一种复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法
【技术领域】
[0001]本发明设及一种库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌复合发酵橡胶巧脱除氯化物的方 法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 橡胶（化?KeaArasWieftsis)大戟科乔木，高可达30米，有丰富乳汁。橡胶树是一 种典型的热带作物，原产己西；现广泛栽培于亚洲热带地区。云南河口、西双版纳、瑞丽种植 较多；广东、广西、海南、福建南部和台湾有栽培。葫果楠圆形，直径5-6厘米，有3纵沟，顶 端有瞭尖，基部略凹，外果皮薄，下后有网状脉纹，内果皮厚，木质；种子楠圆形，浅灰褐色， 有斑纹。橡胶巧是橡胶树的副产物。过去很长时间，大量的橡胶巧没有得到合理的综合利 用，被作为废弃物丢弃与橡胶林地中腐烂。橡胶巧仁含油40%-50%。在橡胶巧油的脂肪酸组 成(其含软脂酸：5%-10%，油酸：20%-28%，亚油酸：30%-42%，亚麻酸：15%-22%)中，不饱和脂 肪酸占80%W上，其中多不饱和脂肪酸占50%W上，而饱和脂肪酸仅占16. 5%-17. 5 %。 是n-3家族多不饱和脂肪酸的前体，机体摄入后可转变为DHA和EPA，DHA对脑神经生长发 育、婴儿视觉发育、儿童智能发育和抗过敏、增强免疫有至关重要的作用。EPA具有帮助降低 胆固醇和甘油Ξ醋的含量，促进体内饱和脂肪酸代谢，从而起到降低血液粘稠度，增进血液 循环，提高组织供氧而消除疲劳，二者在医药保健方面具重要价值，然而橡胶巧巧中氨基酸 含量与豆巧很相似，脱除氯化物W后可作为饲料资源使用。因此作为一种废弃物，橡胶巧有 巨大的开发价值。
[0003] 氯化物是指含氯基的化合物，植物中的氯化物是W巧形式存在的氨氯酸有机衍生 物，即使氯武本身无毒性，但当其水解释放出游离的氯化氨后，就会引起动物中毒。富含氯 武的植物有青饲料木馨、高梁和玉米的幼苗、亚麻W及菩薇科植物的叶子和种子。氯离子对 细胞线粒体内呼吸链的细胞色素氧化酶具有很高的亲和力，与细胞色素氧化酶的结合后使 之失去活性，从而阻断细胞呼吸和氧化憐酸化过程。细胞色素氧化酶是W铁化嘟为辅基的 蛋白质，含有两个血红素A基团和两个铜原子，分别为细胞色素a和曰3。a和曰3两个成分 至今未能分离，故将细胞色素a和a3合称为细胞色素氧化酶。在化学结构上，血红素a和 曰3具有一致性。近年来的研究指出，可能血红素a和曰3结合于不同的蛋白亚基上。氨氯酸 对细胞色素氧化酶的抑制作用，主要是一CSN与细胞色素a3中的铁离子（Fe3+)配位结合， 阻止其还原成化2+所造成。由于橡胶巧中含有少量的生氯葡萄糖巧，分子中含有氯基（一 CSN)，其化学性质不稳定，可被植物中的酶或稀酸水解，因此橡胶巧巧或饼使用前均须脱 〇
[0004] 1969年首次发现某些酵母可W利用甲醇为唯一碳源和能源生长，此后，用甲醇利 用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注。库氏毕赤酵母曾被用于 生产单细胞蛋白，有很好的发酵基础，其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、 氮源和碳源，廉价而无毒。魏斯氏菌属于乳酸菌，常被发现于泡菜等騰制食品中，其在卫生、 医学、发酵、食品加工等方面的作用开始受到广泛关注。微生物发酵脱除方法有单一发酵脱 毒和复合发酵脱毒，单一发酵脱毒的研究和开发较多，目前的发展趋势是研制复合发酵。复 合发酵能适应多种环境条件，达到更好的效果。
【发明内容】
[0005] 针对现有微生物复合发酵脱除氯化物的研究较少，本发明的目的在于提供一种库 氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌混合发酵橡胶巧脱除氯化物的方法。
[0006] 本发明方法具体步骤如下： (1) 将纯化后冷冻保存的库氏毕赤酵母W体积百分比的5%的比例接种于5mLYTO液体 培养基中30°C-37°C摇床培养15-2地，至有效活菌数>l〇i°CFU/mL;将纯化后冷冻保存的融 合魏斯氏菌W体积百分比的5%的接种量接种于5mLMRS液体培养基中，30°C-37°C摇床培 养15-2地，至有效活菌数>l〇i°C即/血； (2) 将活化好的库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌按菌液体积比1-2:1-2混合后，再按体 积百分比5%-10%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在20°C-37°C条件下静置培养 120-14地，发酵完成后制得脱出氯化物的发酵橡胶巧，其中发酵培养基是水和粉碎到20-60 目的橡胶巧按质量比1-2:1-2的比例混合后制得。
[0007] 上述库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌的活化中所用的液体培养基成分分别为： ①YPD液体培养基组成为酵母浸粉10.Og/l、蛋白腺20.Og/l、葡萄糖20.Og/L。
[0008] ②MRS培养基组成为蛋白腺lO.Og/l、牛肉膏lO.Og/l、酵母粉5.0g/L、巧樣酸氨 二锭2. Og/L、葡萄糖20.0 g/l、乙酸钢5. Og/L、憐酸氨二钟（K2HPO4) 2. Og/l、硫酸儀（M拆〇4) 0. 58g/L、硫酸儘（MnS〇4) 0. 25g/L、碳酸巧（CaC〇3) 10.0 g/L、吐溫-80 1. 0 血/L。
[0009] 本发明的菌株均为食源性的微生物，库氏毕赤酵母（A'cAia如可用 于酿造果酒，融合魏斯氏菌（reisseyyacon/usa)可用于酿造酱油，因此安全性可W得到保 证；其次微生物复合发酵脱毒的效果比单一发酵的效果好很多，乳酸菌产酸能抑制杂菌生 长，酵母发酵增加香味，在保证橡胶巧不变质的前提下，更有效脱除氯化物。经实验研究，该 两种菌株不同比例复合发酵对氯化物的脱除效果均很好，氯化物脱除率均在88. 9%W上。 本发明所述菌种均可W从美国模式培养物集存库（ATCC)和中国工业微生物菌种保藏管理 中屯、（CICC)购买得到，菌株号分别为ATCC-24210和CICC-23406。
【具体实施方式】
[0010] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述 内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规试剂 或按常规方法配置的试剂。
[0011] 实施例1:本库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌混合发酵橡胶巧脱除氯化物的方法， 具体操作如下： (1) 将纯化后冷冻保存的库氏毕赤酵母按体积百分比5%的比例接种于5mLYTO液体培 养基中3(TC摇床培养1她，至有效活菌数>l〇i°CFU/mL;将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌 按体积百分比5%的接种量接种于5mLMRS液体培养基中，37°C摇床培养16h，至有效活菌数 >l〇i°C即/mL; (2) 将活化好的库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌按菌液体积比1:1混合后，再按体积百 分比5%的比例