专利名称：以lgE拮抗剂治疗特应性皮炎的制作方法
背景技术：
免疫球蛋白E(IgE)是一类免疫球蛋白(或称“抗体”)分子。IgE在人血清中的存在浓度较其他种类的免疫球蛋白如IgG、IgM、IgA、IgD等要低。IgE被认为在人体防御寄生虫的侵袭中起作用，但该作用从未被明确地确定为是必要或者甚至是有益的，至少在发达国家中，寄生虫感染并非一项严重的问题。IgE作为即发型超敏变态反应的介体是众所周知的，这些变态反应包括变应性鼻炎(枯草热)，外因性气喘，以及食物和药物变态反应。
在由IgE介导的变态反应过程中，IgE由B细胞分泌出来后，通过其Fc部份结合到FcεRⅠ受体上，该受体存在于嗜碱粒细胞、肥大细胞及朗格罕氏细胞的表面。如果结合到这些细胞表面上的IgE与变应原接触并结合，会引起这些结合IgE分子的交联，继而使得其下的受体亦随之交联，从而触发一些药理学介体释放，所述介体是诸如组胺、5-羟色胺、白三烯和过敏性的慢反应物质。这些介体引起了变态反应的病理表现。
某些曾经历过IgE介导的部分或全部变应性疾病的患者，亦容易患一种叫做特应性皮炎的痛苦的皮肤病。特应性皮炎的特征是瘙痒、红斑、以及疼痛的皮肤损害。部分慢性皮炎患者，其皮肤会苔藓化。虽然特应性皮炎通常会与其它变应性疾病同时出现，但尚未确定在感染患者身上，其特应性皮炎的表现或其严重性与IgE含量高低之间存在关联。该领域的技术人员相信，特应性皮炎也许与IgE有关，但单独的IgE并非病原物质。
已开发出一类特别的抗IgE抗体用来治疗变应性疾病。这些抗体结合分泌型IgE，但不会结合已附着在FcεRⅠ受体上的IgE。当这些抗IgE抗体给药至人体内部时，它们会结合IgE并中和它，使其不能再结合FcεRⅠ或FcεRⅡ受体，后者存在于B细胞或其他细胞类型上。这些抗IgE抗体也会结合附着在生成IgE的B细胞的细胞膜上的IgE(称“膜结合型IgE”)。这些抗体结合上后，会通过依赖抗体的细胞毒性(“ADCC”)或补体介导的细胞溶解，进一步帮助下调或消除产生IgE的B细胞，并因此减少分泌型IgE的含量。但是，由于它们不结合已附着在FcεRⅠ上的IgE，因此不会引起交联，它们本身也不会导致变态反应的药理学介体的释放。
在动物模型及人体临床试验中已显示此类抗IgE抗体可降低IgE含量(参见Corne等，《临床检查杂志》99,No.5,879-887,1997)。此类抗IgE抗体在数项人体临床试验中还显示具有治疗变应性鼻炎和外因性气喘的功效，正如由其降低体内IgE含量的事实所预期的那样。(参见Corne等，同上；Boulet等，《Am.J.Respir.Crit.Care Med.》155:1835-1840(1997)；Fahy等，《Am.J.Respir.Crit.Care Med.》155:1828-1834(1997))。利用这些抗IgE抗体来治疗特应性皮炎则尚未进行任何临床试验。由于高IgE含量与特应性皮炎症状的严重性之间缺乏相互关联，一般人不会预期到这些抗体将可用于特应性皮炎的治疗。至于其他IgE拮抗剂，是通过防止或抑制IgE结合到FcεRⅠ并且不引起变态反应的药理学介体释放而起作用，它们亦不会被预期对治疗特应性皮炎有效。这类拮抗剂包括小分子和其他新的化学或生物实体。
虽然依据常规判断，光靠减少或去除IgE而不附加其他方式将不会有效地治疗特应性皮炎，但本申请依据的前提则是IgE拮抗剂，包括单独的抗IgE抗体，将证明是有效的治疗药剂。事实上，抗IgE抗体将证明能对特应性皮炎患者提供比本领域技术人员预期的更好的实质效果。
如果所选的IgE拮抗剂为抗IgE抗体，则可利用下列技术对其进行修饰，目的是减低其抗原性以更适于人体给药。所述技术包括抗体嵌合法(chimerization)，人源化(通过CDR移植)，或相反，包括用转基因动物生产全人抗体或通过噬菌体展示文库技术生产人抗体的单链片段。优选这些抗体具有人IgGl或IgG3重链恒定区，因为这类区域已知可介导ADCC和补体介导的细胞溶解，由此可辅助去除生成IgE的B细胞。本发明的药物组合物当通过诸如静脉内、肌内或皮下注射等方式内部给药时可能是最有效的。它也可利用不受消化分解的适当载体通过口服方式内部给药；或者通过吸入器送入肺部的肺泡。此外，该组合物也可能局部给药至受感染部位，让其在此吸收并局部起作用。
实施及使用本发明的描述1．实施本发明的各种实施方案适于用作IgE拮抗剂的化学或生物实体可以利用多种方法来选择和筛选，包括使用与下述用来筛选TES-C21的方法类似的测定。基本上，这些方法的第一步将是筛选结合分泌型IgE的物质，其后从这些物质中再选出不会导致变态反应的药理学介体释放的分子。本领域技术人员熟知的许多不同测定法都可用来完成这项工作。
在一个具体实施方案中，用于本发明的单克隆抗IgE抗体是由连续的(永生化的)、稳定的抗体生成细胞系生产的。优选的抗体生成细胞系是杂交瘤及转染瘤细胞系。不过，它们也可以是含有并能够表达已经过功能重排的、编码所研究抗体(或片段)的基因的任何一种细胞系。能自然生产装配型免疫球蛋白的淋巴样细胞是优选的。
生产本发明所用的特定抗体的杂交瘤细胞可以用Kohler及Milstein的标准体细胞杂交技术(《自然》256:495,1975年)制备，或用使用不同融合试剂的类似方法制备。该方法简述如下用已确定包含所研究的位于IgE Fc区域中的抗原表位的人IgE或生成IgE的B细胞或人IgE(分泌型或膜式)的肽区段对动物进行免疫接种，从而生产出单克隆的抗IgE抗体。肽可以化学合成或用重组DNA技术生产，为了增强抗原作用，可使其与载体蛋白诸如匙孔嘁血蓝蛋白缀合。之后，从免疫接种过的动物获得淋巴样细胞(如脾淋巴细胞)，并使其与无限增殖细胞(例如骨髓瘤或异骨髓瘤)融合生成杂交细胞。这些杂交细胞再用下文中详细描述的筛选方法筛选出能生产所需抗IgE抗体的那些。
当考虑抗体长期给药，就如同本文中用抗IgE治疗特应性皮炎时，这些抗体优选为人类抗体或基本上为人类抗体，以减少或消除人类抗小鼠(HAMA)抗体反应。小鼠抗体部分本身可能触发变态反应，或者针对这类部分的HAMA反应可能降低治疗的功效。
分泌人类抗体的人杂交瘤细胞可由Khler及Milstein技术生产。尽管治疗人疾病时特别优选人类抗体，但一般而言，利用此技术生成稳定的人-人杂交瘤来长期生产人类单克隆抗体是相当困难的。另一种生产人类抗体的技术是利用转基因小鼠。简言之，此方法牵涉到将内源性鼠重链和κ轻链部位破坏，随后构建含有V,D,J区段的重链和κ轻链转基因，以及人类来源的C基因。然后，使用人类转基因通过前核显微注射将这些基因引入小鼠体内。这些小鼠经杂交产生人类抗体生成菌株。此技术详述于许多文献，其中之一为美国专利第5,569,825号。此技术可由GenPharm International,Inc.(Mountain View,California,USA)公司授权获得。
另一种解决抗原性问题的方法是利用噬菌体展示文库法来生产如单链Fv区等全人类抗体片段。简言之，此方法涉及通过聚合酶链式反应(PCR)从骨髓、血液和扁桃体样品扩增人类V基因所有组成成分，接着制备含有重链和轻链(κ链和λ链)V基因的独立文库。然后将这些独立片段装配到单链Fv中用于展示在噬菌体表面，在此处可以容易地筛选出所需片段。更详细描述此技术的参考文献包括美国专利第5,565,332号及欧洲专利第0589877B1号。此技术也可由英格兰Melbourn的Cambridge Antibody Technology Limited公司授权获得。
用啮齿类动物特别是小鼠生产抗体是一项相当完备的技术。减少抗IgE抗体中鼠类部分的另一方法是先由啮齿类动物系统生产此抗体，再通过其他确定的技术将它们转变成嵌合啮齿动物/人抗体或CDR移殖的人源化抗体。嵌合抗体可以如美国专利第4,816,397号中所述进行生产。人源化抗体的制造见于各式参考文献，包括下列专利美国专利第5,693,762；5,693,761；5,225,539号及WO89/06692和WO92/22653等。
国际专利申请WO92/17207中描述了本发明的抗IgE抗体(称为TES-C21)及其嵌合鼠/人形式(称TESC-2)的一个实例。TES-C21及TESC-2的筛选方案(见下述)可同样用来筛选其他抗IgE抗体，以制得适合嵌合或通过CDR-移植人源化的本发明抗体。生产TES-C21的杂交瘤细胞系可自位于美国Maryland州Rockville市的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，登记号码为11134，生产TESC-2的细胞系以登记号BRL10706保藏在此。
按照1997年5月25日授权的澳洲专利第675449号中详细描述的方法制备小鼠抗体TES-C21的人源化变型。类似的操作可用来生产其他抗IgE人源化抗体。生产适用于本发明的人源化抗IgE抗体的数种转染瘤可自ATCC获得，其登记号码分别为11130；11131；11132；11133。其中，一种与从登记号11131保藏的转染瘤生产的抗体类似的抗IgE抗体具有用来治疗特应性皮炎的完全临床开发潜能。另一种适于治疗特应性皮炎的人源化抗体为E25(rhuMAb-E25)，由Genentech,Inc.公司生产。该抗体于下列文献中详述Presta等，《免疫学杂志》151:2623-2632(1993)。A.TES-C21及TESC-2的生产和筛选如下所述生产和筛选TES-C2及TESC-2。简言之，雄性Balb/c小鼠用来自人类血清的多克隆IgE(由Vertex公司提供)接种数次。该IgE与合适的佐剂混合。最后一次注射免疫原后将小鼠处死，取出脾脏，制备成单细胞悬浮液以备与骨髓瘤细胞融合。脾细胞利用聚乙二醇-1450(Kodak)、CMF-PBS和DMSO的融合混合物与Sp2/O细胞融合。在细胞悬浮液混合后加入DMEM。
由该融合产生的杂交瘤细胞利用酶联免疫吸附测定(ELISA)针对与Immulon2平板结合的人IgE进行筛选。这些杂交瘤细胞之一即生产TES-C21。
TES-C21进一步用ELISA进行筛选，选出对人IgE有特异性，并且不与IgG、IgM、IgA、IgD、人血清白蛋白、转铁蛋白或胰岛素等反应的那些。TES-C21与各种IgE分子同样结合得很好。此外，TES-C21还以剂量依赖方式结合分泌IgE的细胞系SKO-007、U266和SE44，显示此抗体可结合人类膜结合型IgE。但TES-C21不结合携带表面IgM、IgD、IgG或IgA的人类B细胞系；T细胞系；或SE44的鼠类母细胞系；或分泌嵌合人IgG的鼠细胞系。TES-C21也不结合高亲合力FcεRⅠ受体或低亲合力FcεRⅡ受体上的IgE，这些受体呈现在各种各样的细胞类型上。此外，TES-C21对新鲜制备的人血嗜碱粒细胞(其表面的FcεR粘附有IgE)亦不诱导组胺释放。TES-C21在10μg/ml的浓度下可完全抑制1μg的IgE对FcεRⅡ的结合。
为了生产TESC-2，将Sp2/O细胞用TES-C21重链和轻链的可变区、以及人γ1和κ恒定区共转染，并等分到96孔平板上用于选择。筛选分泌已与人IgE结合的人IgG的上清液。让转染瘤细胞在无血清的培养基中适应生长。然后TESC-2利用固定化蛋白A柱从铺满培养物的培养基中纯化。
TES-C21和TESC-2对结合在微量滴定板上的IgE可同样结合得很好。这可如下所述得以证明Immulon2平板用gp120肽-卵清蛋白缀合物包被，并将IgE-SE44结合到固定化抗原上。加入各种浓度的TES-C21或TESC-2。结合情况利用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(测TES-C21用)或HRP-山羊抗人IgG Fc(测TESC-2用)进行检测。
据测定，TES-C21和TESC-2对结合在微量滴定板上的IgE具有相同的相对亲合力。Immulon2平板用gp120肽-卵清蛋白缀合物包被，并将IgE-SE44结合到固定化抗原上。TES-C21和TESC-2分别以不同浓度加入，预温育1小时后，加入0.22μg/ml的生物素化TES-C21。生物素化TES-C21的结合利用与辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白进行检测。
TES-C21和TESC-2对生成IgE的细胞也显示出相等的结合。这由下述方法证明将细胞于2×106细胞/100μl PBS-1％山羊血清的状态下在不同抗体浓度下在0℃温育30分钟。TES-C21的结合情况利用FITC-山羊(Fab’)2抗小鼠IgG测定；TESC-2的结合情况则利用FITC-山羊(Fab’)2抗人IgG测定。结合情况使用Coulter Epics V通过萤光流式细胞计数仪定量测定。FITC强度门设置在当不存在最初的免疫球蛋白时得到10％±0.5％的阳性细胞。
TES-C21及TESC-2二者对已结合在低亲和力IgE受体上的IgE都不结合。TESC-2识别与CD23复合的IgE的可能性利用一个分泌IgG的人类淋巴母细胞系IM-9的细胞进行研究。IM-9细胞上存在CD23可由其被抗-Leu20强染色确证，抗-Leu20是一种对CD23具有特异性的MAb。IM-9细胞用5至10μg/ml的人IgE温育，洗涤，然后用生物素标记的TESC-2或阳性对照物抗IgE Mab TES-19温育，最后再用FITC-链霉抗生物素蛋白温育，通过流式细胞计数仪分析。
嵌合TESC-2和鼠TES-C21二者均可抑制IgE对FcεRⅡ的结合。抗体在不同浓度下用20μg IgE-SE44在37°下预温育一小时，然后加入带有FcεRⅡ的IM-9细胞。IgE与细胞的结合情况使用生物素化TES-19和FITC-链霉抗生物素蛋白检测，并用萤光流式细胞计数仪定量。
为了排除在这些实验中TESC-2与IgE在预温育过程中形成免疫复合物，其与细胞结合产生假阳性的可能性，用生物素标记的TESC-2或FITC山羊抗人IgE(带有TES-C21)确认这些免疫复合物也不结合FcεRⅡ。
TESC-2和TES-C21都不会诱导新鲜制备的人血嗜碱粒细胞(其上的FcεR结合有IgE)释放组胺。由于不同供体的嗜碱粒细胞释放不同的介体，因此抗体在多种浓度下对来自50名以上的单独供体的嗜碱粒细胞制剂进行检验。没有观察到TESC-2或TES-C21诱导组胺释放。
为了解决TES-C21可能结合嗜碱粒细胞但不诱导受体发生交联而导致组胺释放的问题，使用第二抗体进行交联。由于单独的抗人IgG可诱导组胺释放，因此在这些实验中仅使用鼠抗体TES-C21。交联山羊抗小鼠IgG增强了由亚最适浓度的对照抗IgE抗体诱导的组胺释放。不过，TES-C21即使在这些非常宽容的条件下仍没有诱导组胺释放。
进一步检测TESC-2，以确定其是否会阻断IgE对FcεR1受体的结合，以及TESC-2与IgE的免疫复合物是否会结合这些受体。为了测定TESC-2是否抑制人IgE结合FcεR1，将已在低pH值下通过处理去除了IgE的人外周血嗜碱粒细胞用衍生自SE44的对肽抗原具有活性的嵌合IgE重新加载或敏感化。SE44-IgE的功能结合通过IgE-SE44可变区结合的多价R15K肽-卵清蛋白辍合物诱导的组胺释放来测定。IgE-SE44用TESC-2预温育后抑制了IgE结合到FcεR1上。当嗜碱粒细胞接触IgE-SE44之前先用另一种IgE(PS)温育时，其与IgE-SE44的结合也受到抑制。可以假设，TESC-2与IgE在预温育过程中形成了免疫复合物且它们不会引起组胺释放。这些实验的条件和结果总结在下表1中。
表1:TESC-2对IgE结合高亲和力IgE受体的抑制
对于前面所提及的TES-C21的CDR-移植变型亦进行了上述这些研究，并且得到了类似的结果。
2．使用本发明的抗体治疗特应性皮炎本发明的IgE拮抗剂或抗体在可出售之前，必须经过人体临床试验以证实其安全有效。举一个例子说明，临床试验可由最多30名特应性皮炎患者开始。这些患者虽针对特应性皮炎进行了定期治疗，如用抗组胺药物、皮质类固醇、缓解浴和洗液等进行治疗，但其症状仍继续出现。这些患者将静脉内或皮下注射50至300毫克的抗IgE抗体，每周、隔周或每月注射一次，为期3至6个月。抗IgE治疗对特应性皮炎患者的疗效将用例如SCORAD指数打分(参见B.Kung等，《皮肤病学》195:10-19,1997)。此外将评估该疗法对循环IgE浓度的影响与临床功效之间的关系。
其他研究将测试不同的给药方案、给药间隔，并将比较抗IgE治疗与安慰药剂之间的差异。还将研究局部应用抗IgE的功效。本发明的药物组合物通过任何可接受的途径给药后，预期会对特应性皮炎患者产生显著效益。
以上描述、术语、表达方式和实施例等仅是例举性的，不具有限制作用。本发明包括所有前述实施方案的对等物，不管是已知或未知的。本发明的保护范围仅由下列权利要求书限定，而不应由本文件其他任何部分的任何陈述或其他任何来源决定。
权利要求
1．一种用于治疗特应性皮炎的药物组合物，它包含IgE拮抗剂。
2．一种用于治疗特应性皮炎的药物组合物，它包含与分泌型IgE结合但不与嗜碱粒细胞结合的抗IgE抗体。
3．一种用于治疗特应性皮炎的药物组合物，它包含与分泌型IgE和膜结合型IgE结合但不与嗜碱粒细胞结合的抗IgE抗体。
4．一种用于治疗特应性皮炎的药物组合物，它包含与分泌型IgE和膜结合型IgE结合、但不与嗜碱粒细胞和已结合了FcεRⅡ受体的IgE结合的抗IgE抗体。
5．如权利要求2至4中任何一项所述的药物组合物，其中抗IgE抗体不结合肥大细胞。
6．如权利要求2至4中任何一项所述的药物组合物，其中抗IgE抗体是单克隆抗体。
7．如权利要求6所述的药物组合物，其中抗IgE抗体是嵌合抗体、经CDR移殖人源化的抗体，或人类抗体。
8．如权利要求6所述的药物组合物，其中抗IgE抗体的作用目标是人IgE。
9．如权利要求8所述的药物组合物，其中抗IgE抗体具有人IgG1或IgG3重链恒定区。
10．如权利要求2至9中任何一项所述的药物组合物，它进一步包括使该组合物适于体内使用的赋形剂和溶剂。
11．如权利要求10所述的药物组合物，其中赋形剂和溶剂使该组合物适于皮下或静脉注射。
12．一种用于治疗特应性皮炎的药物组合物，它包含抗IgE抗体，该抗体具有与在美国典型培养物保藏中心以登记号BRL10706保藏的细胞系生成的抗体相同的性能。
13．一种用于治疗特应性皮炎的药物组合物，它包含抗IgE抗体，该抗体具有与在美国典型培养物保藏中心以登记号11131保藏的细胞系生成的抗体相同的结构。
全文摘要
本发明涉及用于治疗特应性皮炎的药物组合物,该组合物包含不会诱导变态反应的介体释放的适宜IgE拮抗剂;例如,结合分泌型IgE的抗IgE抗体,与生成IgE的B细胞表面上的膜结合型IgE结合的抗IgE抗体,但其不与已结合了嗜碱粒细胞或肥大细胞表面上的FcεRⅠ受体的IgE结合。优选这些抗体也不结合已与FcεRⅡ受体结合的IgE。这些抗体优选具有人IgG1或IgG3恒定区,以及其他人类抗体部分(如果需要的话)。该药物组合物可系统给药或局部给药。
文档编号C12N15/02GK1289253SQ99802505
公开日2001年3月28日 申请日期1999年1月6日 优先权日1998年1月29日
发明者张子文 申请人:泰诺士公司