专利名称：熊果酸的医学用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种熊果酸的新用途，具体地说明就是熊果酸作为有效成份用于制备口腔卫生用品、口腔保健品及制备治疗口腔疾病的药物。
二.
背景技术：
熊果酸是一种三萜类化合物，分子式为C30H18O3，化学名称为3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸，为无色晶体，熔点289～292℃。熊果酸广泛分布于多种植物中，具有多种生物活性，但是经美国国立图书馆Medline检索，未见熊果酸有抑制口腔各种类型变形链球菌及牙周病原菌的报道。同时也未见有抑制口腔舌鳞癌细胞株的报道。
口腔龋病和牙周病是人群中的常见病和多发病，世界卫生组织将龋病列为重点防治的三大疾病之一，仅次于癌症和心血管疾病之后。我国在近年来的流行病学调查中，也发现在中国青少年和成人中，每两人就有一人曾经或正在患有龋病。目前龋病的严重程度不容忽视。近几十年的研究已经证实，龋病为细菌感染性疾病，主要致龋菌是变形链球菌；根据变形链球菌细胞壁抗原成分的差异，可将其分为a-h8个血清型，各型链球菌之间具有同源性，因此可将变形链球菌视为变形链球菌组。
牙周病是另一种口腔常见病，随着病变进展，逐渐发生牙龈出血，牙周袋形成，牙齿松动甚至脱落，对人们的生活质量影响极大。牙周病也是细菌感染性疾病，牙周病的发生发展主要是微生物与宿主相互作用的结果，菌斑细菌是牙周病的始动因子，对微生物的有效控制是控制牙周疾病进展的最有效方式。特异性菌斑假说认为牙菌斑并不是均质的细菌团块。某些优势菌群及毒素常常与疾病的破坏程度有密切关系。Papapanou等利用“棋盘法”DNA杂交技术对部分中国人群进行微生物流行病学调查，结果发现菌斑内牙龈卟啉菌(P.gingivalis)、福赛氏类杆菌(B.forsythus)等细菌的量超过某个阈值的人群易患进展性牙周炎和具有深牙周袋。1996年召开的世界牙周病研讨会上，认为证据充分的牙周病原菌包括牙龈卟啉菌和福赛类杆菌等；中等证据的牙周病原菌包括中间普氏菌等。
如何找到一种良好的预防这两种疾病的途径，一直是口腔医学领域中研究的热点和重点之一。
三.
发明内容
我们在探索将女贞用于治疗口腔炎和牙周炎的研究中，发现其中主要起作用的成分是熊果酸。这一结果为开发女贞，特别是其主要成份-熊果酸在医学上的新用途提供了可能。
在此基础上，对熊果酸的药理作用作了进一步研究1.熊果酸对变形链球菌组及牙周病原菌作用试验，该试验以目前效果最为肯定的牙膏抗菌剂Triclosan(2，2，4’-三氯-2’羟二苯醚)作为阳性对照药。结果见表1、2。
表1熊果酸对部分牙周菌的最小抑菌浓度(MIC)菌株 熊果酸 TriclosanMIC MICP.gingivalis 73.75μg/l 50P.intemedia73.75μg/l 10B.forsythus73.75μg/l表2熊果酸对变形链球菌组的抑菌效果菌株 血清型熊果酸的MIC Triclosan(μg/ml) 的MIC(μg/ml)仓鼠链球菌AHT a9.7654.88鼠链球菌BHT b19 2.44变形链球菌MT8148c39 4.88变形链球菌OMZ65 g39 2.44变形链球菌OMZ175f19 4.88变形链球菌OMZ176d9.7659.765变形链球菌G8-5M0e9.7 4.88茸毛链球菌6715 g19.534.88道勒链球菌Mfe28 h19.532.14格登氏链球菌 19.534.88
熊果酸对部分牙周菌的MIC结果表明熊果酸对牙龈卟啉菌、中间型普氏菌、福赛氏类杆菌的MIC为73.75μg/l，最小杀菌浓度为295μg/l。
2.抗口腔舌癌细胞株TSCCa的实验结果(1)噻唑蓝比色法(MTT)结果熊果酸作用于TSCCa细胞株24小时，半致死量IC50为8μmol/l。25μmol/l和12.5μmol/l的熊果酸与TSCCa细胞株共同孵育24小时，与正常对照组相比，光镜下可见细胞生长明显受到抑制，而6.25μmol/l的熊果酸则未见明显改变。
熊果酸与TSCCa细胞作用48小时的IC50值为8μmol/l。
(2)电镜结果透射电镜下可见未处理TSCCa细胞(Control)表面微绒毛丰富，细胞连接明显，微管微丝清晰可见，核染色质均匀；12.5μmol/l的熊果酸处理24小时后，可见核染色质边集；25μmol/l熊果酸处理24小时后，在未处理的TSCCa细胞中可见散在细胞坏死，坏死细胞外形发生不规则变化，细胞膜破裂，细胞器结构破坏。
上述药理试验结果表明熊果酸对杀灭和抑制变形链球菌组及牙周病原菌、口腔舌癌细胞(TSCCa株)具有明显的效果，因此，可作为有效成份用于制备口腔卫生用品、口腔保健品及制备治疗口腔疾病的药物。
熊果酸的这种新用途不仅充分利用了丰富的植物资源、开拓了利用这些植物资源药用价值的新领域，也为口腔保健和口腔疾病的治疗提供了新途径，因此，具有重要的医学价值和社会、经济效益。
具体实施例方式
熊果酸对变形链球菌组及牙周病原菌作用试验(1)材料与方法1)菌株福赛氏类杆菌(B.forsythus Bf)ATCC43037牙龈卟啉菌(P.gingivalis pg)ATCC33277中间型普氏菌(P.intermedia Pi)ATCC25611仓鼠链球菌AHT血清型a鼠链球菌BHT血清型b变形链球菌MT8148血清型c变形链球菌OMZ65血清型g
变形链球菌OMZl75血清型f变形链球菌OMZ176血清型d变形链球菌G8-5M0血清型e茸毛链球菌6715血清型g道勒链球菌Mfe28血清型h格登氏链球菌2、试剂和仪器氯化血红素Haenatin hydrochloride中国科学院上海生物研究所维生素K1注射剂江苏泗阳制药厂96孔培养板8道移液器胰酪大豆液体培养基Trypticase-soy broth(TSB)中国药品生物制品检定所胰酪大豆琼脂培养基Trypticase-soy agar(TSA)中国药品生物制品检定所酶标免疫分析仪ELX 808 Ultra Microplate Reader Bio-Tek instruments，inc3、试剂的配制氯化血红素(0.5％)50mg氯化血红素溶解于1ml 1mol/l NaOH中，然后加蒸馏水100ml，121℃15min灭菌。
氯化血红素-维生素K1溶液0.5％氯化血红素溶液100ml中加入一支维生素K1注射液(10mg/ml)，4℃保存。
TS血平皿的制备称取4.4gTSA培养基，溶于100ml蒸馏水中，121℃15min灭菌，待冷却至50℃左右，加入无菌脱纤维羊血5ml，混合后倾注于平皿备用。
TSAHK血平皿的制备称取4.4gTSA培养基，溶于100ml蒸馏水中，121℃15min灭菌，待冷却至50℃左右，加入氯化血红素-维生素K1溶液1ml，无菌脱纤维羊血5ml，混匀后倾注平皿备用。
TS肉汤的制备称取3gTSB培养基，溶于100ml蒸馏水中，121℃15min灭菌。
TSHK肉汤的制备称取3gTSB培养基，溶于100ml蒸馏水中，121℃15min灭菌，待冷却至50℃左右，加入氯化血红素-维生素K1溶液1ml，混匀后分装保存。
以上血平皿及肉汤需在使用前新鲜配制或预还原过夜后使用。
1、细菌悬液的制备1)将Bf划线培养于TSA平皿上，Pg、Pi划线培养于TSAHK平皿上，37℃80％N210％H210％CO2培养24h。。
2)挑取4-5个菌落(1mm左右)，分别培养于3.5mlTSB(Bf)或TSBHK(Pg、Pi)中，37℃ 80％N210％H210％CO2培养8h，将变形链球菌组的各菌培养于TS培养基中，培养过夜，用无菌TSB(Bf)或TSBHK(Pg、Pi)分别调整各菌菌液浓度至0.5号麦氏比浊管，在预实验中已证实0.5号麦氏比浊管代表的菌液浓度约为106CFU/ml。
药液的制备精密称取熊果酸10mg，溶于10ml无水乙醇中，用滤器过滤，-20℃分装保存。临用前加入等量2xTSB(Bf)或2xTSBHK(Pg、Pi)。精密称取Triclosan 10mg，溶于10ml无水乙醇中，用滤器过滤，-20℃分装保存。临用前加入等量2xTSB(Bf和变形链球菌组)或2xTSBHK(Pg、Pi)。
2、最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration MIC)的测定在96孔板第一列加入待测药物肉汤100μl，然后加入100μl TSB(Bf和变形链球菌组)或TSBHK(Pg、Pi)到所有各孔，8道移液器倍比稀释至第11列，第12列为空白对照；同时设立溶剂对照和阳性对照药Triclosan对照，重复两行，加入已调整好的菌液，37℃ 80％N210％H210％CO2培养48h。
3、酶标免疫分析仪在OD630处读数，MIC值为OD值突然升高前的临界值。
试验结果见表1、表2。
抗口腔舌癌细胞株TSCCa株的实验1材料(1)试剂1、RPMI-1640(Gibco USA)2、胰蛋白酶(Gibco USA)3、小牛血清(Gibco USA)4、青霉素(华北制药厂)5、链霉素(华北制药厂)6、噻唑蓝(MTT)7、二甲基亚砜(DMSO)(2)仪器1、二氧化碳培养箱(Precision，USA)
2、倒置光学显微镜(Nikon，Japan)3、YJ-87.5s超净工作台(苏州净化设备厂)4、酶联免疫检测仪5、96孔细胞培养板(costar)6、8道可调移液器7、一次性滤器8、细胞记数板9、Hitachi H-600透射电镜日本东京(3)细胞株人舌鳞癌细胞系TSCCa由武汉大学口腔医学院颌面外科金辉喜博士建立(4)药物的配制将药品融于DMSO中，过滤除菌-20℃保存。2实验方法(1)、TSCCa细胞培养在RPMI 1640+10％小牛血清培养液中，于37℃，5％CO2下培养(2)、细胞生长至80％融合后，0.25％胰蛋白酶消化细胞，用RPMI 1640+10％小牛血清培养液配成单个细胞悬液，以103-104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl，接种三块。
(3)、将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养至80％融合。
(4)、取出培养板，吸出旧培养液加入RPMI 1640+10％小牛血清培养液200μl/孔，第一列加入含有药物的RPMI 1640+10％小牛血清培养液100μl，倍比稀释至第11列，弃去100μl培养液，第12列为空白对照以含DMSO的RPMI 1640+10％小牛血清培养液为溶剂对照，平行3次。
(5)、将培养板移入CO2培养箱中，分别于24h、48h取出培养液，用RPMI1640+10％小牛血清洗涤二遍，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150ml DMSO，振荡10min。
(6)、比色在490nm波长下，酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值，记录结果。结果以抑制率表示 (7)、透射电镜观察取三瓶融合期的TSCCa细胞，分别加入25μmol/l、12.5μmol/l的熊果酸溶液，设立空白对照。药物作用24h后，倾出培养液，0.01MPBS洗涤三次；用细胞刮子刮下细胞，混悬于0.01MPBS，离心2000rpm×15min；小心吸出上清，加入预冷的2.5％的戊二醛溶液4ml，1000rpm×10min，4℃保存。0.1mol/l磷酸缓冲液洗一次，1％锇酸后固定60min，常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋、超薄切片、铀铅染色；H-600电镜观察。
抗口腔舌癌细胞株TSCCa的实验结果1、MTT结果24h MTT结果可见熊果酸作用于TSCCa细胞株24小时，IC50为8μmol/l。25μmol/l和12.5μmol/l的熊果酸与TSCCa细胞株共同孵育24小时，与正常对照组相比，光镜下可见细胞生长明显受到抑制，而6.25μmol/l的熊果酸则未见明显改变。
48h MTT结果可见熊果酸与TSCCa细胞作用48小时的IC50值为8μmol/l。
2、电镜结果透射电镜下可见未处理TSCCa细胞(Control)表面微绒毛丰富，细胞连接明显，微管微丝清晰可见，核染色质均匀；12.5μmol/l熊果酸处理24小时后，可见核染色质边集；25μmol/l熊果酸处理24小时后，在未处理的TSCCa细胞中可见散在细胞坏死，坏死细胞外形发生不规则变化，细胞膜破裂，细胞器结构破坏。
上述试验结果表明熊果酸对杀死和抑制对变形链球菌组及牙周病原菌、口腔舌癌细胞具有明显的效果，因此，可作为有效成份用于制备口腔卫生用品、口腔保健品及制备治疗口腔疾病的药物。
权利要求
1.熊果酸作为有效成份用于制备口腔卫生用品、口腔保健品及制备用于治疗口腔疾病的药物。
全文摘要
本发明公开了熊果酸在医学上的一种新用途。熊果酸广泛分布于植物界中,来源丰富,具有多种生物活性,对杀灭和抑制变形链球菌组及牙周病原菌、口腔舌癌细胞具有明显的效果,因此,可作为有效成份用于制备口腔卫生用品、口腔保健品及制备治疗口腔疾病的药物。熊果酸的这种新用途不仅充分利用了丰富的植物资源、开拓了利用这些植物资源药用价值的新领域,也为口腔保健和口腔疾病的治疗提供了新途径,因此,具有重要的医学价值和社会、经济效益。
文档编号A61P1/02GK1357311SQ0113833
公开日2002年7月10日 申请日期2001年12月20日 优先权日2001年12月20日
发明者樊明文, 边专, 王茜 申请人:武汉大学