一种水产诱食剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生态领域，具体涉及一种水产诱食剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 由于饲料或水产动物自身等因素的影响，投喂的饲料往往不能被迅速摄食和吸收 利用。为了提高水产动物对配合饲料的利用效率，不仅需要研究各种水产动物的营养需求， 配制适合的饲料，还需在饲料中添加能促进水产动物摄食的引诱物质（即诱食剂)。
[0003] 目前市场相关产品种类多样，但是效果不明显，以香味物质"诱人"为主。市场上 诱食剂主要分为如下几种：氨基酸类、动植物提取物、生物碱、含硫化合物、中药类、脂肪酸 等等。目前，国家已经明文规定，禁止诸如DMPT等化学诱食剂使用。因此，开发绿色、高效 的诱食剂是必要的。
[0004] 屎肠球菌制作菌粉用于水产行业已有先例，有的作为饲料添加剂，有的作为水质 改良剂，有的作为微生态改良剂，但是，作为液态制剂，直接用于水产动物诱食，尚无先例。
[0005] 水产微生态液态制剂在货架期期间，经常会产生胀气现象，产品包含的产气细菌 继续代谢，产生大量气体，使包装鼓胀。细菌继续代谢影响了产品组分的稳定性，同时，产品 打开使用时容易喷溅，严重时甚至胀破包装产生类似爆炸的巨响。查阅资料以及收集市场 产品信息可知：大部分水产微生态产品，例如：市场销售的PSB光合细菌原液、虾蟹乐宝、EM 菌等，说明书上标注"微胀气"字样，说明目前并没有效果非常明显的防胀气方法。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供一种水产诱食剂。
[0007] 本发明提供的水产诱食剂，其活性成分为屎肠球菌0? feracocciA? /aeciiM?) CGMCC No. 9134的发酵液或发酵液的上清液。
[0008] 在本发明一个实施方案中，所述的水产诱食剂还含有质量分数5-10%的海盐和/ 或质量分数〇. 1-0. 5%的黄原胶。
[0009] 其中，所述屎肠球菌CGMCC No. 9134的发酵液中的活菌数为IX 109cfu/ml以上。 [0010]其中，10_50g/L 果糖、5-50g/L 牛肉膏、10-20g/L 酵母膏、l-15g/L 硫酸镁、l-15g/L NaCl、l-15%CaC03。
[0011] 其中，发酵条件如下：温度20-401：，转速50-200印111，罐压为0.01-0.09兆帕，通风 量为 1:0. 1-1:0. 5vvm，培养 10h-24h 至活菌数为 lX109cfu/ml 以上。
[0012] 本发明屎肠球菌分离自猪肠道，并经过紫外诱变筛选获得。
[0013] 屎肠球菌 /aeci·)CGMCC No. 91；34 的特征为： (1)屎肠球菌 /aeciiM?)CGMCC No. 9134 菌液 80°C处理 5min，存活率为 0. 18%，相对出发菌株提高22倍。
[0014] (2)屎肠球菌/aeci·) CGMCC No. 9134 菌液用 0· 3% 的猪胆盐处理 3h，存活率为20. 80%，相对出发菌株提高3. 04倍。
[0015] (3)屎肠球菌/aeci·) CGMCC No. 9134 菌液用 0· 6% 的猪胆盐处理 3h，存活率为21. 6%，相对出发菌株提高27. 69倍。
[0016] 将本发明的屎肠球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所，登记号：CGMCC No. 9134。
[0017] 本发明水产诱食剂主要成分为小肽、氨基酸、有机酸及乳酸菌等，对养殖动物进食 有较强诱导作用，改善饲料的适口性，缩短吃料时间；其中，活性乳酸菌（>10 9CFU/mL)，乳酸 菌能抑制消化道中病原微生物的生长繁殖，提高养殖动物消化吸收能力，增强水产动物免 疫力。
[0018] 本发明诱食剂按比例加入一定的海盐，有效避免乳酸菌产气，使包装瓶胀气、破裂 的现象；产品按照一定比例添加黄原胶，能有效避免产品沉降，使产品能在货架期期间保持 均一稳定的性状。
【附图说明】
[0019] 图1 :屎肠球菌出发菌株的菌体形态。
[0020] 图2 :热耐受性试验。
[0021] 图3:耐胆盐试验。
[0022] 图4 :耐海盐试验。
[0023] 图5 :本发明诱食剂保藏稳定性试验。
[0024] 图6 :食丸诱捕试验统计图。
[0025] 图7 :小试拌料试验结果统计图。
[0026] 图8 :对虾肠道乳酸菌检测过程图。
[0027] 图9 :对虾肠道乳酸菌检测平板。
[0028] 图10 :对虾肠道乳酸菌含量检测统计图。
[0029] 图11 :试验塘对好日摄食量统计图。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0031] 实施例1 本发明所述的屎肠球菌选育方法，包括以下步骤： (1)生长曲线的测量：出发菌株来源于猪肠道，经鉴定为屎肠球菌，革兰氏染色，菌体 形态见图1。将其活化两次，接入500mL液体培养基（IL三角瓶）中，37°C培养，每两小时测 一次OD值。横坐标为时间，纵坐标为OD值，绘制生长曲线。同时用螺旋自动接种仪测量菌 浓度。
[0032] (2)菌悬液的制备：将出发菌活化1~2次后，接种于500mL液体培养基（1L三角 瓶)中，根据生长曲线，37°C振荡培养4-10h到对数生长期，取菌液用灭菌的生理盐水洗菌3 次，将其配制成浓度为IX 10scfu/mL菌悬液。
[0033] (3)致死率：取6个直径为6 cm的无菌培养皿，每平皿加入3~5 mL菌液。紫外 预热20-30min，在搅拌状态下，选用15-20 W的紫外灯，照射距离为28 cm，照射时间分别为 10s、20s、40s、60s、2min、4min。根据诱变时间做适当稀释，各取100μL涂平板，每个稀释 度有3个平行。将原液稀释至10 6, 10 7作为对照，每个稀释度有3个平行。避光，37°C培养 3d。计算致死率，结果见下表。
[0034] 表1紫外诱变致死率
(4)诱变选育：选择致死率在70%~85%的诱变时间，对出发菌株进行紫外诱变取2个直 径为6cm的无菌培养皿，每平皿加入3~5 mL菌液。紫外预热20~30min，在搅拌状态下，选用 15~20 W的紫外灯，照射距离为28 cm，照射时间为致死率在70%~85%的诱变时间即10 s和 20s，将诱变后的菌液接种的新鲜的液体培养基中，45°C、50°C和55°C避光培养2~3天。菌 液变浑浊后，用螺旋自动接种将其分离，挑选菌落形态与出发菌株变化较大的菌株1〇〇~300 株，对其80°C处理5min，比较突变株的存活率。将存活率较高的ΚΓ60株4°C保藏，再其进 行胆盐耐受性比较。获得1株较好的菌株。
[0035] (5)稳定性：将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，37°C，恒温培养箱培养1天，连续传 代10次，测定其热耐受和胆盐耐受性，即得。
[0036] 实施例3耐热测定 将本发明的屎肠球菌CGMCC No. 9134进行液体活化，37°C过夜，取lmL，经过80°C水浴 处理5min，稀释，取适当的稀释度进行涂布MRS平板，3个平行。以未经高温处理菌液为对 照，稀释涂布。按照公式（1)计算菌株存活率。
结果如图2所示。有图2可知，UEOl (屎肠球菌CGMCC No. 9134)存活率最高，达到 0. 18%，与出发菌株相比，提高22. 31倍。
[0038] 实施例4耐胆盐测定 将本发明的屎肠球菌CGMCC No. 9134进行液体活化，37°C过夜，取lmL，8000rpm离心 lOmin，加入ImL含有0. 3%猪胆盐的MRS培养基，37°C静置3h。稀释，取适当的稀释度进行涂 布MRS平板，3个平行。以未经处理菌液为对照，稀释涂布。按照公式（1)计算菌株存活率。 经过胆盐0. 3%处理3h，菌株结果见图3。有图3可知，将UEOl (屎肠球菌CGMCC No. 9134) 与出发菌株进行胆盐〇. 6%处理3h，检测其耐受性，其存活率分别为21. 6%和0. 78%，UEOl 较出发菌株提高了 27. 69倍。
[0039] 实施例5耐海盐测定 采用3°海盐水配置MRS，将活化好的屎肠球菌CGMCC No. 9134与出发菌株，等浓度接 种到其中，30°C培养16h，涂布计数。结果由图4可见，UEOl (屎肠球菌CGMCC No. 9134)的 活菌数达到2. 63 X 101° cfu。
[0040] 实施例6水产诱食剂的制备 1) 培养基灭菌： 培养基配方：l〇g/L果糖、50g/L牛肉膏、10g/L酵母膏、15g/L硫酸镁、15g/L NaCl、 15%CaC03〇