些细胞因子介导的。具体地说，已证明(Nelson等人，1992，内分泌学，131，1657-1644)TGFα是小鼠子宫中雌激素作用的潜在介导物。因此，指导该因子合成之构建体的转染作用有可能促进子宫内膜生长，并因而可在子宫内膜未有充分发育的情况下提高生育力。同样，可预期这种因子能够促进月经后的上皮表面修复，并因而可用于治疗月经过多。
目前对类固醇激素受体总科几个成员的配体尚不明了。将这些cDNA转染到子宫内膜可有利于阐明这些受体的生物学功能，因此可将其应用于寻找作用于这些受体的新的药剂(Evans 1988，科学240，889-895).
3)用所设计的构建体进行转染，以封闭或阻断细胞因子、生长因子及其他激素的作用转染针对细胞因子和生长因子的天然拮抗剂开启了调节子宫内膜功能的可能性。这种拮抗剂的一个例子应是白细胞介素1受体拮抗体(Hannum等人，1990自然343，336)。已显示投用这种蛋白质可阻断小鼠妊娠(Simon等人，1994内分泌学，134，521-528)。细胞因子和生长因子的其他天然拮抗剂包括天然可溶性受体。已描述了各种生长因子/细胞因子系统中的可溶性受体。例如TNF(Engelmann等人，1990，生物化学杂志，265，14497-14504)、FGF(Givol等人，1992，FASEB杂志，6，3362-3369)、PDGF(Tiesman & Hart，1993，生物化学杂志268，9621-9628)和IL-6(Novick等人，1989，实验医学杂志170，1409-1414)。它们的共同特征是，受体的细胞外配体结合区域是作为游离的可溶性因子由细胞中释放的。为此可通过蛋白水解作用或剪接方法借以产生缺少跨膜区域和细胞内区域的截短的蛋白质分子。Kendall和Thomas(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，10705-10709)描述了VEGF受体flt的可溶性变异体。该蛋白质能够在体外阻断VEGF的作用。我们已分离了另外三种编码其他可溶性变异体的cDNA(参见PCT/GB 95/01213)。与其他拮抗剂(例如抗VEGF抗体)相比这些天然拮抗剂具有几个优点。因为它们正常存在于身体内，所以可以预料到它们不会引发免疫反应，而应被充分耐受。另外，因为它们都衍生于膜结合的受体，所以其结合特征很相似并因此会很有效地竞争配体。有可能天然存在其他一些可溶性受体，或者可对它们进行体外基因工程改造。再者，如果来自类固醇激素受体家庭成员的配体结合区域得以表达，则其可起到优势负性受体的作用，当在细胞内以足够高的水平表达时便可竞争结合配体。或者，亦可使用某种未激活的但与DNA结合的“受体”未阻断基因转录。本申请可用于拮抗天然素固醇，包括那些迄今尚未鉴定的孤独受体之配体的作用(Pemridc等人，1994，白血病8，1797-1806)。也可对来自七个跨膜区域受体家族的信号缺陷性受体进行工程改造和转染。
已证明可溶性白细胞介素-1受体拮抗剂(Eisenbery等人，1990自然343，341)可与体内拮抗IL-1的作用(Simon等人，1994内分泌学134，521-528)。可望通过用指导拮抗剂合成的cDNA构建体转染子宫内膜来阻断小鼠妊娠。
Kendall和Thomas(1993，文献出处同上)，以及Boocock等人(1995J.Natl.Cancer Ins.87，506-516)已描述了其他一些可能拮抗生长因子或细胞因子作用的因子，其中包括天然受体的可溶性变异体，例如VEGF受体的可溶性变异体。预期局部产生这些因子可用来拮抗VEGF的作用，并可望在子宫内膜细胞过度增殖的情况下发挥有益的治疗作用，例如在各种月经紊乱情况下可望以期降低子宫内膜中的毛细血管密度。其中还应包括治疗恶性疾病。
4)反义方法用于阻止特异性蛋白质(或酶)的局部生成阻断细胞因子、生长因子和激素作用的一种可选用的方法应是使用反义或核酶技术阻断适当细胞内配体的产生，或者受体的产生(James，1991抗病毒化学和化学治疗，2，191-214；Albert & Morris，1994药物科学趋向15，250-254)。
反义技术依赖于所谓反义寡核苷酸或多核苷酸与细胞mRNA的结合。这种结构可阻止所说的mRNA的翻译，并因而可降低细胞产生之适当蛋白质的量。已将合成寡核苷酸或多核糖核苷酸成功地用于这一方法。预期脂质体介导的寡核苷酸转染作用或脂质体介导的DNA构建体(用于指导较长反义多核苷酸的合成)转染作用可特异地和选择性地降低被转染的细胞中的蛋白质产生。核酶也可通过选择性切割编码特定蛋白质的RNA来阻止蛋白质产生。这些反义分子都可作为多核糖核苷酸或指导这类多核苷酸合成的DNA构建体被转染到细胞中(有关综述参见James 1991，和Albert &Morris 1994的上述文献)。反丈核酶用于阻止生育的一个例子如下所述。已经表明LIF对于哺乳动物妊娠的植入过程是必不可少的(Stewart等人，1992，文献如前所列)。因此可期望借助寡核苷酸或指导反义多核苷酸合成的DNA构建体，或抗LIF mRNA的核酶的转染作用来阻止该因子的合成。缺少这种因子则导致植入失败并因而阻断妊娠。
可使用相似的方法阻止血管形成性生长因子如VEGF的产生，进而阻止肿瘤生长的必需的内皮细胞的增殖。因此这种类型的疗法可特别适于治疗恶性疾病。
5)免疫球蛋白和其片段的局部产生有可能使用现代重阻DNA技术产生与原完整单克隆抗体有着几乎完全相同的结合特征的单链抗体。已在细菌中成功地表达了这样的单链抗体(He等人，1995免疫学84，662-668)。原则上有可能按照需要来设计将指导上皮细胞中单链抗体表达的构建体。如果在体内子宫内膜中完成这一表达便可预料抗类固醇激素的单链抗体将与类固醇结合并抑制其在上皮细胞中的作用。这样一种抗体的例子是衍生于抗孕酮单克隆抗体DB3的单链抗体(He等人，1995，文献出处同上)。如果这一抗体被分泌到子宫腔内，其也可与孕酮结合并可在子宫区域内发挥作用。如果已知在子宫内膜中有活性的抗生长因子和细胞因子的抗体能够以这种方式在局部产生，则它们同样地可阻断所说因子的功能。
局部产生的单链抗体的其他应用在于预防或治疗性传染病。在这种情况下，抗所研究的致病因子(例如乳头状瘤病毒、HIV、衣原体)的抗体可被分泌到子宫腔内并阻止由这些因子引起的感染。可预计抗精子或卵母细胞抗原的抗体将在避孕中起作用。
6)获得粘膜免疫力的主动免疫可用于获得局部免疫力的另一种方法是设计可指导抗原向子宫腔内分泌的构建体。其可引发局部免疫反应并因此而获得位点特异性粘膜免疫力。许多年来就已经知道(Howe，1967，生殖和生育力杂志13，563-566)子宫腔内包含许多白细胞。这些白细胞摄取由被转染的子宫内膜细胞产生的抗原并继而引发粘膜免疫反应。将抗原输送到肠腔中已产生了这种免疫力，并已显示在某些情况下是很有效的(例如抗脊髓灰质炎疫苗接种)。
7)阻断病原体附着位点病原体附着于粘膜表面上常常是感染确立的一个必要条件。因此阻止病原体在这些位点上的附着提供了一种对抗人或动物疾病，特别是对抗性传染病的方法。这种方法不仅适用于细菌病原体(例如E.coli和N.gonorrhoea的某些病原菌株)，而且也适用于病毒病原体。当感染细胞时，许多病毒被细胞表面“受体”结合。可望局部产生的可溶性受体能竞争与细胞表面分子结合并因而阻止病毒感染。同样，用病毒模拟物(其作用如同病毒“配体”)来饱和结合细胞表面受体也可以阻止感染，因为同样也可在局部产生特异性免疫球蛋白或其有效结合部分。
权利要求
1.将核酸导入哺乳动物个体之生殖道的至少某些细胞中，以改变所说细胞的一种或多种特征的方法。
2.根据权利要求1的方法，其中核酸被导入子宫内膜细胞中。
3.根据权利要求1或2的方法，其中核酸被导入子宫内膜的腺上皮中。
4.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中被导入的核酸是DNA。
5.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核酸是在排卵后期间，直到并包括血液内孕酮水平达到峰值时被导入的。
6.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核酸是在脂质体、病毒、或其他载体颗粒内被导入的。
7.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核酸是作为质粒或其他构建体被导入的。
8.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中被导入的核酸包括被可操纵地连接到将在真核细胞中转录的序列上的启动子。
9.根据权利要求8的方法，其中启动子是可诱导的。
10.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中被导入的核酸序列包括一个以反义方向可操纵地连接到启动子上的部分，从而抑制多肽在导入了所说序列的细胞中的表达。
11.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中因导入核酸序列而被改变的特征导致了个体之生育力的改变。
12.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中被导入的核酸指导细胞因子或生长因子的至少一个有效部分的表达。
13.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所导入的核酸指导下列因子之一的至少一个有效部分的表达白细胞介素、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合的表皮生长因子(HBEGF)、胰岛素结合的生长因子I和II(IGF-1和IG-II)、双调蛋白、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、肝细胞生长因子(HGF)，和成纤维细胞生长因子(FGF)。
14.根据权利要求1至11中任何一项的方法，其中被导入的核酸指导细胞因子拮抗剂或生长因子拮抗剂的至少一个有效部分的表达。
15.根据权利要求14的方法，其中被导入的核酸指导白细胞介素-1受本拮抗剂或下列因子之一的可溶性受体的表达转化生长因子(TGF)α、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、白细胞介素-6、血管内皮生长因子(VEGF)、或肝细胞生长因子(“Met”受体)。
16.根据权利要求1至11中任何一项的方法，其中被导入的核酸指导生长因子、细胞因子或类固醇激素受体的至少一个有效部分在细胞内和/或细胞上的表达。
17.根据权利要求16的方法，其中被导入的核酸序列指导下列因子之一的受体的至少一个有效部分的表达EGF、转化生长因子(TGF)α，或VEGF。
18.根据权利要求1至11中任何一项的方法，其中被导入的核酸指导具有局部免疫原效应之多肽的至少一个有效部分的表达。
19.根据权利要求18的方法，其中被导入的核酸指导来自病原体之抗原的至少一个有效部分的表达。
20.根据权利要求18或19的方法，其中被导入的核酸指导来自下列病原体之一的至少一个免疫原性部分的表达HIV、乳头状病瘤病毒、衣原体或淋病奈瑟代球菌(N.gonorrhoea)。
21.根据权利要求18的方法，其中被导入的核酸指导免疫球蛋白或其有效部分的表达。
22.含有核酸的，用于根据前述权利要求中任何一项的方法的组合物。
23.含有核酸的组合物按照权利要求1至21中任何一项的应用。
24.含有核酸的组合物在制备用于改变哺乳动物个体之生殖道的至少某些细胞的一种或多种特征的物质中的应用。
25.制造用于权利要求1至21中任何一项之方法中的组合物的方法，该方法包括将核酸与生理上可接受的载体物质相混合。
全文摘要
公开了在哺乳动物个体之生殖道的至少某些细胞中导入核酸,以改变所说细胞的一种或多种特征的方法,同时提供了用于该方法的含核酸的组合物。
文档编号C12N5/08GK1174508SQ9519746
公开日1998年2月25日 申请日期1995年12月21日 优先权日1994年12月24日
发明者D·S·查诺克一琼斯, S·K·史密斯, A·M·夏基, R·B·希普 申请人:剑桥大学技术服务有限公司