专利名称：一种猪应激综合征的快速检测方法
技术领域：
本发明属猪的遗传缺陷的检测方法。本发明设计四种引物采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)技术对引起猪应激综合征(Porcine Stress Syndrome，以下简称PSS)的氟烷基因(即兰尼定受体基因RYR1)进行体外扩增，电泳直接检测。
PSS可导致猪产生PSE(Pale，Soft and Exudative)肉和繁殖力下降，在我国每年可造成数亿美元的损失。传统的检测方法是让猪呼吸含4-5％氟烷的氧气，根据猪是否发生应激反应进行判断。该方法的最大缺点是不能检出杂合体而且价格昂贵、对人畜有害。PCR-RELPs(限制性酶切片段长度多态性)技术需要对PCR产物酶切后才能判断，两步才能完成。建立一种能分辨出RYR1基因三种基因型的快速简便的一步法对于猪的育种和生产十分必要。
本发明通过分析猪RYR1基因的碱基组成，建立了一种直接检测PSS的方法，通过一步操作即可分辨出被测试猪的基因型。
本发明设计四种引物(P1～P4)对从耳组织中以高盐法提取的基因组DNA在PCR仪上进行扩增。引物的碱基序列分别是P15′-CAGTTTGCCACAGGTCCTACCAG-3′P25′-TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3′P35′-GTAATGAGATCTTGGTTGGAGCA-3′P45′-TGTGTGCAATGGTGTGGCCGTGC-3′PCR反应物浓度分别为P11μM P20.5μM P30.5μM P40.05μM(浓度配比关系为2∶1∶10.1)，dNTPs(dATP，dTTP，dGTP和dCTP)各400μM，MgCl21.5mM，KCl50mM，Tris-HCl(pH8.4)10mM，Taq DNA聚合酶2uPCR反应总体积25μlPCR反应条件94℃2.5分钟→35个循环94℃65秒，66℃65秒，72℃65秒→72℃7分钟PCR产物在2％琼脂糖凝胶上以4V/cm电压降电泳2小时，经EB染色后紫外检测，进行基因型判定PSS阳性猪出现659bp和494bp两条带，阴性猪出现659bp和165bp两条带，杂合猪则以上三条带均可见。
本发明的优点是快速、简便、准确。从取样到检测出结果一般仅需1天时间。该方法容易掌握，检测准确率为100％。在瘦肉型猪的选育中，应用本发明所建立的方法在仔猪出生时即可准确判定是否携带导致PSS发生的RYR1基因，为以后的选种、选配、饲养管理以及杂交利用等提供科学依据。它的经济效益，一方面可以杜绝猪因PSS造成的死亡和PSE肉所带来的损失，另一方面还可以提高猪的繁殖力，使猪的活产仔数增加。它的推广必将产生显著的社会效益和经济效益，也具有广阔的应用前景。
本发明的操作流程如下从耳组织取样，保存于70％乙醇中→高盐法提取基因组DNA，溶于TE中→混匀PCR反应成分后，覆上→层矿物油→设置反应条件进行PCR反应→PCR反应产物点样、电泳→紫外检测，确定基因型。
实施实例长白猪PSS的检测在0.25mlPCR薄壁反应管中依次加入下列成分P1(20μM)1.25μlP2(20μM)0.625μlP3(20μM)0.625μlP4(2μM)0.625μldNTPs(2.5mM)4μl10×buffer(含15mM MgCl2)2.5μlddH2O(无菌)13.375μlTaq DNA聚合酶(2u/μl)1μl基因组DNA(100～500ng/μl)1μl混匀后加1滴矿物油，放入PCR仪中按以下条件进行扩增94℃2.5分钟→35个循环94℃65秒，66℃65秒，72℃65秒→72℃7分钟→4℃保存，反应结束后取10μl产物在2％琼脂糖凝胶上以4V/cm电压降电泳2小时，经EB染色后在紫外检测仪上可见659bp、494bp和165bp三条带，由此确定此猪为氟烷基因杂合体Nn。
权利要求
1.一种猪应激综合征(PSS)的快速检测方法。通过设计引物、引物浓度配比及反应温度和时间，其特征在于测试猪是否携带氟烷基因，以确定猪是否发生应激。
2.根据权利要求1所述的猪应激综合征的检测方法，其特征在于四种引物的碱基序列为P15′-CAGTTTGCCACAGGTCCTACCAG-3′，P25′-TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3′，P35′-GTAATGAGATCTTGGTTGGAGCA-3′，P45′-TGTGTGCAATGGTGTGGCCGTGC-3′。
3.根据权利要求1所述的猪应激综合征的检测方法，其特征在于四种引物的浓度配比为P1∶P2∶P3∶P4＝2∶1∶1∶0.1。
4.根据权利要求1所述的猪应激综合征的检测方法，其特征在于聚合酶链式反应(PCR)的反应条件为94℃ 2.5分钟→35个循环94℃ 65秒，66℃65秒，72℃ 65秒→72℃ 7分钟。
全文摘要
本发明属猪的遗传缺陷的检测方法。本发明设计四种引物:P
文档编号C12Q1/68GK1177642SQ9710601
公开日1998年4月1日 申请日期1997年8月5日 优先权日1997年8月5日
发明者杜立新, 姜运良 申请人:山东农业大学