专利名称：利用dna鉴定技术从经过发酵或烘烤处理的可可豆和巧克力中确定可可树的遗传物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用DNA鉴定技术从经过发酵和/或烘烤处理的可可豆和巧克力中确定可可树(cacao)的遗传物质。特别地，本发明涉及利用选自PCR、RAPD、RFLP或微卫星鉴定以及各自后续的DNA测序技术，从经过加工的可可豆或巧克力，确定可可树的品种和/或经过常规育种技术或基因工程改造得到的可可豆变种。
由于世界经济的全球化，来自世界各地的种类繁多的食物制品都可以在本地市场上买到。这种现象也同样适用于食物加工的不同阶段所使用的原材料和中间产品上。
除了新的国外食物制品进入本地市场以外，一些经过改造的、具有一系列显著不同特性的产品也可以在本地市场上得到。例如，从1996年起，从美国进口的经过基因工程改造的番茄制成的番茄酱就开始在英国市场上销售。
根据国家的法令，一些食物制品和原材料必须有标识以便能够确定其产地和/或质量等级。这样的标示程序的一个缺点是其标识可能会被无意或故意的调换，以至于购买者不能够总是完全相信这一类的标识。而且，对原材料排他性所有权的实施有可能要求在食物制品加工的不同阶段对原材料进行鉴定，包括最终上货架后的终产品。
因此，在本领域就需要有一种可靠的方法能够鉴定所感兴趣的食物制品中某些特殊原材料的存在与否或它们的产地。
随着DNA分析技术的发展，采用有效的方法从基因水平上鉴定原材料/食物制品的来源已经变得可行。不过这种技术可能只适用于食物产品/原材料中的遗传物质没有高度降解掉的情况下。
关于此方面，R.Greiner等在《Is there any possibility ofdetecting the use of genetic engineering in processed foods》(Z.Ernhrungswissenschaft36(1977),155-160)一文中指出，经过某些处理的食物产品，如披萨中的番茄、炸薯条等，可以通过使用PCR(聚合酶链式反应；Ehrlich et al.Science253(191),1643-1651)技术来检测其遗传物质。不过，在该文中，Greiner等也提到对于经过某些处理的食物产品，例如番茄汤、番茄淀粉、马铃薯泥等，无法进行上述的检测，因为其DNA已经在很大程度上被降解掉了。
对于可可粉来说，其制备过程所进行的操作步骤，例如可可豆的发酵、干燥和烘烤(通常是在105℃～120℃的温度条件下进行20～50分钟)通常被认为是对DNA的破坏性处理过程，因此可可粉的DNA不能被用于鉴定和控制经过发酵、烘烤的可可豆和巧克力的来源。
因此，本发明的目的之一就是提供能够在基因水平上从经过加工处理的可可豆和巧克力中鉴定可可树来源的方法。
在导致本发明的研究工作中，我们惊奇地发现与本领域内通常的观念相反，DNA鉴定技术实际上可以用于从经过加工处理可可豆和巧克力中检测遗传物质，而且这些技术可以有效地用于从基因水平上鉴定可可树的来源。
上述的目的是通过使用DNA鉴定技术，特别是PCR、RAPD、PFLP或微卫星鉴定及各自后续的DNA测序来实现的，用于检测的材料是经过发酵或烘烤处理的可可豆或巧克力。
通过使用上述技术，使得对可可树(种类)的鉴定工作成为可行。例如，鉴定在某种终产品，如巧克力中所使用的原料可可豆来自哪个特定的品种。这种方法还有一个引人注目的特点，即确定某些特殊的可可豆，例如通过常规技术改造或改良过的或者过基因工程改造的可可豆，是否被用于所感兴趣的巧克力的制造过程。
此外，本发明可以用于有效地控制经过发酵的干可可豆在进出口某一特定国家时的确切原产地，在工厂加工过程中的发酵烘干可可豆的产地和已上货架的巧克力的原产地。
本发明所涉及的DNA鉴定技术，包括PCR(Ehrlich等，文献见前)、RAPD(随机扩增多态DNA分析；Welsh等，“Fingerprintinggenomes using PCR with arbitrary primers.”,Nucleic Acids Res.18(1990),7213-7218)、RFLP(限制性内切酶片段长度多态分析；Botstein D.等，“Construction of a genetic map in man usingrestrction fragment length polymorphisms”Am.J.Hum.Genet.32(1980),314-331)和微卫星鉴定技术(Tautz,D.等，“Hypervariability of simple sequences as a general source forpolymorphic DNA markers”Nucl.Acid.Res.17(1989),6463-6471；Weber J.等，“Abundant class of human DNA polymorphismswhich can be typed using the polymerase chain reaction.”,Am J.Hum.Genet.44(1989).388-396)，在本领域内为人熟知。上述的文献在此引入作为参考。
在一个优选的实施方案中，利用上述检测技术检测的DNA是来源于可可树的5S基因、SSP基因(Seed Storage Protain gene；种子贮存蛋白基因，Spencer E.et Hodge,RPlanta 186(1992,567-576)或者几丁质酶基因。
在一个进一步的优选实施方案中，所检测的DNA来源于线粒体和/或叶绿体DNA。这种DNA的优点在于它可以稳定地从母代传到子代可可豆中，因而可以确定子代可可树的果实是否来源于某一特定的原始树种。这种方法也适用于子代可可树来源于一个雌株和不同雄株的情况下。
通过在经过发酵和/或烘干处理的可可豆和/或巧克力中应用DNA鉴定技术，其中优先选取的是PCR、RAPD、RFLP或微卫星鉴定技术及各自后续的DNA测序，同样有可能鉴定出在最终产品中存在的某种原材料，该材料来源于某个经过常规育种技术或基因工程技术改造或改良的特定树种。
图中所示内容
图1A显示的是不同来源的可可树DNA在琼脂糖凝胶上的电泳后，用溴化乙锭染色得到的结果照片。
图1B显示的是杂交试验的放射自显影结果。即将图1A中琼脂糖凝胶电泳得到的DNA转移到尼龙膜上，然后用放射性同位素32P标记的可可树DNA与之杂交。
图2显示的是不同可可树样品的5S基因间隔子DNA的PCR扩增产物，在琼脂糖凝胶上的电泳后经过溴化乙锭染色的结果照片。
图3显示的是不同可可树样品的SSP基因的内含子1和外显子2的PCR扩增产物，在琼脂糖凝胶上的电泳后经过溴化乙锭染色的结果照片。
图4显示的是不同可可树样品的RAPD分析结果。
在下面的例子中，将介绍用于从经过发酵和/或烘干处理的可可豆和/或巧克力中确定可可树DNA的各项技术。不过，应该理解的是本发明不只局限于这些例子，而是包含于附录的权利要求书范围内。
如果没有介绍则说明所使用的该项技术在《分子克隆》(SambrookJFritsch E.FManiatis T(1989),Molecular Cloning.ALaboratory Manual,second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press(USA))一书中有所描述。
实施例1从经过发酵处理的可可豆中提取DNA准备400毫克可可豆胚轴组织，在液氮中研磨粉碎；加入10毫升提取液(山梨糖醇0.35M、Tris-HCl 0.1M pH8、EDTA5mM、亚硫酸氢钠5g/l)后用IKA-Ultra-Turrax T25(Janke & Kunkel)进行匀浆；将得到的匀浆产物用Miracloth(Calbiochem)过滤然后离心(15分钟，1000g,4℃)；将沉淀物在5毫升提取液中重悬然后再次离心(15分钟，1000g,4℃)；将得到的沉淀物于0.5毫升提取液和0.5毫升裂解液(Tris-HCl0.2M pH8、EDTA50mM、NaCl2M、CTAB2％)以及0.1毫升5％的十二烷基肌氨酸钠组成的混合液中重悬并于65℃温育6分钟；将得到的裂解产物用1毫升三氯甲烷/异戊醇(24/1:v/v)混合液进行抽提；离心(15分钟、10,000g,4℃)后将水相中的DNA加入等体积的异丙醇在-20℃条件下进行沉淀并放置过夜；离心收集DNA，重悬于1mlTE缓冲液(Tris-HCl 10mM pH8、EDTA0.1mM)中，加入RNAse A(Sigma)至终浓度200g/ml，在37℃条件下温育30分钟，加入Proteinase K(Boehringer Mannheim)至终浓度400g/ml，在56℃条件下温育1小时以纯化DNA；用苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25/24/1:v/v/v)混合液除去蛋白质；离心(15分钟、1000g、4℃)后将水相中的DNA用3M、pH5.2的乙酸钠和冷乙醇组成的混合液(0.1/2:v/v；-20℃)进行沉淀并放置过夜；用玻璃棒搅拌使DNA附着于其上，用70％的乙醇溶液洗涤，然后将DNA沉淀重悬于50μl的TE缓冲液中。
实施例2从烘干的可可豆或可可粒和巧克力中提取DNA
准备60克市场上随处可见的黑巧克力(Nestlé,Grandschocolats,Noir(74％cocoa)；Auchan,Vendome Noir(52％cocoa)，或者25克可可粒(NestléSt.Menet,France)，同上所述在液氮中研磨粉碎然后加入200毫升提取液进行匀浆；将匀浆产物用Miracloth滤器过滤然后在4℃条件下1000g离心15分钟；将沉淀物在50毫升提取液中重悬然后再次离心(15分钟，1000g,4℃)；将得到的沉淀用5毫升提取液和7毫升裂解液(Tris-HCl0.2M pH8、EDTA50mM、NaCl2M、CTAB2％)以及2.4毫升5％的十二烷基肌氨酸钠组成的混合液重悬并于65℃温育60分钟；将得到的裂解产物用10毫升三氯甲烷/异戊醇(24/1:v/v)混合液进行抽提；离心(15分钟、10,000g,4℃)后将水相中的DNA加入等体积的异丙醇在-20℃条件下进行沉淀并放置过夜；连续离心两次(15分钟、10,000g,4℃)后，将沉淀物收集在一起，重悬于5mlTE缓冲液；用苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25/24/1:v/v/v)混合液纯化两次；离心后将水相中的DNA用3M、pH5.2乙酸钠和冷乙醇组成的混合液(0.1/2:v/v)在-20℃条件下进行沉淀并放置过夜；离心(15分钟、1000g,4℃)后将DNA沉淀重悬于30μl的TE缓冲液中，加入RNAse A(终浓度200μg/ml)在37℃条件下温育10分钟以进一步纯化DNA。
实施例3PCR DNA扩增共进行了两类PCR扩增实验，第一类扩增了rDNA5S基因的重复序列(1000到50000个拷贝/单倍体基因组)；第二类扩增了编码可可豆种子贮存蛋白(SSP)的单个基因，该基因在单倍体基因组中有3到5个拷贝。
核糖体5S基因间隔子的DNA扩增将用上述纯化方法得到的可可豆DNA、可可粒或巧克力DNA按1/500比例稀释于TE缓冲液中；将每一种经过稀释的DNA样品5μl和45μl PCR缓冲液混合进行DNA扩增，PCR缓冲液中含有200μM的四种dNTP、25ng的两种引物、2U的Taq聚合酶(Stratagéne)和终浓度为1.5mM的氯化镁。
所用的两种引物DNA序列如下
5’-TTTAGTGCTGGTATGATCGC-3’(SEQ.ID.No.Ⅰ)5’-TGGGAAGTCCTCGTGTTGCA-3’(SEQ.ID.No.Ⅱ)这两种引物是依照Kolchinsky等(“Portraying of plantgenomes using polymerase chain reaction amplification ofribosomal 5S genes”,Genome34(1991),1028-1031)的方法设计的。扩增过程是在一台Bio-Med 60/2(B.Braun)温度循环控制仪中进行，仪器操作程序设置如下首先在94℃进行2分钟的DNA变性过程，然后进行30个温度循环，包括94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟。最后的DNA延伸循环在72℃下进行7分钟。
种子贮存蛋白(SSP)的DNA扩增该DNA的扩增过程与上面描述的一致，用于检测SSP基因的引物设计如下5’-GGCAATTTACTTCGTGACAAACG-3’(SEQ.ID.No.Ⅲ)5’-CTCATATTTGCCAGGAGAATTAAC-3’(SEQ.ID.No.Ⅳ)实施例4随机扩增多态DNA(RAPD)分析DNA扩增方法如上面所述，不同的是所用的引物是由OperonTechnologies(Almeda,California)公司设计的十聚体核苷酸的随机引物。
引物序列和相应编号如下AG15 5’-CCCACACGCA-3’(SEQ.ID.No.Ⅴ)AM10 5’-CAGACCGACC-3’(SEQ.ID.No.Ⅵ)Z06(序列见Operon公司提供的PCR kit)扩增过程设置为45个循环，包括94℃1分钟、37℃1分钟和72℃2分钟。最后的DNA延伸循环依照Williams等(“DNA polymorphismsamplified by arbitrary primers are useful as genetic markers”,Nucl.Acids.Res.18(1990),6531-6535)采用的方法，在72℃条件下进行7分钟。
DNA电泳和杂交不同大小的DNA片段分离是在1.4％的琼脂糖凝胶上进行的，然后用溴化乙锭染色。Southern blots是根据Southern(Sambrook，如上)的方法，在碱性条件下利用毛细管现象将DNA片段转移到尼龙膜上(Appligéne)。DNA探针的制备是使用Megaprime kit(Amersham)，以32P dCTP作为标记物，然后在杂交缓冲液(5％w/v SDS、5X SSC、5X Denhart’s solution、40中μg/ml异源DNA)与尼龙膜进行杂交，在65℃条件下放置过夜。DNA杂交后的处理由3次在65℃条件下的高离子强度溶液洗涤过程组成，每次洗涤30分钟，3次洗涤溶液的组分如下2X SSC、0.1％SDS；1X SSC、0.1％SDS；0.2X SSC、0.1％SDS。
实施例5可可豆和巧克力的DNA检测所用的试验方法可以用于检测发酵过的可可豆和巧克力中高分子量的DNA。将咖啡和榛实DNA作为阴性对照。为了确保从可可粒和巧克力提取的DNA是来源于可可树，将经过纯化的可可树叶总DNA放射性标记后，与转移到尼龙膜上的DNA提取物进行杂交。经过放射自显影后，结果(图1B)显示出可可树叶DNA样品和巧克力中提取的DNA有很高的同源性，说明从样品中提取的DNA确实来源于可可树。
可可豆样品中DNA的PCR扩增为了测试从不同的样品中检测出特定DNA序列的可能性，采用了特定的DNA引物扩增串联重复的5S核糖体基因间隔子和种子贮存蛋白(SSP)的部分基因。
5S核糖体基因间隔子在包括可可树叶和巧克力的所有DNA样品中都成功地进行了扩增(图2)。电泳果显示，DNA的PCR扩增产物有微弱的成片条带，表明在可可豆加工过程中DNA有相当程度的降解；另外可可树叶和新鲜可可豆样品DNA扩增产物电泳后，从大约160bp到1000bp以上有不连续的DNA带。这些多重DNA扩增带是由于目的基因-5S核糖体基因串联重复结构的存在而产生的。
SSP基因中所扩增的部分与内含子1和外显子2对应，扩增后产生了一个长度为312bp的PCR产物，该产物在所有测试样品中都能够检测到(图3)。根据此结果可以认为从可可树叶和巧克力中检测单拷贝基因是可能的，因为SSP基因在Theobroma cocoa单倍体基因组中拷贝数是很低(3-5个拷贝)的。
SSP基因中扩增的部分用于检测DNA多态性。
可可豆样品的RAPD实验本实验的目的是为了说明通过获得经过加工处理的可可豆样品的RAPD指纹图谱，有可能从基因水平上确定用于制造巧克力的原料的来源。从Operon kits中选取3种引物用于扩增，结果如图4所示。DNA扩增能够从两种不同品种巧克力的混合物(Nestlé,Grandschocolats,Noir(74％cocoa)；Auchan,Vendome Noir(52％cocoa))中实现，说明将终产品与特定的原料关联起来确实是可能的。
实施例6可可豆和巧克力的DNA序列测定为了从基因水平上确定可可豆和巧克力不同样品的特征，在对两个不同的可可树基因(种子贮存蛋白(SSP)和几丁质酶基因)进行PCR扩增后，又进行了DNA的序列测定以检测DNA的多态性。用两种不同基因型的可可树(Laranja和EET95)得到的可可豆样品和巧克力作为试验材料。结果显示这两种基因型可以通过SSP和几丁质基因具体的DNA序列进行区分。
可可豆样品DNA的PCR扩增采用特定的DNA引物分别扩增两个不同可可豆样品中的基因片段。
SSP基因中所扩增的部分与内含子1、2、3和外显子2、3对应，扩增后产生长度为584bp的PCR扩增产物。将根据实施例2的纯化方法得到的可可豆、可可粒和巧克力中DNA按1/500比例稀释于TE缓冲液中；将每一种稀释的DNA样品5μl和45μl PCR缓冲液混合进行DNA扩增，PCR缓冲液中含有200μM的四种dNTP、25ng的两种引物、2U的Taq聚合酶(Stratagéne)和终浓度为1.5mM的氯化镁。
所用的两种引物DNA序列如下5’-GGCAATTTACTTCGTGACAAACG-3’(SEQ.ID.No.Ⅲ)5’-CCTCCAGCTTCTCTCTTTGTGT-3’(SEQ.ID.No.Ⅶ)扩增过程是在一台Braun60/2温度循环控制仪中进行，仪器操作程序设置为30个温度循环，包括94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟。最后的DNA延伸循环在72℃下进行7分钟。
几丁质酶基因片段的扩增是通过使用GCG公司(GeneticsComputer Group,USA)目录编号为U30324的基因组克隆序列进行的。所用的DNA扩增方法除了两种DNA引物的使用量为50ng外，与上面所述相同。PCR扩增产物的长度为1064bp。
所用的两种引物DNA序列如下5’-GCTGAGCAGTGTGGACGGC-3’(SEQ.ID.No.Ⅷ)5’-CCTCTGGTTGTAGCAGTCGA-3’(SEQ.ID.No.Ⅸ)经过发酵的可可豆和巧克力中扩增的SSP和几丁质酶基因片段序列如下对每一个基因(SSP和几丁质酶)和每一个树种(Laranja和EET95)都进行两次独立的PCR扩增。将每一次PCR扩增得到的DNA取出10ng，按照Promega公司的使用说明克隆到pGEM/T载体上。用重组质粒DNA转化感受态的JM109大肠杆菌细胞，然后在含有氨苄青霉素(100mg/l)、X GAL(40mg/l)和IPTG(20mg/l)的LB平板上培养。随机挑取5个含有SSP或几丁质酶基因的克隆用于测序。
通过SSP基因序列测定进行遗传物质的DNA鉴定SSP基因的序列可以用于从基因水平区分来源于Laranja和EET95可可树的不同可可豆样品，因为两种样品的DNA序列存在着2处核苷酸突变67位(G/A)和475位(C/G)，如下图所示Laranja可可豆样品SSP DNA序列(583bp):5’CCTCCAGCTTCTCTCTTTGTGTCTAACAAACAAGATAAAAATGAATAAATAAATAAATAAGTAAAAGACAAGAGAAAGTAAAAACAAAAAATTGATTCATAGCTAGTCAAAGAACCATATACATTGAAGACGGTCTCAAGAACTTCATAGCTGAAGGCTCCGTAATATGATTCAGGTTTATTATTTCCAGCGGGGAAGAATAACTGCAGCAATTATAAGTACAGGGTCAATAGACTAACCAAGACATCAAGGTTATGTAGAAACTTCTAATAAATAAATGTTAAAGTAGAAAACCTCATATTTGCCAGGAGAATTAACAGGCAGGGCGAGCACAGCTATGGTTAGCTTCTCTTGGTTGTCTTGGCTAACCACGTAAACAGTGCTTCCTGCAGGAACGCTGACTACTGTTCCACGCTGTACATTATAGGACTCTTTGTTTTCATGAGTCACAAACGTAATTGTCCCCTTTCCTGACACAGAAATAATTTACTATGTTTTCAATCAATGGTGATTTGGTGATAAAAGCCGCAAAATTTTGTTCGAAAGGGAAGAGAATTTACCGTTTGTCACGAAGTAAATTGCC-3’(SEQ.ID.No.Ⅹ)EET95可可豆样品SSP DNA序列(583bp):5’CCTCCAGCTTCTCTCTTTGTGTCTAACAAACAAGATAAAAATGAATAAATAAATAAATAAGTAAAAAACAAGAGAAAGTAAAAACAAAAAATTGATTCATAGCTAGTCAAAGAACCATATACATTGAAGACGGTCTCAAGAACTTCATAGCTGAAGGCTCCGTAATATGATTCAGGTTTATTATTTCCAGCGGGGAAGAATAACTGCAGCAATTATAAGTACAGGGTCAATAGACTAACCAAGACATCAAGGTTATGTAGAAACTTCTAATAAATAAATGTTAAAGTAGAAAACCTCATATTTGCCAGGAGAATTAACAGGCAGGGCGAGCACAGCTATGGTTAGCTTCTCTTGGTTGTCTTGGCTAACCACGTAAACAGTGCTTCCTGCAGGAACGCTGACTACTGTTCCACGCTGTACATTATAGGACTCTTTGTTTTCATGAGTCACAAACGTAATTGTCCCCTTTCCTGAGACAGAAATAATTTACTATGTTTTCAATCAATGGTGATTTGGTGATAAAAGCCGCAAAATTTTGTTCGAAAGGGAAGAGAATTTACCGTTTGTCACGAAGTAAATTGCC-3’(SEQ.ID.No.Ⅺ)通过SSP基因序列进行遗传物质的DNA鉴定几丁质酶基因的DNA序列也可以辨别来源于Laranja和EET95可可树的不同可可豆样品，两种样品的DNA序列存在着4处核苷酸差异266位(G/A)、425(核苷酸添加/删除)、615位(A/G)和865(A/G)，如下图所示，Laranja可可豆样品几丁质酶DNA序列(1062bp):5’GCTGAGCAGTGTGGACGGCAAGCTGGTGGTGCCCTGTGCCCTGGAGGCCTATGTTGTAGCCAATTTGGTGGGTGTGGCAACACTGATGACTACTGCAAAAGGGAAAATGGTTGCCAGAGTCAGTGCAGCGGAAGCGGAGGTGATACTGGTGGACTTGATAGTCTGATAACAAGAGAAAGGTTTGATCAGATGCTTTTGCATAGAAATGATGGTGGTTGTCCTGCTCGTGGCTTCTATACCTATGATGCTTTCATAGCTGCTGCGAGGTCTTTCCCTGCCTTCGCTACAACCGGTGATGATGCCACTCGCAAGAGGGAAGTTGCTGCTTTCTTGGCCCAAACTTCTCACGAAACTACTGGTTAGTCCACTTCGAAAGTTAATCACAAAGTTCACCATGTTTTGAACATGACTTCATCGGTTTGAGATTAATTTGATGATGCCGTAGGTGGAGCAGGATGGGCTGCACCCGATGGTCCATATACGTGGGGATACTGCTACAATAGGGAATTAAACCCCGCTGATTACTGCCAGTGGGATCCAAACTACCCTTGCGCTCCTGGTAAGCAATATTTTGGCCGGGGTCCAATGCAACTTACTTGGTAAGCCTTTCACCATTTGCTAATTTCTTTTCTTGAAATGTATTTATGGTAAGGCAAAATTGTTTTGTTGACATGGGAATAATCACTTAACTTTTGATATATCAGGAACTACAACTATGGGCAGTGTGGAAGAGCCATTGGGGTGGACCTATTAAACAACCCAGACCTGCTAGCAACTGATCCTACAATTTCTTTCAAGTCAGCGTTCTGGTTCTGGATGACTCCACAATCACCAAAGCCTTCTTGCCACGATGTGATCATTGGAGCGTGGTCACCCTCCGGTAGCGACCAGGCGGCAGGCCGGGTTCCAGGGTTTGGTTTGATCACAAATATTATCAATGGCGGCCTTGAATGTGGTCAAGGTTGGAATGCAAAGGTAGAGGACCGCATTGGGTTCTATAAGAGGTATTGTGACACACTTGGAGTTGGCTATGGTAACAATCTCGACTGCTACAACCAGAGG-3’(SEQ.ID.No.Ⅻ)EET95可可豆样品几丁质酶DNA序列(1063bp):5’GCTGAGCAGTGTGGACGGCAAGCTGGTGGTGCCCTGTGCCCTGGAGGCCTATGTTGTAGCCAATTTGGTTGGTGTGGCAACACTGATGACTACTGCAAAAAGGAAAATGGTTGCCAGAGTCAGTGCAGCGGAAGCGGAGGTGATACTGGTGGACTTGATAGTCT
序列表<110>SOCIETE DES PRODUITS NESTLE<120>可可树的鉴定<130>可可树的鉴定<140><141><150>98121043.8<151>1998-11-05<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>可可树<400>1tttagtgctg gtatgatcgc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>可可树<400>2tgggaagtcc tcgtgttgca 20<210>3<211>23<212>DNA<213>可可树<400>3ggcaatttac ttcgtgacaa acg 23<210>4<211>24<212>DNA<213>可可树<400>4ctcatatttg ccaggagaat taac 24<210>5<211>10<212>DNA<213>可可树<400>5cccacacgca 10<210>6<211>10<212>DNA<213>可可树<400>6cagaccgacc 10<210>7<211>22<212>DNA<213>可可树<400>7cctccagctt ctctctttgt gt 22<210>8<211>19<212>DNA<213>可可树<400>8gctgagcagt gtggacggc 19<210>9<211>20<212>DNA<213>可可树<400>9cctctggttg tagcagtcga 20<210>10<211>583<212>DNA<213>可可树<400>10cctccagctt ctctctttgt gtctaacaaa caagataaaa atgaataaat aaataaataa 60gtaaaagaca agagaaagta aaaacaaaaa attgattcat agctagtcaa agaaccatat 120acattgaaga cggtctcaag aacttcatag ctgaaggctc cgtaatatga ttcaggttta 180ttatttccag cggggaagaa taactgcagc aattataagt acagggtcaa tagactaacc 240aagacatcaa ggttatgtag aaacttctaa taaataaatg ttaaagtaga aaacctcata 300tttgccagga gaattaacag gcagggcgag cacagctatg gttagcttct cttggttgtc 360ttggctaacc acgtaaacag tgcttcctgc aggaacgctg actactgttc cacgctgtac 420attataggac tctttgtttt catgagtcac aaacgtaatt gtcccctttc ctgacacaga 480aataatttac tatgttttca atcaatggtg atttggtgat aaaagccgca aaattttgtt 540cgaaagggaa gagaatttac cgtttgtcac gaagtaaatt gcc 583<210>11<211>583<212>DNA<213>可可树<400>11cctccagctt ctctctttgt gtctaacaaa caagataaaa atgaataaat aaataaataa 60gtaaaaaaca agagaaagta aaaacaaaaa attgattcat agctagtcaa agaaccatat 120acattgaaga cggtctcaag aacttcatag ctgaaggctc cgtaatatga ttcaggttta 180ttatttccag cggggaagaa taactgcagc aattataagt acagggtcaa tagactaacc 240aagacatcaa ggttatgtag aaacttctaa taaataaatg ttaaagtaga aaacctcata 300tttgccagga gaattaacag gcagggcgag cacagctatg gttagcttct cttggttgtc 360ttggctaacc acgtaaacag tgcttcctgc aggaacgctg actactgttc cacgctgtac 420attataggac tctttgtttt catgagtcac aaacgtaatt gtcccctttc ctgagacaga 480aataatttac tatgttttca atcaatggtg atttggtgat aaaagccgca aaattttgtt 540cgaaagggaa gagaatttac cgtttgtcac gaagtaaatt gcc 583<210>12<211>1062<212>DNA<213>可可树<400>12gctgagcagt gtggacggca agctggtggt gccctgtgcc ctggaggcct atgttgtagc 60caatttggtg ggtgtggcaa cactgatgac tactgcaaaa gggaaaatgg ttgccagagt 120cagtgcagcg gaagcggagg tgatactggt ggacttgata gtctgataac aagagaaagg 180tttgatcaga tgcttttgca tagaaatgat ggtggttgtc ctgctcgtgg cttctatacc 240tatgatgctt tcatagctgc tgcgaggtct ttccctgcct tcgctacaac cggtgatgat 300gccactcgca agagggaagt tgctgctttc ttggcccaaa cttctcacga aactactggt 360tagtccactt cgaaagttaa tcacaaagtt caccatgttt tgaacatgac ttcatcggtt 420tgagattaat ttgatgatgc cgtaggtgga gcaggatggg ctgcacccga tggtccatat 480acgtggggat actgctacaa tagggaatta aaccccgctg attactgcca gtgggatcca 540aactaccctt gcgctcctgg taagcaatat tttggccggg gtccaatgca acttacttgg 600taagcctttc accatttgct aatttctttt cttgaaatgt atttatggta aggcaaaatt 660gttttgttga catgggaata atcacttaac ttttgatata tcaggaacta caactatggg 720cagtgtggaa gagccattgg ggtggaccta ttaaacaacc cagacctgct agcaactgat 780cctacaattt ctttcaagtc agcgttctgg ttctggatga ctccacaatc accaaagcct 840tcttgccacg atgtgatcat tggagcgtgg tcaccctccg gtagcgacca ggcggcaggc 900cgggttccag ggtttggttt gatcacaaat attatcaatg gcggccttga atgtggtcaa 960ggttggaatg caaaggtaga ggaccgcatt gggttctata agaggtattg tgacacactt 1020ggagttggct atggtaacaa tctcgactgc tacaaccaga gg1062<210>13<211>1063<212>DNA<213>可可树<400>13gctgagcagt gtggacggca agctggtggt gccctgtgcc ctggaggcct atgttgtagc 60caatttggtt ggtgtggcaa cactgatgac tactgcaaaa aggaaaatgg ttgccagagt 120cagtgcagcg gaagcggagg tgatactggt ggacttgata gtctgataac aagagaaagg 180tttgatcaga tgcttttgca tagaaatgat ggtggttgtc ctgctcgtgg cttctatacc 240tatgatgctt tcatagctgc tgcgaagtct ttccctgcct tcgctacaac cggtgatgat 300gccactcgca agagggaagt tgctgctttc ttggcccaaa cttctcacga aactactggt 360tagtccactt cgaaagttaa tcacaaagtt caccatgttt tgaacatgac ttcatcggtt 420tgagaattaa tttgatgatg ccgtaggtgg agcaggatgg gctgcacccg atggtccata 480tacgtgggga tactgctaca atagggaatt aaaccccgct gattactgcc agtgggatcc 540aaactaccct tgcgctcctg gtaagcaata ttttggccgg ggtccaatgc aacttacttg 600gtaagccttt caccgtttgc taatttcttt tcttgaaatg tatttaggt aaggcaaaat 660tgttttgttg acatgggaat aatcacttaa cttttgatat atcaggaact acaactatgg 720gcagtgtgga agagccattg gggtggacct attaaacaac ccagacctgc tagcaactga 780tcctacaatt tctttcaagt cagcgttctg gttctggatg actccacaat caccaaagcc 840ttcttgccac gatgtgatca ttggggcgtg gtcaccctcc ggtagcgacc aggcggcagg 900ccgggttcca gggtttggtt tgatcacaaa tattatcaat ggcggccttg aatgtggtca 960aggttggaat gcaaaggtag aggaccgcat tgggttctat aagaggtatt gtgacacact 1020tggagttggc tatggtaaca atctcgactg ctacaaccag agg 106权利要求
1．DNA检测技术在确定经过发酵的和/或烘烤的可可豆和/或巧克力中可可树的遗传物质中的用途。
2．根据权利要求1的用途，所使用的DNA检测技术选自PCR、RAPD、PFLP或微卫星鉴定。
3．根据权利要求1的用途，所使用的DNA分析技术是PCR扩增产物的序列测定。
4．根据权利要求1或2的任一条的用途，用于检测的DNA来源于可可树的5S基因。
5．根据权利要求1的用途，用于检测的DNA来源于可可树的SSP基因。
6．根据权利要求1的用途，用于检测的DNA来源于可可树的几丁质酶基因。
7．根据权利要求1的用途，用于检测的DNA来源于可可树线粒体和/或叶绿体DNA。
8．根据上述任何一项权利要求的用途，经过发酵和/或烘烤的可可豆和巧克力所来源的可可树是一个变种，该变种经过了常规育种技术或基因工程技术改造。
全文摘要
本发明涉及利用DNA检测技术从经过发酵和/或烘烤处理的可可豆和巧克力,和/或经过常规育种技术或基因工程技术改造的可可豆变种中确定可可树的品种。特别地,涉及的DNA检测技术选自PCR、RAPD、RFLP或微卫星鉴定。
文档编号C12Q1/68GK1325457SQ99812983
公开日2001年12月5日 申请日期1999年10月29日 优先权日1998年11月5日
发明者V·佩蒂尔德, D·克罗兹拉特 申请人:雀巢制品公司