专利名称：慢性疲劳综合症的诊断的制作方法
交叉引用有关的申请本申请为1996年10月9日提交的编号08/728,109的共同未决申请的部分继续申请。
政府许可参考在此描述的发明是在美国政府公众健康服务基金R21AI38378所支持的工作的期间完成的，美国政府对此发明有一定的权利。
本发明的领域本发明涉及通过检测一种与疾病相关的独特的分子标记诊断慢性疲劳综合症(CFS)。
本发明的背景慢性疲劳综合症(CFS)是一种未知病因的疾病，时常伴有突然的发作，流感样症状，进行性疲劳，低烧，肌痛和神经认知障碍，慢性疲劳综合症患者典型表现为Karnofsky行为值(KPS)降低。Karnofsky行为试验检查个体的行为和完成正常活动的能力。Kamofsky行为值为零表示无行为能力或死亡患者，100表示完全正常的功能。但仍然不能诊断慢性疲劳综合症。
累计的证据表明慢性疲劳综合症与体液和细胞免疫的紊乱相关，包括促分裂原反应、病毒的复活、细胞因子的产生异常、自然杀伤细胞功能降低和中间代谢的改变。有证据表明在慢性疲劳综合症中观察到的临床和免疫的异常可能包括双链RNA依赖性干扰素诱导途径如2’、5’-寡腺苷酸(2-5A)合成酶/RNA酶L和p68激酶(PKR)抗病毒防御途径的缺陷。(Suhadolnilk等，临床感染性疾病(Clin.Infect.Dis.)18:S96-S104,1994；Suhadolnik等，In Vivo8:599-604(1994).2-5A合成酶/RNA酶L途径是哺乳动物细胞抗病毒机制的一部分；这个途径在调节细胞生长和分化当中也起着一定的作用(Lengyel，生物化学年度综述(Ann.ReviewBiochem.)51:251-282,1982；Sen等，高级病毒研究(Adv.Virus Res.)42:57-102,1993)。
由双链RNA激活后，2’5’寡腺苷酸合成酶将ATP转换为5’-末端磷酸化的2’,5’-连接的寡腺苷酸，有生物学活性的活化的2’,5’-寡腺苷酸可以结合和激活一种潜伏的内切核糖核酸酶，即RNA酶L，它水解单链的病毒的和细胞的RNA，主要是在UpNp序列之后的RNA，从而抑制蛋白合成。
以前的关于慢性疲劳综合症中2’,5’-寡腺苷酸合成酶/RNA酶L途径的研究揭示了存在一种有显著差异的调节异常，其中2-5A合成酶主要是以它的激活形式存在，生物活性2-5A水平提高了，RNA酶L的活性升高(Suhadolnik等，临床感染性疾病，同上；Suhadolnik等，In Vivo，同上)。在慢性疲劳综合症中，丝氨酸-苏氨酸激酶(PKR)的表达是降低的(Suhadolink等，In Vivo，同上)。PKR控制通过eIF-2磷酸化途径的蛋白翻译的起始。
尽管已经知道这些，一个明确的关于慢性疲劳综合症的分子标记还没有得到确认。现在需要的是一种生物化学试验，它依赖于明确的慢性疲劳综合症分子标记，它可以成为慢性疲劳综合症明确诊断的基础。
缩写本文可能使用下列缩写AMP腺嘌呤核苷5’-单磷酸2-azido-AMP2-腺苷5’-单磷酸8-azido-AMP8-腺嘌呤核苷5’-单磷酸；2,8-azido-AMP2,8-腺嘌呤核苷5’-单磷酸；2-5A 2’,5’-寡腺苷酸，即具有(2’→5’)磷酸二脂键和5’-三磷酸化的腺苷酸低聚物；CFS 慢性疲劳综合症；dsRNA双链RNA；ELISA酶联免疫吸附实验；etheno-AMP N1N6-亚乙烯基腺苷5’-单磷酸；GST 谷胱甘肽S-转移酶；HEPES4-(2-羟乙基)-哌嗪乙磺酸PMBC 外周血单核细胞；PBS 磷酸盐缓冲盐溶液p3A3 具有(2’→5’)-磷酸二脂键和5’-三磷酸的腺苷酸三聚体；pApAp(8-azidoA) 5’-O-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-叠氮基腺苷；poly(U)-3’-pCp 多聚尿苷酸，有胞嘧啶残基结合于3’末端；SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
发明概述一种诊断慢性疲劳综合症的方法，包含检测患者样品以探察一种大约30kDa的RNA酶L的存在。
在一个实施方案中，本方法包括(a)在非变性条件之下，根据分子量分离患者样品中的蛋白质，(b)在分离的蛋白质中，检测大约30kDa具有RNA酶L活性的蛋白质。RNA酶L活性测定可以包含，例如检测在水解28S和/或18SRNA中形成的特异的裂解产物(SCP)，或者检测poly(U)-3’-pCp的水解。
根据另外的实施方案，本发明包括一种诊断慢性疲劳综合症的方法，包括(a)将外源蛋白酶抑制剂存在下制备的患者样品与一种探针接触，该探针中包含一种如式(Ⅰ)所示的带有可检测标志的化合物或该化合物的水溶性盐，接触条件足以形成所述标记探针化合物与样品中2’,5’-寡腺苷酸结合蛋白的共价结合物
其中m是从0到3的整数，n是从1到3的整数，每个R1和R2彼此独立于其他的R1和R2，为氢或N3，条件是至少一个R1或R2是N3；(b)将包含所说共价结合物的样品与一种抗体接触，该抗体能与样品中的RNA酶L种类相结合；(c)通过凝胶电泳分离所述样品中的蛋白质；和(d)检查分离的蛋白质，寻找标记蛋白质，它(ⅰ)已经与标记探针化合物形成共价结合物，(ⅱ)已经与所说抗体结合；根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，存在约37kDa表观分子量的标记蛋白质，可以诊断为慢性疲劳综合症。
根据本发明的又一实施方案，本发明涉及一种诊断严重慢性疲劳综合症的方法，它包括一种诊断慢性疲劳综合症的方法，包括(a)将外源蛋白酶抑制剂存在下制备的患者样品与一种探针接触，该探针中包含一种如式(Ⅰ)所示的带有可检测标志的化合物或该化合物的水溶性盐，接触条件足以形成所述标记探针化合物与样品中2’,5’-寡腺苷酸结合蛋白的共价结合物
其中m是从0到3的整数，n是从1到3的整数，每个R1和R2彼此独立于其他的R1和R2，为氢或N3，条件是至少一个R1或R2是N3；(b)将包含所说共价结合物的样品与一种抗体接触，该抗体能与样品中的RNA酶L种类相结合；(c)通过凝胶电泳分离所述样品中的蛋白质；和(d)检查分离的蛋白质，寻找标记蛋白质，它(ⅰ)已经与标记探针化合物形成共价结合物，(ⅱ)已经与所说抗体结合；根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，存在约37kDa表观分子量的标记蛋白质，且根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，不存在约80kDa表观分子量的标记蛋白质，可以诊断为严重的慢性疲劳综合症。
根据本发明的又一实施方案，本发明提供一种评价慢性疲劳综合症的相对的严重程度的方法，包括在自然的条件下检测患者样品中的分子量大约30kDa和80kDa的RNA酶L分子的存在。存在分子量大约30kDa的RNA酶L分子而不存在分子量大约80kDa的RNA酶L分子，表示严重的慢性疲劳综合症。两种分子量的RNA酶L分子均存在，表明病情较轻。检测可以按下列方法实施(a)在非变性条件之下，根据分子量分离患者样品中的蛋白质，及(b)在分离的蛋白质中，检测大约30kDa和80kDa的具有RNA酶L活性的蛋白质。
图1显示在外周血单核细胞(PBMC)提取物与2-5A显影探针[32P]pApAp(8-azidoA)培养、UV(紫外线)照射和与抗重组人RNA酶L的多克隆抗体培养后，从中收集的蛋白A-琼脂糖结合蛋白的分离(10％SDS-PAGE)和放射自显影。P=患者；C=对照。泳道1,4-9患慢性疲劳综合症的个体；泳道2,3代表健康的对照。在核糖体RNA裂解试验中检测到的RNA酶L活性泳道1-9分别为79,54,37,73,59,253,127,＞500和253。
图2显示在自然的(非变性)条件下，对健康的(板块A)和慢性疲劳综合症(板块B和C)的个体外周血单核细胞中的提取物进行分析性凝胶渗透HPLC分离的结果。提取物是用[32P]pApAp(8-azidoA)进行显影标记后进行分离的。通过闪烁光度法，测定从每个外周血单核细胞提取物中分离的各个级分的放射活性。板块D、E和F显示的是与板块A、B和C相同的健康(板块D)和慢性疲劳综合症(板块E,F)个体外周血单核细胞提取物的分析性凝胶渗透HPLC分离结果，本次是在自然的(非变性)条件下进行，然后对各级分进行RNA酶L活性检测。各个级分的等份试样均在p3A3和poly(U)-3’-pCp存在的情况下进行检测。在级分0-150中没有检测到2-5A结合或2-5A依赖的RNA酶L活性。分子量标志由箭头标示。健康个体的外周血单核细胞提取物(板块A和D)也示于图1的第2泳道。图2中的板块B和E所代表的慢性疲劳综合症的外周血单核细胞提取物也示于图1的第1泳道。图2中的板块C和F所代表的慢性疲劳综合症的外周血单核细胞提取物也示于图1的第8泳道。
图3表示在存在(+)或不存在(-)蛋白酶抑制剂情况下，经用2-5A显影探针[32P]pApAp(8-azidoA)进行光亲和标记、用抗重组人80kDa RNA酶L多克隆抗体免疫沉淀后制备的外周血单核细胞提取物(100μg蛋白质)，用10％SDS-PAGE分离后收集的蛋白质级分。经过光亲和标记和免疫反应性2-5A结合蛋白由10％SDS-PAGE分离，并由磷光定量。2-5A结合蛋白的分子量已在图中标明。泳道1、2慢性疲劳综合症外周血单核细胞提取物。泳道3、4健康对照的外周血单核细胞提取物。
本发明的详细描述生物学活性的2-5A结合和激活潜伏的内切核糖核酸酶，即RNA酶L。激活的RNA酶L进而水解单链的病毒和细胞RNA，藉此抑制蛋白质合成。目前已经明确健康个体的细胞提取物中含有一种大约80kDa的2-5A结合蛋白，它具有2-5A依赖的RNA酶L活性。提取物中可能还含有一种大约42kDa的2-5A结合蛋白，也具有2-5A依赖的RNA酶L活性。慢性疲劳综合症患者已经被证明具有一种不同的30kDa的2-5A结合蛋白，也具有2-5A依赖的RNA酶L活性。“RNA酶L活性”指RNA酶L水解它的RNA底物的酶活性。
一组慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞经检查含有分子量大约在80和30kDa的2-5A结合蛋白，其具有2-5A依赖的RNA酶L活性。在制备患者的外周血单核细胞提取物时不加入蛋白酶抑制剂，也可以观察到分子量大约42kDa的具有2-5A依赖的RNA酶L活性的2-5A结合蛋白。大约80kDa蛋白的存在相应于较轻的慢性疲劳综合症。另一组慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞中，仅仅在30kDa处含有2-5A结合活性和2-5A依赖的RNA酶L活性。这种情况与更严重的慢性疲劳综合症相关。无论疾病的严重程度如何，患慢性疲劳综合症的人可以通过其体内存在大约30kDa的RNA酶L而得到确认，它在不受慢性疲劳综合症困扰的人体内是找不到的。通过在自然条件下检测这种独特和在此之前未知的大约30kDa的RNA酶L，第一次可能进行慢性疲劳综合症的明确和毫不含糊的生化检验。与此相类，在非自然条件下检测到一种大约37kDa的蛋白也与慢性疲劳综合症相关。
根据本发明，采集怀疑患慢性疲劳综合症的个体的样品，并检测这种大约30kDa的2-5A依赖的RNA酶L。样品可以取自任何合适的含有RNA酶L的细胞。可以用血液或其一部分，如血清或血浆。RNA酶L在单核细胞中大量存在。因而，样品的优选来源包括外周血单核细胞。样品要经过离心收集细胞、裂解细胞、去除细胞残渣，才能获得无细胞的提取物。该提取物然后用来检测这种大约30kDa的RNA酶L的存在。
根据本发明的一个实施方案，外周血单核细胞是从肝素化的血液中用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离的，胞浆提取物按照Suhadolnik等，生物化学(Biochemistry)22:4153-4158(1983)提供的方法进行制备。为了避免RNA酶L的活性丢失，胞浆提取物必须在血液采集后的两小时之内进行。简而言之，肝素化的血液用PBS按1∶1比例稀释。将两倍体积的稀释后血液置于一倍体积的密度为1.080的Ficoll-Hypaque之上(Boyum,Seand.J.Clin.Lab.Invest.97:1-109,1968)，于20℃以1000g离心30分钟。取出外周血单核细胞层，用5倍体积的PBS洗一次。将分离后的外周血单核细胞重悬于5ml的红细胞裂解缓冲液中(155mM NH4Cl,10mM NaHCO3,pH7.4,0.1mM EDTA)，冰浴中放置5分钟，用PBS洗两遍。分离后的外周血单核细胞重悬于0.1或0.2ml(大约10倍于细胞体积)的缓冲液(20mM HEPES,pH7.5,5mM MgCl2,120mM KCI,10％甘油，1mM二硫苏糖醇)中，该缓冲液还包含0.5％NONIDET P-40，继续冰浴10分钟裂解细胞。在25℃以8000g离心6分钟，获得胞浆提取物。无细胞提取物可以在分装后于-70℃无限期保存，每份25或50μl。
蛋白酶抑制剂可以随意加入胞浆提取物中，例如Mini-CompleteTM蛋白酶抑制剂混合片剂(Boehringer/Mannheim)，根据厂商说明使用。Mini-CompleteTM抑制剂包含抑肽酶、亮抑蛋白酶肽、pefablocSC和EDTA。在此所说的与细胞提取物的准备有关的“外源蛋白酶抑制剂”意思是另外添加的外源蛋白酶抑制剂，不包括在细胞提取物中天然存在的蛋白酶抑制剂。当细胞提取物被表述为“在外源的蛋白酶抑制剂存在的情况下制备”时，所指的是在细胞提取物中有大量的蛋白酶抑制剂存在并足以完全抑制蛋白酶的活性。
然后该无细胞的细胞提取物可用于检测大约30kDa慢性疲劳综合症RNA酶L的存在。用″大约″来表述不同的RNA酶L的分子量，指一个所述分子量加或减1kDa范围内的分子。细胞提取物在自然的非变性的条件下按分子量进行分级分离。然后，大约30kDa的成分被用于在2-5A或其能够结合到并激活级分中RNA酶L的类似物存在下检测2-5A依赖的RNA酶L活性。“自然条件”指在分级分离过程中可以使样品中的RNA酶L的活性大体上得以保持的实验条件。值得指出的是，自然条件指不使蛋白质变性的条件，特别是不使酶变性的条件。按分子量分离蛋白质的非变性条件是本领域技术人员所熟知的。按分子量进行蛋白质的非变性分离可以有利地通过凝胶渗透高压液相层析技术进行。用于这一目的的一种层析材料是SUPERDEX200，来自Pharmacia LKB Biotechnology,Piscataway,NJ。该材料可以有效地分离分子量在15kDa到200kDa范围内的蛋白质。
分子量大约30kDa的成分的2-5A依赖的RNA酶L活性可以通过大量不同的RNA酶L分析试验来确定。RNA酶L的活性分析试验可以采用检测中心纤维素(core-cellulose)的形式(Silverman等，分析生物化学(Anal.Biochem.)144:450-460,1985，该文引入这里作为参考)，它包括在2-5A中心纤维素上固定和部分纯化2-5A结合蛋白，并通过将poly(U)[32P]pCp转变为酸溶性片段来检测样品中的RNA酶L活性。
此外，2-5-A依赖的RNA酶L活性可以通过一种核糖体RNA裂解实验来检测，即测定一种高特异性的特殊裂解产物(SCP)(Suhadolnik等，临床感染性疾病，同上，该文引入这里作为参考)。相应地，样品与一种缺乏RNA酶L的L929细胞亚克隆(完整的28S和18S核糖体RNA来源)的胞浆提取物(每实验用140μg蛋白)在30℃孵育60分钟。提取总RNA，变性并进行1.8％琼脂糖凝胶电泳分析。溴化乙锭染色后，紫外光下可见RNA类似物。由于RNA酶L的活性所形成的特殊裂解产物可以通过凝胶摄影的光密度示踪进行测定，它表示为在孵育结束时反应产物(SCP)与残留底物(28S和18S核糖体RNA)的比率。关于SCP的讨论请参考Wreschner等，自然(Nature)289:414-417(1981)，该文引入这里作为参考。
按照另一种方法，大约30kDa分子量级分的2-5-A依赖的RNA酶L活性可以通过测定经过合适标记的RNA酶L的底物如放射底物的水解来进行检测。例如，存在于蛋白级分中的RNA酶L可以通过将该级分与底物poly(U)-3’-[32P]PCp在p3A3存在下接触，然后通过闪烁光度法测定放射活性，从而测定酶的活性。
除测定30kDa RNA酶L以外，相同的方法也可用于测定大约80kDa蛋白种类的存在，该蛋白存在于正常个体的细胞中。机体中存在约30kDa RNA酶L分子而缺乏约80kDa RNA酶L分子，表明患者患有严重的或后期的慢性疲劳综合症。两种分子量的RNA酶L分子均存在，表明患者的病情较轻。患有严重慢性疲劳综合症，即其细胞提取物中只有30kDa RNA酶L分子，而没有80kDa 2-5A分子的患者，其Karnofsky行为值(KPS)一般为60或更低。这些患者同样也缺乏约42kDa的RNA酶L种类，后者在健康人对照和病情较轻的慢性疲劳综合症患者中是可以观察到的。那些细胞提取物中含有约30kDa和约80kDa RNA酶L两种种类的慢性疲劳综合症患者的KPS值一般为60。
根据按分子量分离蛋白的另一种可选择的方法，患者样品中的蛋白质可以通过传统的方法使用盐类如硫酸铵以及某些溶剂如丙酮或丁醇进行部分纯化，然后再进行二乙氨基乙基纤维素色谱分离。本方法进行蛋白质分离的基础在于电荷。由于总电荷的不同，30和80kDa形式的RNA酶L可以运用本方法进行分离。
根据本发明的另一项可用于判定患有严重的慢性疲劳综合症的患者的实施方案，细胞提取物用含有一种2-5A叠氮基类似物的光探针进行光亲和标记，然后与RNA酶L的抗体进行免疫沉淀和按分子量分离。本方法可以特异性识别那些能与2-5A结合的并与RNA酶L进行免疫反应的蛋白质，并清除那些能与RNA酶L进行免疫反应，但不是2-5A结合蛋白的蛋白质。本方法同样可以清除那些不能与抗体发生免疫反应的2-5A结合蛋白。
经过光标记/免疫沉淀/分离的、在无外源蛋白酶抑制剂的情况下制备的健康个体的细胞提取物，和经过光标记/免疫沉淀/分离的症状较轻的慢性疲劳综合症患者的细胞提取物，均进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测分子量为80和37kDa的2-5A结合蛋白。在无外源蛋白酶抑制剂存在的情况下，分子量大约42kDa的2-5A结合蛋白也能被检测到。对于症状较轻的慢性疲劳综合症患者，本方法检测的是分子量大约37kDa的2-5A结合蛋白。分子量为约80kDa的2-5A结合蛋白没有被观察到。即使在无外源蛋白酶抑制剂的情况下，分子量为42kDa的2-5A结合蛋白也没有被观察到。当健康个体的细胞提取物在存在外源蛋白酶抑制剂的情况下制备时，经过光标记/免疫沉淀/分离的细胞提取物中也没有观察到分子量约37和约42kDa的2-5A结合蛋白。
因此，光标记/免疫沉淀/分离的方法也可以用来检测大约80kDa 2-5A结合蛋白的缺乏，并因而判定患有严重慢性疲劳综合症的患者。请记住，当细胞提取物是在无外源蛋白酶抑制剂的情况下制备的时，本方法不能区分健康个体和那些症状较轻的慢性疲劳综合症患者。若健康个体的细胞提取物是在加入外源蛋白酶抑制剂的情况下制备的，大约37kDa的2-5A结合蛋白没有被观察到，而在同样加入外源蛋白酶抑制剂的情况下，该分子可在慢性疲劳综合症患者的细胞提取物中检测到。因此，如果细胞提取物是在加入外源蛋白酶抑制剂的情况下制备的，这种光标记/免疫沉淀/分离的方法就可以用于区分正常细胞提取物与慢性疲劳综合症患者的细胞提取物。
应该认识到，如果用前述的光标记/免疫沉淀/分离的方法，在无外源蛋白酶抑制剂的情况下，在健康个体的细胞提取物中检测到大约37kDa的2-5A结合蛋白，那么检测到的这种分子在健康个体中是缺乏2-5A RNA酶L活性的。
在光标记/免疫沉淀/分离的方法中使用的光探针包括上述式Ⅰ的2-5A类似物，其中一个或多个2-5A分子的腺嘌呤残基上的2-或8-氢被叠氮基所取代，或两个氢都被叠氮基取代。对细胞提取物中的2-5A结合蛋白进行光标记的方法包括，细胞提取物与标记的光探针(如放射性探针)互相接触，在足以形成光探针与2-5A结合蛋白的共价结合物的条件下进行。一般而言，这一过程就是在低强度紫外光下将细胞提取物与光探针的混合物孵育来完成的。用作光探针的2-5A叠氮基类似物的制备方法在美国专利4,990,498(酶法合成)和Charubala等，Helv.Chim.Acta72:1354-1361(1989)(化学合成)中有描述。将这两份文献的整个公开内容引入本文作为参考。2-5A叠氮基类似物可以有效地结合并激活RNA酶L。由于叠氮基具有光敏感性，在低强度紫外光照射下，2-5A叠氮基类似物迅速形成氮烯自由基活性中间产物(C-N)。该氮烯自由基中间产物与生物分子反应并对其进行共价的光标记。2-5A叠氮基类似物的原位光活化以及结合到RNA酶L上并不会妨碍RNA酶L的活性(参见美国专利4,990,498，图2)。
式(Ⅰ)的2-5A叠氮基类似物可以包含一种叠氮基-AMP(如2-叠氮基-AMP)的低聚体，如2-叠氮基腺苷酰-(2’→5’)2-叠氮基腺苷酰-(2’→5’)2-叠氮基腺苷酸；2-叠氮基-AMP和8-叠氮基-AMP两者的低聚体，如2-叠氮基腺苷酰-(2’→5’)8-叠氮基腺苷酰-(2’→5’)2-叠氮基腺苷酸；AMP和2-叠氮基-AMP或8-叠氮基-AMP的低聚体，如2-叠氮基腺苷酰-(2’→5’)2-叠氮基腺苷酰-(2’→5’)2-叠氮基腺苷酸，或者可以是由AMP、2-叠氮基-AMP、8-叠氮基-AMP或2,8-叠氮基AMP单体任意组合而成的低聚体，条件是其中至少有一种这样的单体是叠氮基-腺苷酸。
用于本发明的实践的式Ⅰ2-5A叠氮基类似物优选是三聚体(n=1)。5’-磷酸化程度优选是单磷酸化(m=1)。特别优选其中含有一个或多个8-叠氮基残基的低聚物，尤其是2’-末端核苷酸是8-叠氮基腺苷酸的2-5A叠氮基类似物，如5’-O-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-叠氮基腺苷酸。
2-5A叠氮基类似物优选带有一种可被检测的标志，以保证它可以被辨认。标志可以包括，如放射性标志，象32P,3H,14C或15N。32P是最强的β粒子发射源，因而是优选的标志。此外标志可以包括一个或多个亚乙烯基基团，它具有很强的荧光。一个或多个腺嘌呤核心的6位碳原子上的氨基可以转变成亚乙烯基以形成N1N6-亚乙烯基腺苷酸，或者荧光低聚体可以由亚乙烯基-腺苷酸从头合成，或者形成-个由亚乙烯基-AMP、叠氮基-AMP单体、和AMP单体组成的复合物，复合物中要保证至少有一个单体含有亚乙烯基-AMP。参见Suhadolnik等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)252:4125-4133(1977)，其整个公开内容引入本文作为参考。其他检测生物分子的标志是本领域技术人员已知的。
用2-5A叠氮基类似物光标记之后，细胞提取物即与RNA酶L的多克隆抗体结合。用于免疫沉淀的抗体包含抗人重组80kDa RNA酶L的多克隆抗血清，该抗血清也可以识别慢性疲劳综合症的约30kDa的RNA酶L。由于全长的cDNA序列已知，人重组80kDa的RNA酶L可以用标准的重组技术进行表达(Zhou等，细胞(Cell)72:753-765,1993，引入本文作为参考，GeneBank序列，登记号L10381，引入本文作为参考)。抗人重组80kDaRNA酶L的多克隆抗血清的获得是应用已知技术，用重组蛋白免疫动物并收获抗血清而得到的。
抗RNA酶L抗体可以包括完整的抗体，或能结合抗原的片段，包括但不仅限于Fab和F(ab’)2片段。因此，这里所说的“抗体”，包括完整的抗体分子和那些具有抗原结合能力的片段。标记的第二抗体可以随意选用，以帮助识别由抗RNA酶L抗体所形成的抗原-抗体复合物。第二抗体能够结合到RNA酶L上，或者能结合到抗RNA酶L的第一抗体上。标记的第二抗体可以包括如绵羊抗兔、山羊抗兔、或鼠抗兔IgG，在这种情况下，选用的第一抗体是兔的抗体。
第二抗体的标记可以通过物理或化学的方法检测。这类标记包括放射标记；发光标记如荧光、紫外吸收或光吸收标记；以及酶标记。任何合适的放射性同位素均可作为标记，如125I,131I3H和14C。在酶联免疫吸附实验中，标记物是一种酶，如碱性磷酸酶，它可以裂解发光底物，释放发光的裂解产物。在使用碱性磷酸酶的情况下，底物可以包括如酚酞单磷酸酯或对硝基苯基磷酸酯。
免疫沉淀之后，对提取物中形成的包括抗体、光探针和2-5A结合蛋白的复合物进行纯化，通过蛋白A-树脂(如蛋白A-琼脂糖)吸附，然后洗涤、将蛋白从树脂中洗脱出来。洗脱出的蛋白经过凝胶电泳分离，通过检测光探针或抗体上的标记，那些经过光标记/免疫沉淀的2-5A结合蛋白就可以被观察到。标记条带的分子量可以参考已知的分子量标准而确定。
本发明的实际应用可以通过下面的非限制性例子而阐明。所有慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞提取物在非变性条件下进行检测，均可检出特征性的30kDa的RNA酶L，而所有健康对照均缺乏这种低分子量的RNA酶L。因此，这种约30kDa的RNA酶L是慢性疲劳综合症的分子标志。在此提供的资料同时表明除了以这种大约30kDa的RNA酶L为特征以外，最严重的慢性疲劳综合症的病例还以细胞内缺乏大约80kDa的RNA酶L种类为特征。症状较轻的慢性疲劳综合症患者细胞内还有这种大约80kDa的RNA酶L种类，同时也有大约30kDa的RNA酶L种类种类。因此，基于所获得的资料，80kDa和30kDa的RNA酶L的出现模式与慢性疲劳综合症临床表现的严重程度相关。
用叠氮基-光标记、免疫沉淀和在非变性条件下对2-5A结合蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，也获得了类似的结果。检测到表观分子量大约37kDa的2-5A结合蛋白而没有大约80kDa的2-5A结合蛋白，与严重的慢性疲劳综合症相一致。而两种蛋白条带都存在，则与较轻的慢性疲劳综合症症状相关。
实施例1在变性条件下通过叠氮基光亲和标记和免疫沉淀确定慢性疲劳综合症的标志分子A 研究对象和对照本研究的对象是那些先前已经被诊断为符合慢性疲劳综合症诊断标准的个体和健康人对照，该诊断标准是美国疾病预防和控制中心(CDC)于1988年发布的(Holmes等，Ann.Intern.Med.108:387-389,1988)。患者和对照是从在内华达州和北卡罗来纳州进行的医学实践中挑选的。患者和对照的挑选标准以及研究开始时的临床变量由Suhadolnik等，临床感染性疾病18:S96-S104(1994)描述。在抽取血样时，选择的症状要经过一个自定等级症状列表进行评估。疲劳的程度使用Karnfsky行为值进行评估(平均KPS值=56)。收入了十个年龄和性别匹配的对照对象。对每个慢性疲劳综合症患者和对照都要询问病史和进行体检。对照组的年龄分布与慢性疲劳综合症患者组没有显著性差异(慢性疲劳综合症组平均年龄=46岁，对照组平均年龄=41.7岁)。所有对照个体均经过面试并明确排除患有慢性疲劳或其他任何值得注意的症状；体检的结果均正常。本研究获得了当地的学术审查委员会(Institutional Review Boards)的批准。每个患者和对照均在被充分告知后同意参加实验。外周血单核细胞用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从肝素化的血液(50ml)中分离，胞浆提取物按前述方法Suhadolnik等，生物化学22:4153-4158(1983)制备，该文献的整个公开内容引入本文作为参考。胞浆提取物是在无外源蛋白酶抑制剂的情况下制备的。B． 重组的人RNA酶L多克隆抗体的产生全长的人类RNA酶L cDNA已由Zhou等，细胞72:753-765(1993)描述，其整个公开内容引入本文作为参考，它在GenBank的登记号是L10381，后者也引入本文作为参考。产生抗RNA酶L多克隆抗体所需要的纯化的重组人80kDa RNA酶L用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白策略获得。按照Sobol等，生物化学杂志270:5963-5978(1995)(整个公开内容引入本文作为参考)描述的步骤，获得了在大肠杆菌中表达的谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白。抗通过用高度纯化的重组人谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白免疫在新西兰白兔体内诱导产生重组人80kDa RNA酶L的多克隆抗体。免疫前制备血清，留作对照(免疫前血清)。第一天初次免疫使用100μg谷胱甘肽-RNA酶L与等体积的完全弗氏佐剂的混合物。加强免疫是在第14,21,19和84天进行，使用50μg谷胱甘肽-RNA酶L(50％天然和50％热变性蛋白)与不完全弗氏佐剂的混合物。用于制备抗体的血清样品在第120、150和180天抽取，此前还要附加加强免疫。用人凝血酶裂解谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白后，按厂商说明书操作，将RNA酶L共价偶联到戊二醛活化的柱上(Whatman)。将氢硼化钠循环过柱以减少未偶联RNA酶L的戊二醛。将含有抗RNA酶L多克隆抗体的兔抗血清在室温过戊二醛柱1小时，按厂商说明书进行洗脱。使用人293细胞(ATCC CRL1573)提取物和大肠杆菌表达的重组谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白，按Sobol等(同上)描述的方法，用Western印迹法确认抗RNA酶L多克隆抗体。C．在变性条件下对外周血单核细胞提取物中的2-5A结合蛋白进行叠氮基光亲和标记和免疫沉淀2-5A叠氮基光探针ApAp(8-azidoA)的化学合成、用[γ-32P]-三磷酸腺苷(ATP)和多核苷酸激酶对其进行5’-单磷酸化制备[32P]pApAp(8-azidoA)和对存在于外周血单核细胞中的2-5A结合蛋白进行光标记，这些已由Charubala等，Helv.Chim.Acta72:1354-1361(1989)描述，其整个公开内容引入本文作为参考。2-5A结合蛋白的光标记按如下进行，将在无外源蛋白酶抑制剂情况下制备的外周血单核细胞提取物(100μg蛋白质)，与2-5A光探针[32P]pApAp(8-azidoA)(60μCi/nmal,5μCi)在4℃共孵育30分钟，继而于0℃用紫外光(8000瓦特/cm2)照射30秒。光标记混合物再与亲和纯化的RNA酶L多克隆抗体(24μg蛋白质)和30μl蛋白A-琼脂糖以及100μl PBS混合。该混合物于4℃旋转混合一小时。用PBS洗三次，再与40μl蛋白助溶液混合，煮沸5分钟，室温下10,600xg离心5分钟。上清用10％SDS-PAGE分离。对干胶进行放射自显影，可显示由叠氮基-光标记/免疫沉淀的2-5A结合蛋白。这种联合的叠氮基-光标记/免疫沉淀方法去除了那些能与抗RNA酶L多克隆抗体发生免疫反应但不是2-5A结合蛋白的蛋白质；同样也可以去除那些不能与抗RNA酶L多克隆抗体结合的2-5A结合蛋白。D．结果在本实验的变性条件下，在健康对照(图1，泳道2,3)和一组慢性疲劳综合症患者(图1，泳道1,4,5)的外周血单核细胞中可以观察到三种2-5A结合蛋白，分子量分别为80、42和37kDa。然而，光亲和标记/免疫沉淀法显示在另一组慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞中(图1，泳道6,7,8,9)只观察到一种估计分子量为37kDa的2-5A结合蛋白；没有观察到80或42kDa的2-5A结合蛋白。泳道1、4、5所代表的患者，其慢性疲劳综合症的症状较轻。泳道6、7、8、9所代表的患者，其慢性疲劳综合症的症状要严重得多。因此，本研究中的检测结果与患者的慢性疲劳综合症症状的严重程度相关。
在对外周血单核细胞的制备和处理时，并没有从蛋白酶介导的约80kDa的RNA酶L的降解中产生约37kDa的2-5A结合蛋白。磷光分析定量显示在慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞提取物中观察到的37kDa的蛋白条带，不论蛋白酶抑制剂存在与否，其强度都是一致的。这表明这种约37kDa的蛋白是稳定的。
实施例2在自然(非变性)条件下通过叠氮基光亲和标记和检测2-5A依赖的RNA酶L的酶活性确定慢性疲劳综合症的标志分子A． 自然条件下，用分析性凝胶渗透高压液相层析(HPLC)方法估定外周血单核细胞中的2-5A结合蛋白的分子量慢性疲劳综合症患者和健康对照的外周血单核细胞提取物(200μg蛋白质)于4℃与[32P]pApAp(8-azidoA)(109pCi/nmol,10pCi)共孵育30分钟，紫外光照射(8000瓦特/cm2,30秒，0℃)，上样于Superdex200(Hiload16/60)凝胶过滤柱(Pharmacia Biotech Inc.)，室温下用25mMTris-Cl(pH7.4),80mM KCl,1mM EDTA,5mM MgCl2,0.1mM ATP及14mMβ-氢硫基乙醇混合液以0.5ml/分的流速洗脱，按每份0.5ml收集。每份收集液中共价连接到2-5A结合蛋白上的[32P]azido2-5A光探针在TmAnalytics model6895闪烁分光光度计中，采用Cerenkov放射(50％的效率)闪烁光度法进行测量。Superdex200柱用肌球蛋白、β-半乳糖苷酶、磷酸化酶b、牛血清白蛋白、卵清蛋白、碳酸脱水酶和大豆胰蛋白酶抑制物(分子量分别为220,116,97.4,68,44,31，和21.5kDa)进行校准。B． 在自然条件下经过分析性凝胶渗透高压液相层析(HPLC)后外周血单核细胞提取物中的2-5A依赖的RNA酶L的酶活性在自然条件下，慢性疲劳综合症患者和健康对照的外周血单核细胞提取物(200μg蛋白质)经Superdex200凝胶过滤柱分离，方法已在前段述及。分离后的每个部分各取等分样品(5-20μl)，通过水解反应混合物(15-30ul)中的poly(U)-3’-[32P]pCp(20,000dpm)，来测定RNA酶L的活性。反应混合物中含有p3A3(1×10-8M到1×10-7M)(Sobol等，同上)。非特异性RNA酶活性是通过在反应混合物中不含有p3A3时检测其对反应混合物(15-30μl)中的poly(U)-3’-[32P]pCp(14,000dpm)的水解来测定的。使用Scintiverse Ⅰ(Fisher)(效率＞99％)来完成放射活性测量。C．结果在自然条件下分析健康对照的外周血单核细胞提取物，发现RNA酶L的活性存在于80和42kDa蛋白中(图2，板块A和D)。在一组慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞提取物中，观察到了三种具有2-5A依赖的RNA酶L活性的2-5A结合蛋白。在这一组中，在80、42和37kDa或在80、42和30kDa处观察到2-5A依赖的RNA酶L活性(图2，板块B和E)。在第二组慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞的提取物中(如图1，板块6,7,8,9),80或42kDa处没有观察到2-5A依赖的RNA酶L活性，然而在30kDa蛋白中观察到2-5A依赖的RNA酶L活性(图2，板块C和F)。在对照实验中使用poly(C)-3’-[32P]pCp，以表明在外周血单核细胞提取物中观察到的2-5A依赖的RNA酶L酶活性并不是非特异的RNA酶活性。在任何级分中均未发现水解poly(C)-3’-[32P]pCp的现象，这也可作为2-5A依赖的RNA酶L存在的一个附加证据。[32P]pApAp-(8-azidoA)光探针的特异性在使用可靠的p3A3所进行的竞争性实验中已经得到证明(资料未列出)。此外，在缺乏2-5A时，未观察到poly(U)-3’-[32P]pCp的水解，2-5A是RNA酶L的变构活化物。
在变性条件下经过SDS-PAGE分析而观察到的37kDa 2-5A结合蛋白，有理由相信与在自然条件下观察到的30kDa蛋白一致。这是参考了在自然条件下和变性条件下所观察到的分子量上的差异的计算的有关著作后得出的结论(Somerville等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)117:3837-3842,1995)。
实施例3免疫反应性2-5A结合蛋白对蛋白水解作用的稳定性在制备外周血单核细胞提取物时，分别在存在蛋白酶抑制剂和不存在蛋白酶抑制剂的情况下进行，以评估提取物的制备和处理过程中可能的蛋白降解作用。在存在蛋白酶抑制剂的情况下制备胞浆提取物时，制备方法按照厂商的指导进行(Mini-CompleteTM蛋白酶抑制剂混合片剂，Boehringer/Mannheim，含有抑肽酶、亮抑蛋白酶肽、pefablocSC和EDTA)。Suhadolnik等，临床感染性疾病，同上。叠氮基光探针[32P]pApAp(8-azidoA)共价结合到2-5A结合蛋白上并进一步用重组的人80kDa抗RNA酶L多克隆抗体进行免疫沉淀而纯化。经过SDS-PAGE后，经过光亲和标记的免疫反应性2-5A结合蛋白通过磷光显影分析而定量。在有蛋白酶抑制剂存在的情况下，慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞提取物中除了80kDa的2-5A依赖的RNA酶L以外，还含有一种37kDa的低分子量的免疫反应性2-5A结合蛋白(图3，泳道1)。在没有蛋白酶抑制剂存在情况下，对同一慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞提取物进行光亲和标记和免疫沉淀，则显示除了80kDa的2-5A依赖的RNA酶L以外，还存在分子量为37和42kDa的免疫反应性2-5A结合蛋白(图3，泳道2)。磷光显影定量表明在慢性疲劳综合症患者的外周血单核细胞提取物中观察到的37kDa蛋白条带，无论蛋白酶抑制剂存在与否，都具有同样的光强度，这表明该37kDa的蛋白是稳定的(图3，泳道1,2)。在有蛋白酶抑制剂存在情况下，健康对照的外周血单核细胞提取物中仅能探测到80kDa的RNA酶L(图3，泳道3)。在没有蛋白酶抑制剂存在情况下植被的相同提取物中，80kDa的RNA酶L的量减少了70％(图3，比较泳道3和4)。然而，无论蛋白酶抑制剂存在与否，健康对照的外周血单核细胞提取物中均未检测到37kDa的2-5A结合蛋白(图3，泳道3和4)。在被检测的少数健康对照的外周血单核细胞提取物中，观察到一种50kDa的2-5A结合蛋白，但没有37kDa的蛋白(图3，泳道4)。然而，这种50kDa的2-5A结合蛋白在检测其对poly(U)-3’-[32P]pCp的水解时，却没有发现它表现出2-5A依赖的RNA酶L活性(资料未显示)。
在此引用的关于合成、制备和分析步骤所有参考资料均被引入本文作为参考。
本发明可能在不脱离其实质或根本的情况下以其他具体形式实施，因此，关于本发明的范围应参考所附的权利要求书，而不是前面的说明书。
权利要求
1．一种诊断慢性疲劳综合症的方法，包括检测患者样品中一种约30kDa的RNA酶L的存在。
2．根据权利要求1的方法，其包括(a)在自然条件下对患者样品中的蛋白质按分子量分离；(b)在分离后的蛋白质中检测一种具有RNA酶L活性的约30kDa的蛋白质。
3．根据权利要求1或2方法，其中所述样品包括血液或其中的其一部分。
4．根据权利要求3方法，其中所述样品包括外周血单核细胞的胞浆提取物。
5．根据权利要求2到4任意一项的方法，其中RNA酶L的活性的检测包括检测水解28S和/或18S RNA后的特异裂解产物的形成。
6．根据权利要求2到4任意一项的方法，其中RNA酶L活性的检测包括检测poly(U)-3’-pCp的水解。
7．根据权利要求6的方法，其中包含在所说的poly(U)-3’-pCp上的标志包括一种放射性标志。
8．根据权利要求7的方法，其中所述标记的poly(U)-3’-pCp是poly(U)-3’-[32P]pCp。
9．一种诊断慢性疲劳综合症的方法，包括(a)将外源蛋白酶抑制剂存在下制备的患者样品与一种探针接触，该探针中包含一种如式(Ⅰ)所示的带有可检测标志的化合物或该化合物的水溶性盐，接触条件足以形成所述标记探针化合物与样品中2’,5’-寡腺苷酸结合蛋白的共价结合物
其中m是从0到3的整数，n是从1到3的整数，每个R1和R2彼此独立于其他的R1和R2，为氢或N3，条件是至少一个R1或R2是N3；(b)将包含所说共价结合物的样品与一种抗体接触，该抗体能与样品中的RNA酶L种类相结合；(c)通过凝胶电泳分离所述样品中的蛋白质；和(d)检查分离的蛋白质，寻找标记蛋白质，它(ⅰ)已经与标记探针化合物形成共价结合物，(ⅱ)已经与所说抗体结合；根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，存在约37kDa表观分子量的标记蛋白质，可以诊断为慢性疲劳综合症。
10．根据权利要求9的方法，其中所说的形成共价结合物的条件包括用紫外光照射所说的样品，使所说的探针化合物共价结合到样品中的2’,5’-寡腺苷酸-结合蛋白上。
11．根据权利要求9或10的方法，其中探针化合物中的n等于1。
12．根据权利要求9或11的方法，其中探针化合物中的m等于1。
13．根据权利要求9到12中任意一项的方法，其中探针化合物中的各个R1是氢。
14．根据权利要求13的方法，其中探针化合物是5’-0-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-叠氮基腺苷酸或其盐。
15．根据权利要求9到14中任意一项的方法，其中所述样品包括血液或其一部分。
16．根据权利要求15的方法，其中所述样品包括外周血单核细胞的胞浆提取物。
17．根据权利要求9到16中任意一项的方法，其中所述探针化合物上的可检测标志是一种放射标志。
18．根据权利要求17的方法，其中所述放射标志是32P原子。
19．一种检测严重的慢性疲劳综合症的方法，包括(a)将外源蛋白酶抑制剂存在下制备的患者样品与一种探针接触，该探针中包含一种如式(Ⅰ)所示的带有可检测标志的化合物或该化合物的水溶性盐，接触条件足以形成所述标记探针化合物与样品中2’,5’-寡腺苷酸结合蛋白的共价结合物
其中m是从0到3的整数，n是从1到3的整数，每个R1和R2彼此独立于其他的R1和R2，为氢或N3，条件是至少一个R1或R2是N3；(b)将包含所说共价结合物的样品与一种抗体接触，该抗体能与样品中的RNA酶L种类相结合；(c)通过凝胶电泳分离所述样品中的蛋白质；和(d)检查分离的蛋白质，寻找标记蛋白质，它(ⅰ)已经与标记探针化合物形成共价结合物，(ⅱ)已经与所说抗体结合；根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，存在约37kDa表观分子量的标记蛋白质，且根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，不存在约80kDa表观分子量的标记蛋白质，可以诊断为严重的慢性疲劳综合症。
20．根据权利要求19的方法，其中形成共价结合物的条件包括用紫外光照射所说的样品，使所说的探针化合物共价结合到样品中的2’,5’-寡腺苷酸-结合蛋白上。
21．根据权利要求19或20的方法，其中探针化合物中的n等于1。
22．根据权利要求19到21中任意一项的方法，其中探针化合物中的m等于1。
23．根据权利要求19到22中任意一项的方法，其中探针化合物中的每个R1都是氢。
24．根据权利要求23的方法，其中探针化合物是5’-O-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-叠氮基腺苷酸或其盐。
25．一种评估慢性疲劳综合症的相对严重程度的方法，包括在自然条件下检测患者样品中的分子量约30kDa和约80kDa的RNA酶L分子的存在，(ⅰ)存在分子量约30kDa的RNA酶L分子，而不存在分子量约80kDa的RNA酶L分子，表示严重的慢性疲劳综合症；(ⅱ)两种分子量的RNA酶L分子均存在，表示慢性疲劳综合症病情较轻。
26．根据权利要求25的方法，包括(a)在非变性条件下，按照分子量分离患者样品中的蛋白质；(b)在分离的蛋白质中检测约30kDa和约80kDa的具有RNA酶L活性的蛋白质。
27．根据权利要求25或26的方法，其中所述样品包括血液或其一部分。
28．根据权利要求27的方法，其中所述样品包括外周血单核细胞的胞浆提取物。
29．根据权利要求26到28任意一项的方法，其中RNA酶L活性的检测包括检测poly(U)-3’-pCp的水解。
30．根据权利要求26到28任意一项的方法，其中RNA酶L活性的检测包括检测水解28S和/或18S RNA后的特异裂解产物的形成。
全文摘要
慢性疲劳综合症可以通过在自然的条件下检测体内细胞(例如外周血单核细胞)的蛋白提取物中的约30kDa的RNA酶L分子而进行诊断。在非变性情况下,将蛋白按分子量进行分离,在分离后的蛋白中检测具有2’,5’－寡腺苷酸RNA酶L活性的约30kDa的蛋白的存在。可以通过检测分子量大约30kDa和80kDa的RNA酶L分子在体内的存在情况来判定病情的严重程度。存在大约30kDa的RNA酶L分子而缺乏大约80kDa的RNA酶L分子,与严重的慢性疲劳综合症相关;两种RNA酶L分子均存在,表明病情较轻。在变性情况下并同时存在蛋白酶抑制剂时,慢性疲劳综合症可以通过检测一种大约37kDa的2－5A结合蛋白而进行诊断。
文档编号C12Q1/34GK1232508SQ9719860
公开日1999年10月20日 申请日期1997年9月19日 优先权日1996年10月9日
发明者R·J·舒哈多尼克 申请人:坦普尔大学