专利名称：其中areA、pepC和/或pepE基因已被灭活的真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及不产生蛋白酶的真菌。本发明的真菌作为产生蛋白质的宿主是有用的，所说的蛋白质易于被通常产生的蛋白酶所酶解。因此，本发明包括利用本发明的真菌以高产率产生兴趣蛋白质的方法。本发明也包括产生这种真菌的方法以及用于这些方法中的DNA构建体。
背景技术：
真菌(尤其是丝状真菌)在商业上广泛地被使用，这是因为它们具有分泌很高水平的蛋白质的能力。
在丝状真菌中，属于曲霉属的物种用于产生内源性蛋白质(后来也用于产生异源蛋白质)的商业用途已具有很长的历史。
大多数微生物用于产生蛋白质的一个缺点是固有的蛋白酶产生，该蛋白酶使目的产物降解(由于蛋白酶解)。
已研究了避免这一现象发生的各种方法。在这些解决方案中，已经有人提出缺失或破坏编码各种蛋白酶的基因。遗憾地是，真菌产生大量种类的蛋白酶，使得这种解决方案或多或少地有些不现实。
因此需要寻求显示出没有蛋白酶产生或十分低水平的蛋白酶产生的丝状真菌菌株。
一些年来，已知调节基因araA(在构巢曲霉中其介导氮代谢物阻抑)影响胞外蛋白酶的产生(Arst & Cove，molec．gen．Genet．126，(1973)111-141)。
已克隆了构巢曲霉的araA基因(Caddick等，EMBO杂志5，(1986)1087-1090)，并且已对它进行了各种修饰，以评价在由这一基因编码的激活物蛋白质中不同区的功能(Stankovitch等，分子微生物学7，(1993)81-87)。此外，最近似乎已克隆了在烟曲霉中编码相应功能的基因(Hensel等，真菌遗传学的第二次欧洲会议，1994年4月28日至5月1日，摘要册，E11)。
从文献中，基因型argB areAl的构巢曲霉菌株作为产生t-PA的宿主的单一用途是已知的(Upshall等，生物技术5，(1987)1301-1304)。在这一例子中，仅argB基因型通过其精氨酸原养型用作选择标记，而araA基因型只是巧合。
国际专利出版物号WO 95／35385公开了作为在丝状真菌中减少蛋白酶水平的一种手段的araA基因的缺失方法。
除胞外蛋白酶之外，真菌也产生一些胞内蛋白酶(也称为内质蛋白酶)。
在这些中间，枯草菌素型丝氨酸蛋白酶(由黑曲霉产生，指定为PepC)已有描述，并克隆表达它的基因，在EP574 347和Frederick等，基因，125 57-64(1993)中描述了一种缺失突变体。
在Jarai等，基因，145 171-178(1994)中公开了另一种这样的天冬氨酸型蛋白酶(指定为PepE)。该文献公开了pepE基因的克隆与鉴定，并推测了pepE与pepC基因的调节作用。
本发明的目的是缓解对无蛋白酶的丝状真菌的需要。
发明概要本发明因而涉及这样的真菌，其中的areA、pepC和／或pepE基因已由重组DNA技术修饰，由此它们不能以提供功能性AreA激活物和功能性PepC和／或PepE蛋白酶的方式表达。
此外本发明涉及产生这样的真菌的方法，所说真菌是通过缺失areA、pepC和／或pepE基因获得的。
这可以通过包括以下步骤的方法获得i)克隆兴趣真菌的areA、pepC和／或pepE基因，ii)产生各包含areA基因、pepC基因和／或pepE基因中之一的DNA构建体，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入，iii)用所说的构建体转化所说的真菌，和iv)分离areA-、pepC-和／或pepE-的转化体。
从以上提到的克隆areA、pepC和／或pepE基因获得的信息也可以用于与熟知的反义技术相连系，以构建表达质粒并用它转化兴趣真菌，所说的质粒导致一种RNA分子的合成，该RNA分子互补于从areA基因、pepC基因和／或pepE基因转录的mRNA。
此外，本发明涉及意欲用于以上提到的方法中的DNA构建体。
另外，本发明涉及产生所需蛋白质或基因产物(尤其是分泌蛋白质)的方法，该方法为在合适的条件下在适当的生长培养基中培养真菌，并回收和纯化所说的所需基因产物，其中所说的真菌是用DNA构建体修饰过的和任选转化过的，所说的DNA构建体包含至少一种编码兴趣蛋白质或基因产物的DNA序列。
当完成本发明时，惊人地发现本发明的真菌以得到很大改进的产率产生这样的分泌蛋白质。
也惊人地发现，能够使米曲霉areA-菌株生长良好的仅有的氮源是谷氨酰胺。
本发明还涉及用上述方法产生的蛋白质产物。
本发明也涉及编码米曲霉pepC基因或其功能性等位基因的DNA序列(SEQ ID No．1)。
本发明也包括米曲霉PepC蛋白酶(SEQ ID No．2)，以及产生PepC蛋白酶的方法，该方法包括用编码PepC蛋白酶的DNA序列的DNA构建体转化合适的宿主，选择能够产生所说的PepC蛋白酶的转化体，在适当的生长培养基中培养所说的转化体，并且从所说的培养物中回收所说的PepC蛋白酶。
此外，本发明涉及编码米曲霉pepE基因或其功能性等位基因的DNA序列(SEQ ID No．3)。
同时，本发明涉及米曲霉PepE蛋白酶(SEQ ID No．4)，以及产生PepE蛋白酶的方法，该方法包括用编码该蛋白酶的DNA序列的DNA构建体转化合适的宿主，选择能够产生所说的PepE蛋白酶的转化体，在适当的生长培养基中培养所说的转化体，并且从所说的培养物中回收所说的PepE蛋白酶。
按照这些方面，所说的宿主优选地是按照本发明的真菌，尤其是米曲霉，并且其中所说的DNA构建体提供编码所说PepC或PepE蛋白酶的基因的一个额外拷贝。
附图简要描述参照实施例和附图，在说明书的以下部分中详细描述本发明，其中
图1显示了HowB101的构建中所涉及的步骤，图2显示了pToC345的构建，图3显示了pToC315的构建中所涉及的步骤。
图4图示了pyrG基因的两步基因缺失。
图5显示了pJaL235的构建，图6显示了pJaL335的构建中所涉及的步骤，图7显示了pJaL363的构建中所涉及的步骤，图8显示了pJaLz的构建中所涉及的步骤，图9显示了pSKS和pSK9的构建，图10a和10b显示了pToC243和pToC266的构建中所涉及的步骤，图11显示了pMT1606的构建中所涉及的步骤，图12显示了pToC56的构建，图13a和13b显示了pJaL368的构建中所涉及的步骤，和图14a和14b显示了pToC338的构建。
定义在本说明书中使用了下列定义符号areAD意指其中araA基因被缺失的菌株，类似的符号用于其中pepC和／或pepE基因被缺失的菌株。
符号areA-意指不产生功能性AreA激活物的菌株。术语“功能丧失”也常用于该目的。类似的符号用于不产生功能性PepC和／或PepE蛋白酶的菌株。
术语“反义技术“描述了在例如US 5，190，931中公开的方法。发明详述如上所述，本发明的第一方面涉及真菌，其中的areA基因已由重组DNA技术修饰，使它不能以提供功能性AreA激活物的方式表达，并且其中的编码胞外蛋白酶PepC和／或PepE的基因已被灭活，使它们不能表达产生功能性蛋白酶。
这一目的具体来说可以通过缺失或破裂areA、pepC和／或pepE基因达到。
在实施例中描述了areA、pepC和／或pepE基因的克隆。
其它真菌的AreA类似物可以通过与一种已知的基因杂交或者通过areA突变体(例如在本说明书中描述的构巢曲霉areA-18或米曲霉areA菌株)的互补作用来克隆。
用于缺失或破坏基因的方法具体地说是在WO 90／00192(Genencor)中有描述。
用于在基因中置换DNA的方法一般来说是已知的，并且该置换可以通置换个基因的一个或多个连续的部分来完成，但是它也可以由定点诱变(产生编码非功能性AreA激活物变体的DNA序列)来达到。
可以达到这样的目的另一种方法是通过利用反义技术。
反义技术以及如何使用它在以上提及的US 5，190，931(纽约大学)中有详细描述。
获得灭活的另一种方法是通过在araA基因内插入额外的DNA，从而导致无功能的激活物蛋白质的表达。
与这一方法相结合，由克隆所提供的信息可以用于制备可被整合进araA基因的DNA构建体，并且甚至用另一种基因(例如pyrG基因)取代araA基因。
避免存在araA激活物的方法是通过干扰表达信号的调节作用，该表达信号调节araA基因自身的表达。
以上所描述的原则可等同地用于pepC和／或pepE基因。
按照本发明，优选的真菌属于选自下组的属，该组包括曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、假丝酵母属(Candida)、顶孢霉属(Acremonium)、镰刀菌属(Fusarium)以及青霉属(Penicillium)。
在这些属中，选自下组的种是优选的，该组包括米曲霉(A．oryzae)、黑曲霉(A．niger)、泡盛曲霉(A．awamori)、A．phoenicis、日本曲霉(A．japonicus)、臭曲霉(A．foetidus)、构巢曲霉(A．nidulans)、T．reesei、T．harzianum、H．insolens、H．lanuginosa、禾谷镰孢(F．graminearum)、腐皮镰孢(F．solani)、产黄青霉(P．chrysogenum)等。
如上所述，本发明也包括产生本发明的第一方面的真菌的方法，其中所说的灭活已由缺失araA、pepC和／或pepE基因获得，该方法包括i)克隆兴趣真菌的areA、pepC和／或pepE基因，ii)产生各包含areA基因、pepC基因和／或pepE基因中之一的DNA构建体，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入，iii)用所说的构建体转化所说的真菌，和iv)分离areA-、pepC-和／或pepE-的转化体。
因为人们相信，PepC蛋白酶的成熟是由PepE蛋白酶控制的，所以本发明也包括产生本发明的真菌的方法，其中所说的灭活已由缺失araA和／或pepE基因获得，该方法包括i)克隆兴趣真菌的areA和pepE基因，ii)产生各包含areA基因和pepE基因中之一的DNA构建体，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入，iii)用所说的构建体转化所说的真菌，和iv)分离areA-和pepE-的转化体。
本发明也包括产生真菌的方法，其中所说的灭活已利用反义技术获得，该方法包括i)构建表达质粒，各个这样的质粒导致一种RNA分子的合成，所说的RNA分子互补于从areA基因、pepC基因和／或pepE基因转录的mRNA，ii)用所说的表达质粒和适当的标记转化所说的宿主真菌，该表达质粒和标记两者在不同的质粒上或者在相同的质粒上，iii)用所说的标记选择转化体，和iv)筛选所选择的转化体，以获得显示AreA、PepC和／或PepE产物的合成降低的菌株。
本发明的另一方面包括用于以上提到的方法中的DNA构建体。
就前述方法而言，所说的DNA构建体可以包含araA、pepC和／或pepE基因，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入。
这些DNA构建体的至少一个也可以进一步包含编码兴趣蛋白质产物的DNA序列，例如以下提到的那些。
就后面的反义方法而言，所说的DNA构建体可以包含连接到功能性启动子上的araA、pepC和／或pepE基因的反向DNA序列，从而使其mRNA至少部分互补于从araA、pepC和／或pepE基因产生的mRNA。
本发明的另一方面涉及一种产生所需基因产物(优选地是分泌产物)的方法，该方法通过在适当的条件下在合适的生长培养基中培养按照本发明的真菌，并回收和纯化所需的基因产物。
在基因产物由异源基因表达的情况下，编码所需基因产物的DNA序列可以是用于产生所说的真菌的DNA构建体的一部分。
然而，通常进行本发明真菌的单独的转化，以便制备能够产生所需产物的真菌。
用于转化真菌的方法是本领域已知的，参见例如EP 0 184 438A2(Gist-Brocades N．V．)和EP专利
发明者T·克里斯藤森, J·勒穆比克 申请人:诺沃挪第克公司