专利名称：藻酸盐对胃蛋白酶的抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及藻酸盐抑制酶的用途。具体地讲，本发明涉及某些种类的藻酸盐抑制蛋白分解酶的用途。
胃内容物反流入食管会损伤食管的鳞状上皮，而且易使食管粘膜发生巴雷特(Barrett)食管和食管癌。胃反流物中的腐蚀物主要是胃蛋白酶和盐酸。盐酸可被碳酸氢钠迅速中和，而胃蛋白酶可在pH值高达5的环境中仍具有活性，且只有在pH值高于7时才会受到不可逆的抑制。胃蛋白酶是一种蛋白分解酶，它能催化使某些氨基酸间的肽键断裂。因而，胃蛋白酶会对食管造成持续性的损伤。
过去，解决反流性食管炎问题的一个方法是，服用一种与胃酸接触时可产生充有二氧化碳的胶状泡沫或泡筏的制剂，这些泡沫或泡筏漂浮在胃内容物表面。发生反流时，这些泡筏先于胃内容物进入食管，于是保护食管粘膜免受进一步刺激。已知的这类制剂包括含藻酸、碳酸氢钠和抗酸剂的粉剂或片剂等固体制剂，或者以GAVISCON(TM Reckitt & Colman Products Ltd)为商品名销售的含藻酸钠、碳酸氢钠和碳酸钙的液体制剂。在我们的英国专利No.1524740中描述了这类液体制剂。
除了防止食管受到物理损伤，还需抑制胃蛋白酶和/或胃液的活性，从而使食管受到的损伤减少到最小。
现在我们发现某些藻酸盐比其他藻酸盐能更好地抑制胃蛋白酶和/或胃液的活性。
为此，本发明提供了分子量低于400,000的藻酸盐在制备能抑制哺乳动物胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的药物组合物中的用途。
藻酸盐是由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸残基组成的多糖醛酸混合物，而且可从已知的褐藻类(Phaeophycae)中获得。藻酸盐最有用的特性之一是它们能在低浓度下形成粘性溶液。
本文中的术语“藻酸盐”包括藻酸、藻酸的盐(藻酸盐)、藻酸的衍生物如丙二醇等酯类，以及它们的混合物。
所提到的分子量是重均分子量。
优选一价的藻酸盐，例如钠盐、钾盐、或铵盐，最优选钠盐。可以理解本发明所用的藻酸钠可含有少量的其他藻酸盐，例如达约10％重量的钙盐或钾盐。这些藻酸盐可由FMC Biopolymers AS提供，例如，Protanal H120L和Protanal LF120。
下表1列出了由FMC Biopolymers AS提供的某些藻酸钠的一般性质。
表1FMC Biopolymers AS提供的藻酸钠的一般性质
优选分子量低于380,000的藻酸盐，更优选分子量低于365,000的藻酸盐，最优选分子量低于350,000的藻酸盐。
藻酸盐分子量优选大于30,000。优选分子量大于40,000的藻酸盐，更优选分子量大于60,000的藻酸盐，最优选分子量大于75,000的藻酸盐。
应当注意，上述限定的任何藻酸盐均可任意组合，本文在此明确公开了这些限定的所有组合。
在本发明的优选实施方式中，藻酸盐选自Protanal SF120、ProtanalSF/LF、Protanal LF10L、Protanal LF120和Protanal SF60。
胃蛋白酶可以是任意胃蛋白酶，例如，猪胃蛋白酶、马胃蛋白酶、鼠胃蛋白酶、绵羊胃蛋白酶、牛胃蛋白酶或人胃蛋白酶。优选人胃蛋白酶。
蛋白分解酶活性的定义是指将生物材料分解为较简单的物质，如蛋白质分解为小分子的蛋白质和/或氨基酸。
胃液的定义是，含有水、盐酸(HCl)、包括NaCl、KCl、CaCl2、Ca3(PO4)2、FePO4和Mg3(PO4)2的一种或多种盐以及包括胃蛋白酶的多种酶的物质。胃液存在于任何哺乳动物包括人的胃和肠道中。
优选1％重量分数的藻酸盐的水溶液，在20℃下用Brookfield RVT粘度计采用3号锭子在20r.p.m.下测得的该溶液的粘度小于600mPa.s。
更优选藻酸盐的粘度小于550mPa.s，最优选小于500mPa.s。
本发明基于这样一个出人意料的发现，即通过对藻酸盐的选择，其表现出对胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的突出的抑制作用。具体地说，用N-端基分析法检测发现，分子量为40,000-350,000的藻酸盐对胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性有突出的抑制作用，且该抑制作用增加了50％以上。
为此，本发明进一步提供了藻酸盐在抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性方面的用途，其中，所述藻酸盐的分子量小于400,000。
根据本发明的另一个实施方式，本发明还提供了藻酸盐在制备保护食管不致发生由胃蛋白酶引起的疾病或损伤的药物组合物中的用途。
根据本发明的另一个实施方式，本发明在制备保护食管不致发生由胃蛋白酶引起的疾病或损伤的药物时，采用了源自昆布属植物(Laminaria)或Lessonia属植物的藻酸钠，其中，源自昆布属植物的藻酸钠的古洛糖醛酸基链段长度大于14.0，源自Lessonia属植物的藻酸钠的古洛糖醛酸基链段长度至少为7.0，优选至少为6.9。
具体而言，使用上述藻酸钠可治疗或预防巴雷特食管、食管癌或由胃蛋白酶引起的胃内容物返流损伤。
本发明在这方面采用的来自昆布属植物的藻酸钠，其古洛糖醛酸基链段长度大于14.0。本发明优选来自昆布属植物的由FMC Biopolymer A/S生产的LFR 5/60、SF 120、SF/LF和SF 200级别的藻酸钠，最优选SF 200级别的藻酸钠。表1列出了该级别藻酸钠的例子的其他特性。
本发明中该用途的来自昆布属植物的藻酸钠其古洛糖醛酸基的分数优选地至少为0.64，更优选0.68以上。
本发明所用的来自Lessonia属植物的藻酸钠优选为SF 60、H120L和LF120L级别的。表1列出了该级别藻酸钠的例子的其他特性。
优选的来自Lessonia的藻酸钠的古洛糖醛酸基分数至少为0.44。
本发明的范围还包括一种保护食管不致发生由胃蛋白酶引起的食管疾病或损伤的方法，该方法包括给患者施用口服有效剂量的藻酸盐，该藻酸盐的分子量为小于400,000。
本发明的范围还包括一种保护食管不致发生由胃蛋白酶引起的食管疾病或损伤的方法，该方法包括给患者施用口服有效剂量的源自昆布属植物或Lessonia属植物的藻酸钠，其中，源自昆布属植物的藻酸钠的古洛糖醛酸基链段长度大于14.0，源自Lessonia属植物的藻酸钠的古洛糖醛酸基链段长度至少为7.0，优选至少为6.9。
本发明所用的藻酸钠可作为药物组合物施用，可将该药物组合物配制成可口的制剂，且该制剂可与胃酸反应而在胃内容物之上形成泡筏。
本发明所用的这种药物组合物可以是与水混合的干粉剂。容易注意到，与该干粉混合的水量的选择应当是，在混合后可得到可口的液体制剂。然而在本发明的一个优选实施方式中，该组合物为液体形式。
在液体形式的药物组合物制剂中，藻酸钠的含量优选为重量体积比从0.1到12.0％，优选4.0到11.0％。该液体配方可为散剂，或可以按单位剂量的形式包装为小袋。
本发明所用的组合物还优选包括一种悬浮剂。适当的悬浮剂包括角叉胶、hypromellose、黄芪胶、果胶、土豆淀粉预凝胶、淀粉羟乙酸钠、卡波姆(carbomer)、黄原胶或其混合物。卡波姆是丙烯酸与蔗糖的丙烯基酯或季戊四醇交联而成的合成高聚物。可得到的适当级别的商品卡波姆包括Carbopol934P或Carbopol 974(BF Goodrich)。
对于在液体制品中的应用，必须在将卡波姆预分散于水中之后对其进行中和。优选的中和剂为氢氧化钠。卡波姆的浓度指卡波姆占中和之前的物质总量的分数。
悬浮剂及其浓度的选择依赖于组合物中所用的藻酸钠的量及其级别，还依赖于所用的辅助难溶成分的含量及其种类。优选的悬浮剂为卡波姆。悬浮剂的浓度优选为0.1到1％w/v，最优选0.1到0.5％w/v。
本发明的组合物优选进一步含有二价或三价金属离子源，以增加在胃里形成的泡筏的强度。优选当该组合物到达胃里时可产生这些金属离子，但不能在到达胃之前产生，否则该组合物就会过早地形成凝胶。适当的金属离子为铝离子，优选为钙离子。最优选该组合物含有钙离子。
因此，本发明所用的组合物优选地进一步含有0.1到5％w/v的钙离子，最优选0.5到3％w/v的碳酸钙。
本发明的组合物可进一步含有防腐剂来防止被微生物污染及随后的变质。适当的防腐剂的例子为对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯及其盐，优选将例如对羟基苯甲酸甲酯和丙酯或对羟基苯甲酸乙酯和丁酯结合使用。
防腐剂的浓度优选为0.01到0.5％w/v。
本发明的组合物还可包括一种或多种下列成分，色素、甜味剂、香味剂或pH调节剂。
当本发明的组合物需要缓释时，该组合物还含有适于在胃里持续给药的活性成分。
当本发明的组合物用作定向释放的组合物时，该组合物还含有适合于专门在胃里释放的活性成分，如局部抗菌剂。
本发明的范围还包括一种药物组合物，该药物组合物包括至少两种，优选至少3种不同级别的藻酸盐，至少其中一种的分子量小于400,000，优选从40,000到350,000，更优选100,000到300,000，最优选200,000到255,000。
优选至少一种藻酸盐的甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的MG之比不大于0.6∶1，例如Protanal SF120、Protanal SF/LF40和Protanal SF200。
替代地，或与上述藻酸盐相结合，优选至少一种藻酸盐的MG之比至少为1，例如Protanal LF120L、Protanal SF60L和Protanal H120L。
同样地，根据本发明这一方面的组合物具有阻碍胃蛋白酶活性的特点，且当其中MG之比不大于0.6∶1时，能形成很有用的牢固的泡筏，和/或当其中MG之比至少为1时，具有突出的粘膜吸附性。
在这一方面，申请人参考了国际专利公开No.WO98/48814，本文引用了其中的内容作为参考。
本发明的组合物可用任何制备该类组合物的常规方法制备。
在本发明的优选实施方式中，所有提到的％重量均指％w/v(重量/体积)。
本文所述的任一发明或实施方式的任一方面的任一特点，均可与本文所述的其他发明或实施方式的任一方面的任一特点相结合。
本发明将参照下述实施例及
图1到4进行进一步的说明图1显示了0.5mg不同分子量的藻酸钠对2.0μg猪胃蛋白酶A的抑制率；图2显示了0.5mg不同分子量的藻酸钠对4.0μg猪胃蛋白酶A的抑制率；图3显示了粘度(溶液的1％重量分数)mPa.s与不同分子量的藻酸钠对2.0μg猪胃蛋白酶A的抑制率的关系；和图4显示了粘度(溶液的1％重量分数)mPa.s与不同分子量的藻酸钠对4.0μg猪胃蛋白酶A的抑制率的关系。
蛋白分解活性的评估方法一种灵敏而准确的方法是，通过测定肽键水解时在肽键上形成的新的N-端基三硝基-苯醚化衍生物来评估蛋白分解活性。通过采用琥珀酰白蛋白作为蛋白基质提高了这种测定方法的灵敏性，所述的蛋白基质中白蛋白上的原本存在的氨基被封闭了。该方法可测定胃液中的胃蛋白酶的活性。溶液的制备琥珀酰白蛋白基质将20g牛血清蛋白(ICN，Cedarwood，Basingstroke)溶解在200ml pH7.5的磷酸盐缓冲液中。然后缓慢加入2.8g琥珀酸酐，同时通过滴加2M的氢氧化钠(NaOH)保持pH在7.5。4℃下用去离子水彻底透析所得溶液，冻干并在-18℃下贮藏。需要时，制成8.0mg/ml的溶于0.01M盐酸(HCl)的溶液，并滴加1M HCl直到溶液澄清，然后用1M的NaOH调节pH到2.2。藻酸盐的制备用去离子水制备新鲜的5mg/ml的所需藻酸盐(FMC Biopolymer，Drammen，Norway)的溶液，并由该溶液制得2.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml的稀释液。猪胃蛋白酶A的制备每次分析前制备溶解于0.01M盐酸(HCl)(BDH)中的浓度为0.04mg/ml的新鲜的猪胃蛋白酶A(SIGMA Chemicals，Poole，Dorset)溶液。TNBS的制备将1.5ml 5％也即1M的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)水溶液与20mg的活性炭(BDH)混合，在室温下放置10分钟，然后在5000rpm离心下10分钟。用0.2μm的注射过滤器过滤上清液。该过程除去了TNBS的某些活性化合物和所有的活性炭颗粒，从而使吸光率的读数更为准确。然后用去离子水将1.1ml所得溶液稀释到1∶100。N-端基分析法采用N-端基分析法(Lin等，1969，Hutton等，1986和1990)定量分析胃蛋白酶的活性。采用琥珀酰白蛋白基质和猪胃蛋白酶A作为标准物，其对0.1μl的胃蛋白酶很灵敏。在该比色分析法中，N-端基被三苯基化，随后得到了黄色的络合物。采用0.01M HCl制备0-200μl的胃蛋白酶溶液，并由此得到标准曲线。采用0.01M HCl制备0、50和100μl的试样胃蛋白酶溶液，向该测试溶液中加入所需浓度的100μl藻酸盐。所得到的值每5个分为一组。向每一试管中加入500μl的琥珀酰白蛋白溶液，搅拌使混合并在37℃下孵育30分钟。加入500μl 4％(w/v)新制备的碳酸氢钠(NaHCO3)并搅拌该试管，胃蛋白酶的活性受到了抑制。加入500μl TNBS溶液，并在50℃下孵育10分钟，新形成的N-端基发生了颜色变化。向每一试管加入500μl 10％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)(BDH)，以阻止蛋白质沉淀，随后加入250μl 1.0M的HCl，以阻止颜色的进一步变化。将该试管在室温下放置1小时使其沉淀。在340nm下测定相对于去离子水的吸光率，并通过与50μl(2.0μg)和100μl(4.0μg)胃蛋白酶的标准曲线对比得出胃蛋白酶活性的抑制率。
表2列出了分析结果。
表22.0μg猪胃蛋白酶A的抑制率
图1对0.50mg的分析结果作了进一步图解，该图清楚地显示出倒置的U形曲线，它说明了藻酸盐抑制胃蛋白酶的能力随其分子量的变化趋势。
图2用粘度代替上述分子量，所得曲线也表现为同样的趋势。
结果如下表3所示。
表34.0μg猪胃蛋白酶A的抑制率
图3对0.50mg的分析结果作了进一步图解，该图清楚地显示出倒置的U形曲线，它说明了藻酸盐抑制胃蛋白酶的能力随其分子量的变化趋势。
图4用粘度代替上述分子量，所得曲线也表现为同样的趋势。
分析结果如下表4所示。
表4藻酸盐H120L、SF200和LF120L对两种体积的胃液的抑制率
实施例4按下述步骤制备具有如下配方的组合物藻酸钠LFR 5/60100g碳酸氢钠 26g碳酸钙32g磷酸二氢钾0.6g磷酸氢二钾5.4g对羟基苯甲酸乙酯 2g对羟基苯甲酸丁酯 0.2g糖精钠1g香味剂0.7g去离子水 加至1升1.将917ml去离子水加入一搅拌容器并冷却至约20℃。
2.加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾并搅拌直到溶解。
3.向该混合物中加入防腐剂、碳酸盐和甜味剂并搅拌5分钟。
4.在3分钟内边搅拌边加入藻酸盐。
5.搅拌该混合物30分钟(10分钟后加入香味剂)。6.制备过程中控制温度在22℃(±5℃)。
实施例5 6 7 8 9藻酸钠LF120 20g 75g20g75g25g藻酸钠LFR5/6070g 25g70g25g70g藻酸钠SF120 10g - 10g- 5g碳酸氢钠 26g 26g26g16g20g碳酸钙 32g 16g60g32g32g磷酸钾 0.6g0.6g 0.6g 0.6g 0.6g磷酸氢二钾 5.4g5.4g 5.4g 5.4g 5.4g对羟基苯甲酸乙酯 2.0g2.0g 2.0g 2.0g 2.0g对羟基苯甲酸丁酯 0.2g0.2g 0.2g 0.2g 0.2g糖精钠 1.0g1.0g 1.0g 1.0g 1.0g香味剂 0.7g0.7g 0.7g 0.7g 0.7g去离子水 1升 1升1升1升1升
权利要求
1.藻酸盐在抑制哺乳动物胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的药物组合物制备中的应用，所述藻酸盐的分子量低于400,000。
2.权利要求1的应用，其中的藻酸盐为藻酸的一价盐。
3.权利要求2的应用，其中的藻酸盐为藻酸钠。
4.权利要求1到3任一项的应用，其中的藻酸盐的分子量低于380,000。
5.权利要求1到4任一项的应用，其中的藻酸盐的分子量高于30,000。
6.权利要求1到5任一项的应用，其中的藻酸盐的分子量为40,000到350,000。
7.权利要求1到6任一项的应用，其中的胃蛋白酶是猪胃蛋白酶、马胃蛋白酶、鼠胃蛋白酶、绵羊胃蛋白酶、牛胃蛋白酶或人胃蛋白酶。
8.权利要求1到7任一项的应用，其中藻酸盐的1％重量分数的水溶液在20℃用Brookfield RVT粘度计采用3号锭子在20r.p.m.下测定所得的粘度小于600mPa.s。
9.权利要求8的应用，其中藻酸盐的粘度小于550mPa.s。
10.藻酸盐抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的应用，其中藻酸盐的分子量低于400,000。
11.藻酸盐在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物可保护食管不致发生由胃蛋白酶引起的疾病或损伤。
12.权利要求11的应用，该应用可治疗或防止巴雷特食管或食管癌。
13.上述权利要求中任一项的应用，其中的藻酸钠以液体形式的药物制剂提供。
14.权利要求13的应用，其中的液体药物制剂按单位剂量形式包装为单独的小袋。
15.一种保护食管不发生由胃蛋白酶引起的疾病或损伤的方法，所述方法包括给患者施用口服有效剂量的分子量低于400,000的藻酸盐。
16.一种包括至少三种不同级别的藻酸盐的药物组合物，其中至少一种藻酸盐的分子量小于400,000，优选从40,000到350,000，更优选100,000到300,000，最优选200,000到255,000，以及至少一种藻酸盐的甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的MG之比不大于0.6∶1，以及至少一种藻酸盐的MG之比至少为1。
17.根据本发明的藻酸盐在药物组合物的制备中的应用，该应用基本上如说明书所述或所例举的。
18.根据本发明的藻酸盐在抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性中的应用，该应用基本上如说明书所述或所例举的。
19.一种保护食管不发生由胃蛋白酶引起的疾病或损伤的方法，该方法基本上如说明书所述或所例举的。
20.权利要求16的药物组合物，该组合物基本上如说明书所述或所例举的。
全文摘要
某些藻酸盐表现出优异的抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的能力。具体地说，用N－端基分析测定发现，分子量为40,000到350,000的藻酸盐表现出优异的抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的能力，该抑制能力增加了50％以上。
文档编号A61P1/04GK1430517SQ01809779
公开日2003年7月16日 申请日期2001年5月17日 优先权日2000年5月19日
发明者彼得·威廉姆·德埃忒玛, 弗兰克·C·汉普森, 安德鲁·迈克尔·森德兰, 杰弗里·彼得·皮尔森 申请人:雷克特本克斯尔保健(英国)有限公司